王 恒，李夢(mèng)奇，李燊星，史精干，黃 莉，程索婷，鄒純才，鄢海燕

皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 蕪湖241002

氟尿嘧啶（5-Fu）作為一種細(xì)胞毒性化療藥物，是消化道腫瘤和乳腺癌治療的基礎(chǔ)藥物。然而5-Fu的耐藥性與全身毒性特別是肝損傷極大限制了其使用，在提高晚期肝細(xì)胞癌患者的生存率方面有限［1］。研究證明，5-Fu引起的肝損傷有多種機(jī)制，可能與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及肝細(xì)胞凋亡有關(guān)［2,3］?；钚匝酰≧OS）的積累和炎癥與許多不同器官的疾病產(chǎn)生有密切關(guān)系，抑制ROS的產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)可以有效改善小鼠的肝細(xì)胞凋亡，另外肝臟中ROS的產(chǎn)生減少可以改善肝臟纖維化［4,5］。中藥在減緩化學(xué)藥物誘導(dǎo)的肝損傷方面具有極大的潛力，特別是一些具有抗氧化和抗炎活性的中藥已被證實(shí)對(duì)5-Fu誘導(dǎo)的肝損傷顯示出良好的保護(hù)作用。隨著癌癥患者的增多和化療的進(jìn)行，5-Fu所誘導(dǎo)肝損傷的病例也逐漸增多，導(dǎo)致患者化療效果差。因此，尋找高效安全且低毒的藥物緩解抗腫瘤藥物的毒副作用至關(guān)重要。

決明子為豆科植物決明Cassia obtusifolia L.或小決明C.tora L.的成熟干燥種子，具有清熱明目、潤(rùn)腸通便、抗氧化、降血脂等功效［6,7］，蒽醌類成分是決明子中的主要活性成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、保肝等藥理作用［8］。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，決明子總蒽醌對(duì)免疫性肝損傷、脂多糖誘導(dǎo)的肝損傷及四氯化碳致肝損傷等多種肝損傷均具有較好的保護(hù)作用，且其機(jī)制多與氧化應(yīng)激及炎癥有關(guān)［9-11］，但哪些成分發(fā)揮作用尚未見(jiàn)相關(guān)研究。課題組前期研究結(jié)果表明，決明子總蒽醌提取物具有較好的體外抗氧化活性。中藥譜效關(guān)系是在中藥指紋圖譜的基礎(chǔ)上，將中藥物質(zhì)群中的化學(xué)成分與藥效相聯(lián)合，通過(guò)線性或非線性的數(shù)學(xué)處理，建立“譜-效”模型，確定中藥的藥效成分群［12,13］。為此，鑒于5-Fu在化療中的普遍應(yīng)用性與其臨床應(yīng)用中伴隨的肝臟毒性，但未見(jiàn)有關(guān)于決明子總蒽醌提取物對(duì)氟尿嘧啶致小鼠肝損傷的保護(hù)作用研究，也未見(jiàn)其發(fā)揮保肝作用的藥效成分或藥效成分群的文獻(xiàn)報(bào)道，本研究擬基于決明子總蒽醌抗肝損傷與氧化應(yīng)激的相關(guān)性，研究決明子總蒽醌提取物抗氟尿嘧啶致小鼠肝損傷的譜效關(guān)系，為后期決明子總蒽醌提取物在預(yù)防或治療肝損傷方面的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種雄生小鼠72只，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，許可證號(hào)：SCXK（魯）2019-0003。實(shí)驗(yàn)中所用動(dòng)物經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（LLSC-2022-036）。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。

1.2 試藥

決明子（清炒品，北京同仁堂誠(chéng)安藥材有限公司）。決明子總蒽醌提取物由本課題組制備，制備工藝：以20倍量的60%乙醇-乙酸乙酯（2∶1）回流提取3次，15 min/次，濃縮干燥，即得。聯(lián)苯雙酯滴丸（萬(wàn)邦德制藥集團(tuán)有限公司）；氟尿嘧啶（山東西亞化學(xué)股份有限公司，純度≥99%），溶解于磷酸鹽緩沖液備用；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、蛋白定量（TP）、超氧化物歧化酶（SOD）、髓過(guò)氧化物酶（MPO）和總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒（南京建成生物）。

1.3 儀器

Multiskan Go全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司）；JW-3021HR高速冷凍離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；FA2004B電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；KNT-II-20分析型超純水機(jī)（合肥科寧特水處理設(shè)備有限公司）；UV-5100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）等。

1.4 溶液的制備

1.4.1 決明子總蒽醌提取物溶液的制備 取決明子提取物10批，0.2 g/批，精密稱定，置于100 mL圓底燒瓶中，加入稀鹽酸30 mL，回流水解1 h，取出立即冷卻，二氯甲烷萃取5次，30 mL/次，合并二氯甲烷液，回收溶劑，殘?jiān)脽o(wú)水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）混合溶液洗出，并定容至10 mL量瓶中［14］。

1.4.2 混合對(duì)照品的制備 取橙黃決明素、大黃酸、大黃素、大黃酚與大黃素甲醚適量，加入無(wú)水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）混合溶液定容至刻度，得到含量為橙黃決明素45 μg/mL、大黃酸50 μg/mL、大黃素44 μg/mL、大黃酚70 μg/mL、大黃素甲醚20 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.5 決明子提取物溶液指紋圖譜的構(gòu)建

1.5.1 色譜條件 色譜柱YMC-PackODS-A C18（250mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為A（乙腈）-B（0.1%磷酸），梯度洗脫，分析時(shí)間80 min；0～11 min，35%～35%A；11～13 min，29%～29%A；13～19 min，35%～38%A；19～22 min，38%～32%A；22～27 min，32%～37%A；27～40 min，37%～47%A；40～44 min，47%～50%A；44～54 min，50%～55%A；54～70 min，55%～57%A；70～80 min，57%～90%A；柱溫為30 ℃；體積流量：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

1.5.2 化學(xué)指紋圖譜的建立 通過(guò)國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012.130723 版本）對(duì)10批決明子總蒽醌提取物溶液進(jìn)行共有峰匹配并建立HPLC 指紋圖譜。

1.6 決明子總蒽醌提取物抗5-Fu致小鼠肝損傷的動(dòng)物造模及給藥

將72 只小鼠隨機(jī)分為正常組、5-Fu 模型組（150 mg/kg）、決明子總蒽醌提取物低劑量組（0.4 g/kg）+5-Fu模型組（150 mg/kg）、決明子總蒽醌提取物中劑量組（0.8 g/kg）+5-Fu模型組（150 mg/kg）、決明子總蒽醌提取物高劑量組（1.6 g/kg）+5-Fu模型組（150 mg/kg）及聯(lián)苯雙酯組（3 mg/kg），12只/組。除正常組腹腔注射生理鹽水外，其它各組小鼠均腹腔注射5-Fu（150 mg/kg/d），10 mL/kg，受試藥物組同時(shí)灌胃給予藥物20 mL/kg/d，正常與模型組灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)給藥5 d［15］。每天記錄小鼠體質(zhì)量及食物量，自由飲水。末次給藥2 h后，摘眼球取血并脫臼處死小鼠，摘取肝臟凍存于-80 ℃冰箱中以待后用。

1.7 血清ALT與AST檢測(cè)

小鼠摘眼球取血后，置4 ℃，8000×g離心10 min，取上清液凍存于-80 ℃。按檢測(cè)試劑盒測(cè)定ALT和AST含量，記錄數(shù)據(jù)。

1.8 肝組織氧化指標(biāo)檢測(cè)

取凍存于-80 ℃的肝組織于冷生理鹽水中反復(fù)沖洗，剝離結(jié)締組織，剪碎，生理鹽水洗滌除去內(nèi)部積血，濾紙吸干備用。準(zhǔn)確稱取肝組織1 g，按照1∶4（M/V）的比例加入4倍體積的生理鹽水，冰浴下機(jī)械勻漿充分粉碎組織，制備20%組織勻漿，取未經(jīng)離心的20%組織勻漿0.5 mL置-80 ℃保存，其余組織勻漿4 ℃，12 000×g離心6 min，取上清液凍存于-80 ℃待用。通過(guò)BCA蛋白定量法測(cè)定上清蛋白濃度，嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定肝組織中SOD、T-AOC及MPO含量。

1.9 決明子總蒽醌提取物抗5-Fu致小鼠肝損傷的譜-效關(guān)系分析

通過(guò)灰色關(guān)聯(lián)度法，以Matlab 2014a 語(yǔ)言自編分析程序得到?jīng)Q明子總蒽醌提取物抗5-Fu致小鼠肝損傷的譜效關(guān)系并得到其藥效成分群。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過(guò)SPSS Statistics 18軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 決明子總蒽醌提取物指紋圖譜的建立

取“1.4”項(xiàng)下決明子總蒽醌提取物溶液及混合對(duì)照品溶液，按“1.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，建立決明子總蒽醌提取物溶液與混合對(duì)照品溶液的色譜圖（圖1）。圖中6號(hào)峰為橙黃決明素、11號(hào)峰為大黃酸、22號(hào)峰為大黃素、29號(hào)峰為大黃酚、30號(hào)峰為大黃素甲醚。將10批決明子總蒽醌提取物溶液色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，以S1為參照?qǐng)D譜，通過(guò)Mark峰匹配建立決明子總蒽醌提取物指紋圖譜，共標(biāo)定31個(gè)共有峰（圖2）。對(duì)決明子總蒽醌提取物指紋圖譜中的31個(gè)共有峰的峰面積進(jìn)行均值化變換法處理［16］。

圖1 決明子(A)及對(duì)照品(B)的HPLC圖Fig. 1 High-performance liquid chromatograms(HPLC)of Cassia seeds(A)and the reference substance(B).

圖2 10批決明子HPLC指紋圖譜Fig. 2 HPLC fingerprints of 10 batches of Cassia seeds.

2.2 決明子總蒽醌提取物抗5-Fu致小鼠肝損傷的藥效學(xué)分析

2.2.1 決明子總蒽醌提取物對(duì)5-Fu模型小鼠血清ALT、AST水平的影響 相較于正常組，模型組小鼠血清中ALT和AST含量均明顯升高（P<0.01，圖3）。與5-Fu組比較，決明子總蒽醌提取物低、中、高劑量組呈劑量依賴關(guān)系顯著降低了ALT和AST的含量（P<0.05）。決明子總蒽醌提取物低、中、高劑量組詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

圖3 決明子總蒽醌提取物對(duì)5-Fu致小鼠肝損傷血清ALT（A）和AST（B）水平的影響Fig. 3 Effects of total anthraquinone extract from Cassia seeds on serum ALT(A)and AST(B)levels in 5-FU-induced liver injury mice.**P<0.01 vs normal group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group.ALT:Alanine aminotransferase;AST:Aspartate aminotransferase.

2.2.2 決明子總蒽醌提取物對(duì)5-Fu模型小鼠肝組織中MPO、T-AOC 和SOD的影響 相比與正常組，模型組MPO含量顯著升高（P<0.01），SOD與T-AOC活性顯著降低（P<0.01），而決明子總蒽醌提取物與聯(lián)苯雙酯組均不同程度的降低了5-Fu 小鼠肝臟中MPO 的含量（P<0.05），阻斷了SOD與T-AOC活性的降低（P<0.01），且決明子總蒽醌提取物低、中、高組呈劑量依賴關(guān)系降低或升高抗氧化指標(biāo)（圖4）。決明子總蒽醌提取物低、中、高劑量組詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

圖4 決明子總蒽醌提取物對(duì)5-Fu致小鼠肝損傷肝組織中MPO(A)、T-AOC(B)和SOD(C)的影響Fig. 4 Effects of total anthraquinone extract from Cassia seeds on MPO(A),T-AOC(B)and SOD(C)in the liver tissue of 5-FU model mice.**P<0.01 vs normal group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group

2.3 決明子總蒽醌提取物抗5-Fu致小鼠肝損傷作用的譜效關(guān)系及藥效成分群的確認(rèn)

2.3.1 關(guān)聯(lián)度 根據(jù)決明子總蒽醌提取物的10批指紋圖譜峰面積數(shù)據(jù)及其抗5-Fu致小鼠肝損傷作用的藥效學(xué)數(shù)據(jù)，基于譜效關(guān)系中的灰色關(guān)聯(lián)分析原理，利用Matlab 2014a 語(yǔ)言自編譜效灰色關(guān)聯(lián)程序來(lái)計(jì)算決明子總蒽醌提取物的指紋圖譜與抗5-Fu致小鼠肝損傷作用的關(guān)聯(lián)度［17］（圖5）。

圖5 決明子總蒽醌提取物指紋圖譜31個(gè)共有峰與抗5-Fu致小鼠肝損傷藥效學(xué)的關(guān)聯(lián)度Fig. 5 Correlation strengths of 31 common peaks in the fingerprints of the total anthraquinone extract of Cassia seeds with the pharmacodynamics against 5-Fuinduced liver injury in mice.A:ALT;B:AST;C:MPO;D:SOD;E:T-AOC.

2.3.2 關(guān)聯(lián)序 根據(jù)決明子總蒽醌提取物指紋圖譜31個(gè)共有峰與其抗5-Fu致小鼠肝損傷作用的藥效學(xué)結(jié)果之間的關(guān)聯(lián)度大小，對(duì)31個(gè)共有峰進(jìn)行排序，得到?jīng)Q明子總蒽醌提取物抗5-Fu致小鼠肝損傷作用的關(guān)聯(lián)序，由關(guān)聯(lián)度從大到小排列（表2）。由表2可知，在不同給藥劑量下，不同藥效學(xué)指標(biāo)間關(guān)聯(lián)序變化不大，各成分對(duì)發(fā)揮抗5-Fu致小鼠肝損傷作用的貢獻(xiàn)度并不相同。

表2 決明子總蒽醌提取物譜效關(guān)系的關(guān)聯(lián)序（前15位）Tab.2 Relational order of the spectrum-effective relationship of the total anthraquinone extract from Cassia seeds(Top 15)

2.3.3 藥效成分群的篩選 關(guān)聯(lián)序以及各個(gè)成分在不同藥效學(xué)指標(biāo)、給藥劑量下的出現(xiàn)頻率可反應(yīng)各個(gè)成分對(duì)發(fā)揮藥效的貢獻(xiàn)度［17］。篩選關(guān)聯(lián)序前15的色譜峰號(hào)作為決明子總蒽醌提取物發(fā)揮抗5-Fu致小鼠肝損傷的藥效成分群，其中已知成分分別為橙黃決明素（按決明子總蒽醌提取物HPLC指紋圖譜峰號(hào)依次排列，第6號(hào)峰，其它同）、大黃酸（第11號(hào)峰）、大黃素（第22號(hào)峰）、大黃酚（第29號(hào)峰）及大黃素甲醚（第30號(hào)峰）。

3 討論

肝臟是人體代謝的主要器官，許多因素都會(huì)造成肝臟的損傷，如藥物、細(xì)菌、病毒等，因此肝臟損傷的病因與發(fā)展較為復(fù)雜多變，需要準(zhǔn)確可靠的生物學(xué)指標(biāo)輔助預(yù)防、診斷與治療。ALT與AST是臨床應(yīng)用最廣泛的用于判斷肝損傷是否發(fā)生的生化指標(biāo)，在肝臟受到損傷時(shí)，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，ALT含量升高，進(jìn)一步引起線粒體損傷出現(xiàn)AST的升高［18］。5-Fu誘導(dǎo)的模型組小鼠血清中ALT與AST含量明顯升高，表明利用5-Fu成功建立了小鼠肝損傷模型。決明子總蒽醌提取物給藥組均能不同程度的降低小鼠血清中ALT與AST的含量，且呈劑量依賴關(guān)系。

研究發(fā)現(xiàn)［19］，氧化應(yīng)激與肝炎、肝癌、肝纖維化及藥物性肝損傷等多種肝病模型密切相關(guān)。ROS在肝臟受到損傷時(shí)會(huì)大量產(chǎn)生，同時(shí)機(jī)體清除自由基的能力下降，自由基的代謝主要有SOD、GSH-Px、過(guò)氧化氫酶（CAT）等進(jìn)行調(diào)控，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化的平衡遭到破壞，形成氧化應(yīng)激［20］。MPO催化反應(yīng)可以產(chǎn)生超出局部抗氧化劑抵御范圍內(nèi)的氧化劑，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激與氧化性組織損傷，而MPO參與炎癥反應(yīng)時(shí)，其活性的增加也代表著中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)增多，會(huì)產(chǎn)生氧化反應(yīng)，造成炎癥部位的損傷［21,22］。SOD作為體內(nèi)最主要的抗氧化酶之一，具有清除氧自由基的作用，可以抑制氧化應(yīng)激從而達(dá)到保護(hù)肝臟的作用，也可反映機(jī)體的抗氧化能力［23,24］。T-AOC是機(jī)體總抗氧化能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)［25］。本實(shí)驗(yàn)中，5-Fu誘導(dǎo)的模型組小鼠肝臟勻漿中MPO活性升高，SOD及T-AOC活性下降，給藥決明子總蒽醌提取物后，呈劑量依賴性降低肝臟勻漿中MPO活性，升高SOD及T-AOC活性，說(shuō)明決明子總蒽醌提取物可能通過(guò)抑制自由基的生成來(lái)抵御氧化應(yīng)激從而達(dá)到保護(hù)肝臟的作用。

中藥的治療效果是由中藥所含的物質(zhì)群共同作用產(chǎn)生的，從中發(fā)現(xiàn)有效的活性成分并予以確認(rèn)是中藥深入研究的關(guān)鍵。鄧氏關(guān)聯(lián)度是最典型的關(guān)聯(lián)度計(jì)算模型，常將其用于譜效關(guān)系的分析，如抗氧化藥效成分群的分析、抗凝血作用的藥效成分分析等［26,27］。研究發(fā)現(xiàn)［28］，從關(guān)聯(lián)序來(lái)看，決明子總蒽醌提取物對(duì)5-Fu致小鼠肝損傷的藥效學(xué)指標(biāo)ALT、AST、MPO、SOD、T-AOC作用的物質(zhì)基礎(chǔ)基本一致，對(duì)各個(gè)藥效學(xué)指標(biāo)的貢獻(xiàn)度也基本相符，前15位化學(xué)成分中已知成分為橙黃決明素（按決明子總蒽醌提取物HPLC指紋圖譜峰號(hào)依次排列，第6號(hào)峰，其它同）、大黃酸（第11號(hào)峰）、大黃素（第22號(hào)峰）、大黃酚（第29號(hào)峰）及大黃素甲醚（第30號(hào)峰）；從關(guān)聯(lián)度來(lái)看，出現(xiàn)低劑量組關(guān)聯(lián)度高于中或高劑量組的現(xiàn)象，與給藥劑量的濃度分布不一致。在體外如中藥抗氧化藥效成分群的分析中，關(guān)聯(lián)度的變化與溶液濃度的低、中、高分布一致，但在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的藥效中卻出現(xiàn)關(guān)聯(lián)度變化與給藥劑量低、中、高劑量的分布不同的現(xiàn)象，盡管這種異常情況并不影響譜效關(guān)系的分析與確認(rèn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中影響因素較多，如動(dòng)物的個(gè)體差異較大等，會(huì)導(dǎo)致同組數(shù)據(jù)波動(dòng)較大，如低劑量組個(gè)別數(shù)據(jù)可能會(huì)出現(xiàn)超出中或高劑量組的數(shù)據(jù)范圍，而根據(jù)灰色關(guān)聯(lián)原理計(jì)算公式中對(duì)譜-效數(shù)據(jù)進(jìn)行差值處理后，取最大值進(jìn)行關(guān)聯(lián)度的計(jì)算，這會(huì)導(dǎo)致在譜效關(guān)聯(lián)中出現(xiàn)關(guān)聯(lián)度與給藥劑量低、中、高濃度的分布規(guī)律不一致的情況發(fā)生。課題組后期將進(jìn)行譜效關(guān)系研究中灰色關(guān)聯(lián)原理的修訂與驗(yàn)證。

譜效關(guān)系研究結(jié)果表明，決明子總蒽醌提取物各成分相互協(xié)調(diào)發(fā)揮抗5-Fu致小鼠肝損傷的保護(hù)作用，其中橙黃決明素（按決明子總蒽醌提取物HPLC指紋圖譜峰號(hào)依次排列，第6號(hào)峰，其它同）、大黃酸（第11號(hào)峰）、大黃素（第22號(hào)峰）、大黃酚（第29號(hào)峰）及大黃素甲醚（第30號(hào)峰）是決明子總蒽醌提取物中發(fā)揮抗5-Fu致小鼠肝損傷的主要藥效成分群。