黃 伊，丁 信，黃 楠，陳燦雄，鄧小燕

1廣州市傳染性疾病臨床快速診斷與預(yù)警重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510180；2廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院，廣東廣州510180

奇異變形桿菌（PMI）其在瓊脂平板上具備群集遷移運(yùn)動(dòng)的特點(diǎn)受研究者的廣泛關(guān)注。它是一種條件致病菌，能夠引起人傷口、眼睛、胃腸道和尿路的感染，是引起導(dǎo)管相關(guān)性尿路感染（CAUTI）的主要原因，常并發(fā)膀胱和腎結(jié)石的形成(尿石癥)和永久性的腎臟損害，并可能進(jìn)展為菌血癥和敗血癥［1-4］。近年來(lái)由于抗生素濫用，奇異變形桿菌耐藥性呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，臨床治療效果欠佳，且易于形成生物被膜而導(dǎo)致感染遷延不愈，因此奇異變形桿菌所致尿路感染疾病及其致病機(jī)制應(yīng)引起臨床的重視［5,6］。

鉬是大多數(shù)生命體必需的微量元素，由modABC基因編碼ModABC蛋白協(xié)助細(xì)菌以高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)微量元素鉬酸鹽，轉(zhuǎn)運(yùn)至菌體內(nèi)的鉬酸鹽以鉬輔因子的形式參與鉬酶的合成，在細(xì)菌的厭氧呼吸中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［7-13］。近年來(lái)越來(lái)越多的研究顯示modABC基因與細(xì)菌毒力和致病性存在相關(guān)性，表明它們可能是未來(lái)重要的藥物靶標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)modABC基因增強(qiáng)肺炎克雷伯菌致肌肉感染，銅綠假單胞菌和結(jié)核分枝桿菌的modA基因與細(xì)菌生物被膜形成及毒力存在正相關(guān)性，提示modABC基因與細(xì)菌毒力緊密相關(guān)［7,8,10,11,14,15］。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于modABC基因在奇異變形桿菌生長(zhǎng)代謝過(guò)程中的具體功能仍然未知，該基因?qū)ζ娈愖冃螚U菌毒力因子的作用及致病機(jī)制仍待研究。因此，了解并深入探尋modABC基因在奇異變形桿菌生長(zhǎng)、代謝等過(guò)程中執(zhí)行的功能及其毒力基礎(chǔ)和致病機(jī)制非常必要。本研究利用自殺載體系統(tǒng)，采用同源重組的方法構(gòu)建奇異變形桿菌親本株P(guān)MI的modABC基因敲除突變株，初步研究其生物學(xué)特性，通過(guò)電感耦合等離子質(zhì)譜法（ICP-MS）測(cè)定其胞內(nèi)鉬含量，并檢測(cè)其生長(zhǎng)曲線(xiàn)，為進(jìn)一步研究modABC基因的生物學(xué)功能及奇異變形桿菌致病性提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒 奇異變形桿菌PMI（四環(huán)素抗性）菌株由密歇根大學(xué)醫(yī)學(xué)院Harry L.T.Mobley教授惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑和儀器 本實(shí)驗(yàn)室所用的化學(xué)試劑為分析純，購(gòu)自TaKaRa、阿拉丁、Sangon和Oxoid等公司。ICP-MS所用試劑均為優(yōu)級(jí)純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

THZ-82B 氣浴恒溫?fù)u床（常州金壇精工儀器有限公司），BI-120F恒溫培養(yǎng)箱（廣東正一實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），micropulser 電轉(zhuǎn)化 儀、T100 梯度PCR 儀（BioRad），臺(tái)式離心機(jī)（Eppendorf），瓊脂糖水平電泳儀DYCP-32A（北京六一儀器廠(chǎng)），凝膠紫外成像儀（復(fù)日科技公司），0.22 μm 除菌過(guò)濾器（millipor）。

1.2 方法

1.2.1modABC基因兩側(cè)同源序列及Kn抗性基因的擴(kuò)增 從NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)獲取PMI的基因及其兩側(cè)DNA 序列，設(shè)計(jì)合成兩側(cè)序列擴(kuò)增引物-AF、-AR及-BF、-BR。以PMI 基因組DNA 為模板，分別通過(guò)PCR擴(kuò)增基因上游的A片段和下游的B片段。設(shè)計(jì)合成Kn抗性基因（卡那霉素抗性基因）擴(kuò)增引物-KnF和-KnR，利用高保真PCR反應(yīng)從pET28a質(zhì)粒上擴(kuò)增Kn抗性基因序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定條帶正確后，利用膠回收試劑盒純化后備用。引物序列詳見(jiàn)表1，PCR擴(kuò)增體系及條件見(jiàn)表2、3。

表1 基因缺失株構(gòu)建及鑒定的引物Tab.1 Primers used for construction and identification of modABC gene deletion strain

表2 PCR反應(yīng)體系Tab.2 System of PCR reaction

表3 PCR反應(yīng)條件Tab.3 Reference conditions of PCR reaction

1.2.2 基因上、下游片段的連接 基因兩側(cè)序列與Kn抗性基因通過(guò)融合PCR進(jìn)行連接。將純化后的上、下游同源臂片段和Kn抗性基因片段等比例混合，以混合DNA片段作為模板進(jìn)行融合PCR，引物對(duì)為-AF/BR。PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件同上，最后得到連接好的重組片段，純化PCR產(chǎn)物（圖1），融合PCR反應(yīng)體系及條件見(jiàn)表2、3。

圖1 基因缺陷同源性打靶示意圖Fig. 1 Schematic diagram of homologous recombination for modABC gene deletion.The gray arrow indicates the ORF region of modABC gene and Kn gene.The light gray regions flanking modABC gene represent the A gene on the target gene and the B gene(downstream).The primer pairs(-AF/R,-BF/R)of Aand B genes on both sides and the primer pairs(-KnF/R)of Kn gene are marked.

1.2.3 同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將質(zhì)粒pCVD442經(jīng)SmaI酶切后割膠純化，30 ℃反應(yīng)2 h。酶切反應(yīng)結(jié)束后，載體和融合PCR產(chǎn)物分別經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離，柱離心純化，洗脫于50 μL 去離子水。經(jīng)SmaI 酶切后的pCVD442質(zhì)粒和融合PCR產(chǎn)物與T4DNA連接酶16 ℃反應(yīng)過(guò)夜，連接產(chǎn)物經(jīng)異丙醇沉淀后，70%乙醇洗滌，溶解于5 μL去離子水。通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5αλpir，在LB平板（含氨芐青霉素50 μg/mL，卡那霉素25 μg/mL）上于37 ℃培養(yǎng)至單克隆形成。在氨芐青霉素、卡那霉素雙抗性平板上生長(zhǎng)的克隆含有打靶片段，選擇1個(gè)克隆測(cè)序驗(yàn)證序列正確后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，命名為pCVD442-ΔmodABC::Kn。接種此克隆入3 mL LB（含氨芐青霉素50 μg/mL，卡那霉素25 μg/mL），37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日柱離心法純化質(zhì)粒DNA。將打靶載體pCVD442-ΔmodABC::Kn電轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌β2155菌株，鋪LB平板（含氨芐青霉素100 μg/mL，0.5 mmol/L DAP（二氨基庚二酸，阿拉丁試劑），37 ℃培養(yǎng)至單克隆形成。此克隆即為用于接合實(shí)驗(yàn)的供體菌株β2155/pCVD442-ΔmodABC::Kn。

1.2.4 接合實(shí)驗(yàn)及modABC基因敲除菌株篩選 在LB平板上劃線(xiàn)接種受體菌奇異變形桿菌PMI，37 ℃培養(yǎng)至單克隆形成。挑單克隆入3 mL LB，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，挑β2155/pCVD442-ΔmodABC::Kn單克隆入3 mLLB（含Amp 100 μg/mL，0.5 mmol/LDAP）。37 ℃，220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。取500 μL供體菌β2155/pCVD442-ΔmodABC::Kn菌液與500 μL受體菌（奇異變形桿菌）菌液混合進(jìn)行接合實(shí)驗(yàn)。取50 μL接合后菌液涂布于含有氨芐青霉素（100 μg/mL）和卡那霉素（33 μg/mL）的LB平板，30 ℃培養(yǎng)至單克隆形成。在抗性平板上，隨機(jī)挑選10個(gè)克隆，依次用牙簽挑入同一管100 μL LB培養(yǎng)基，混合均勻后，取10 μL 接種3 mL LB 培養(yǎng)基，于30 ℃、220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。次日，取50 μL培養(yǎng)液鋪于含10%蔗糖的LB平板（含Kn33 μg/mL，不含NaCl），置30 ℃培養(yǎng)至單克隆形成。隨機(jī)挑選14個(gè)單克隆，分別接種3 mL LB 培養(yǎng)基（含Kn33 μg/mL），30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日，取少量菌液用modABC基因內(nèi)部引物進(jìn)行PCR鑒定。并用外側(cè)引物進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。取內(nèi)部引物成功鑒定的其中一個(gè)克隆的少量菌液，用外側(cè)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系及條件見(jiàn)表2、3。

1.2.5 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.6 ICP-MS檢測(cè)鉬離子濃度 方法參考GB 5009.268-2016［16］，將凍存的親本株P(guān)MI和敲除株△modABC分別以1∶100比例接種到新鮮的LB培養(yǎng)液中。至于恒溫?fù)u床中37 ℃振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期，從中取出1 mL菌液離心，無(wú)菌1×PBS清洗兩遍，用1 mL無(wú)菌1×PBS重懸用接種環(huán)取一環(huán)細(xì)菌四區(qū)劃線(xiàn)接種至血瓊脂平板培養(yǎng)基，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。

輕輕刮取血瓊脂平板培養(yǎng)基表面的細(xì)菌，稱(chēng)取細(xì)菌樣品0.2～0.5 g（必要時(shí)經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎均勻,精確至0.001 g）于微波消解內(nèi)罐中，加入5～10 mL硝酸，加蓋放置1 h或過(guò)夜，旋緊罐蓋，按照微波消解儀標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行消解（消解參考條件見(jiàn)表4）。冷卻后取出，緩慢打開(kāi)罐蓋排氣，用少量水沖洗內(nèi)蓋，將消解罐放在控溫電熱板上或超聲水浴箱中，于100 ℃加熱30 min或超聲脫氣2～5 min，添加水定容至25或50 mL，混勻備用，同時(shí)做空白試驗(yàn)。按照電感耦合等離子體質(zhì)譜儀標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行（操作條件見(jiàn)表5），在調(diào)諧儀器達(dá)到測(cè)定要求后，編輯測(cè)定方法，根據(jù)待測(cè)鉬元素的性質(zhì)選擇內(nèi)標(biāo)元素103Rh/115In，待測(cè)元素和內(nèi)標(biāo)元素的m/z為95。將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入電感耦合等離子體質(zhì)譜儀中，測(cè)定待測(cè)元素和內(nèi)標(biāo)元素的信號(hào)響應(yīng)值，以待測(cè)元素的濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)元素與所選內(nèi)標(biāo)元素響應(yīng)信號(hào)值的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將空白溶液和試樣溶液分別注入電感耦合等離子體質(zhì)譜儀中，測(cè)定待測(cè)元素和內(nèi)標(biāo)元素的信號(hào)響應(yīng)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到消解液中待測(cè)元素的濃度。試樣中待測(cè)元素的含量按下式計(jì)算：

表4 樣品消解儀參考條件Tab.4 Reference conditions of sample digester

表5 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀操作參考條件Tab.5 Reference operation conditions of inductively coupled plasma mass spectrometer

式中：X-試樣中待測(cè)元素含量，單位mg/kg或mg/L；ρ-試樣溶液中被測(cè)元素質(zhì)量濃度，單位為μg/L；ρ0-試樣空白液中被測(cè)元素質(zhì)量濃度，單位為μg/L；V-試樣消化液定容體積，單位為mL；f-試樣稀釋倍數(shù)；m-試樣稱(chēng)取質(zhì)量，單位為g；1000-換算系數(shù)。計(jì)算結(jié)果保留3位有效數(shù)字。

1.2.7 親本株、缺失株體外培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定 將凍存的親本株P(guān)MI和敲除株△modABC分別以1∶100的比例接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜后，從中取出1 mL菌液12 000 r/min離心2 min，無(wú)菌1×PBS清洗2遍，用1 mL無(wú)菌1×PBS重懸，調(diào)整菌液A600nm值一致至約0.6，再取重懸菌液以1∶100的比例分別接種至LB液體培養(yǎng)基，以此為起始測(cè)試點(diǎn)，用PBS調(diào)零，每隔2 h測(cè)其A600nm值。重復(fù)測(cè)量3次，并取均數(shù)值繪出生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖。

厭氧生長(zhǎng)操作如上，由于尿路感染環(huán)境中存在硝酸鹽，同時(shí)鉬酶參與奇異變形桿菌厭氧硝酸鹽還原，將還原為，對(duì)細(xì)菌的厭氧生長(zhǎng)至關(guān)重要，且在硝酸鹽存在的情況下奇異變形桿菌僅表達(dá)鉬酶中的硝酸還原酶，而在硝酸鹽不存在的情況下奇異變形桿菌除鉬酶外還表達(dá)延胡索酸酶。因此在培養(yǎng)基中考慮添加硝酸鹽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將重懸菌液分別接種至添加20 mmol/L和不添加20 mmol/L硝酸鉀的LB液體培養(yǎng)基，置于厭氧罐密封培養(yǎng)，每隔3 h測(cè)定。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 25.0軟件，鉬離子含量比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，生長(zhǎng)曲線(xiàn)采用雙因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 modABC基因缺陷同源性打靶片段的擴(kuò)增

以親本株P(guān)MI基因組為模板，用引物對(duì)modABCAF/AR、modABC-BF/BR 及modABC-KnF/KnR 分別PCR 擴(kuò)增出modABC基因同源性上下游片段及卡那霉素抗性基因片段，大小分別為741 bp、729 bp、927 bp（圖2A）。以純化的上、下游片段為模板，用modABCAF、modABC-BR引物成功融合PCR擴(kuò)增modABC基因缺陷同源性片段，大小為2337 bp，PCR產(chǎn)物大小相符（圖2B）。

圖2 基因缺陷同源性打靶片段的擴(kuò)增Fig. 2 Amplification of homologous arms of modABC gene.A:Homologous arm amplification of modABC.M: DNA molecular weight standard.Lane 1:Amplification product of upstream homologous recombination arm (741 bp);Lane 2:Amplification product of downstream homologous recombination arm (729 bp);Lane 3: Amplification product of kanamycin resistance gene (927 bp). B: Fusion PCR amplification.M: DNA molecular weight standard.Lane 1:Target fusion gene (upstream homologous recombination arm-kanamycin resistance gene-downstream homologous recombination arm,2337 bp).

2.2 modABC基因缺失株的的篩選

采用內(nèi)部引物和外部引物對(duì)接合實(shí)驗(yàn)后的菌株進(jìn)行篩選（圖3A），內(nèi)部引物PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示：以親本株P(guān)MI為模板時(shí)此對(duì)內(nèi)部引物擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為263 bp，1-14號(hào)克隆均為陰性擴(kuò)增（圖3B）。采用外側(cè)引物進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果顯示，親本株P(guān)MI外側(cè)引物擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為4143 bp，為modABC基因特異性條帶，第1 號(hào)克隆擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為2645 bp，為Kn抗性基因特異性條帶（圖3C）。上述結(jié)果表明，modABC已被敲除。

圖3 基因缺失株的的篩選Fig. 3 Screening of gene deletion strains,A:Map of gene positions on both sides and the primers.The gray arrow indicates the ORF region of the genes.The external primer pair (outF/R) and internal primer pair(inF/R)are marked.B:Identification of gene internal primer mutant screening.M:DNA molecular weight standard.Lanes 1-14: Internal primer amplification products of clone 1-14.Lane 15: Internal primer amplification product of the wild-type strain (263 bp);Lane 16: Amplification product of the negative control without template.C:Identification of mutant screening of the fusion gene with external primers.M:DNA molecular weight standard.Lane 1:Amplification product of the external primer of clone 1(2645 bp);Lane 2:Amplification product of the wild-type strain external primer(4143 bp);Lane 3:Negative control.

2.3 測(cè)序驗(yàn)證

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果顯示，目標(biāo)基因位置被卡那霉素抗性基因Kn替代，與設(shè)計(jì)一致。從卡那霉素抗性基因Kn的起始密碼子ATG開(kāi)始翻譯，通讀Kn，最后終止于Kn基因翻譯的終止密碼子TAA（圖4）。確定此克隆為modABC基因敲除克隆，命名為：Pmi/ΔmodABC::Kn。

圖4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Sanger測(cè)序圖Fig. 4 Sanger sequencing of PCR amplification products. A: Forward sequencing; B: Reverse sequencing.

2.4 modABC缺失導(dǎo)致奇異變形桿菌體內(nèi)鉬酸鹽含量下降

采用電感耦合等離子質(zhì)譜法進(jìn)行奇異變形桿菌鉬離子檢測(cè)結(jié)果如圖所示，敲除了modABC基因后，敲除株體內(nèi)鉬酸鹽含量約為1.22±0.02 mg/kg，與親本株P(guān)MI的鉬含量1.46±0.02 mg/kg的相比明顯減少（圖5），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖5 奇異變形桿菌菌體內(nèi)鉬離子含量Fig. 5 Concentration of molybdate in Proteus mirabilis.***P<0.001.

2.5 modABC缺失導(dǎo)致PMI的厭氧硝酸鹽生長(zhǎng)受限

親本株P(guān)MI和敲除株在LB培養(yǎng)基中的有氧生長(zhǎng)能力無(wú)明顯差異，其生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期的時(shí)間點(diǎn)也基本一致，都在約在2 h后進(jìn)入生長(zhǎng)的增殖期，至約14 h趨于穩(wěn)定（圖6A）。在厭氧條件下，二者的細(xì)菌的增殖總數(shù)遠(yuǎn)低于有氧培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)，當(dāng)敲除了modABC基因后，在不添加20 mmol/L硝酸鹽的LB培養(yǎng)基中的厭氧生長(zhǎng)能力基本一致，均在前3 h快速生長(zhǎng)，而后緩慢生長(zhǎng)（圖6B）。然而，敲除株在了添加20 mmol/L硝酸鹽的LB培養(yǎng)基中的厭氧生長(zhǎng)能力低于親本株P(guān)MI，二者生長(zhǎng)趨勢(shì)一致，前3 h快速生長(zhǎng)，隨后進(jìn)入平臺(tái)期（圖6C，P<0.05）。

圖6 奇異變形桿菌LB培養(yǎng)基生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig. 6 Growth curve of Proteus mirabilis in LB medium,**P<0.005,***P<0.001. A: Aerobic growth. B: Anaerobic growth. C: Anaerobic growth.

3 討論

鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ModABC由modABC編碼，是細(xì)菌內(nèi)負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)鉬酸鹽合成鉬酶的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［7-13］。奇異變形桿菌利用鉬酶中的硝酸鹽還原酶還原尿中硝酸鹽為亞硝酸鹽，作為呼吸酶系統(tǒng)的終末受氫體，尿路的混合感染增加了細(xì)菌對(duì)厭氧硝酸還原酶系統(tǒng)的需求［2］。多項(xiàng)研究證實(shí)，modABC基因與細(xì)菌毒力及致病性相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)敲除modA基因后，銅綠假單胞菌鉬酸鹽濃度下降，導(dǎo)致在硝酸鹽含量減少及在缺氧環(huán)境下生長(zhǎng)受限，并引起銅綠假單胞菌菌膜形成能力以及脂肪酸構(gòu)成發(fā)生改變［8,11,15］。肺炎克雷伯菌的全局調(diào)控因子與modABC基因表達(dá)存在相關(guān)性，與細(xì)菌毒力相關(guān)，并通過(guò)ModABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在宿主體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)鉬酸鹽進(jìn)行厭氧硝酸鹽呼吸，產(chǎn)生適應(yīng)性?xún)?yōu)勢(shì)，增強(qiáng)侵襲性，促進(jìn)肌肉感染［11］。鎢酸鹽作為鉬的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑消除厭氧呼吸所賦予的適應(yīng)性?xún)?yōu)勢(shì)，并選擇性地抑制腸桿菌科細(xì)菌的侵襲以改善腸道炎癥。modA轉(zhuǎn)座子插入突變體削弱了小鼠肺部的增殖和毒力，Mo的轉(zhuǎn)運(yùn)與結(jié)核分枝桿菌毒力也存在相關(guān)性［14,17］。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)modABC在奇異變形桿菌致病中的作用尚無(wú)任何報(bào)道，關(guān)于modABC在奇異變形桿菌中的作用仍待研究。臨床上奇異變形桿菌致尿路感染的情況日趨嚴(yán)重，對(duì)modABC與奇異變形桿菌毒力及致病性的研究顯得尤為重要。構(gòu)建突變株是研究細(xì)菌相關(guān)致病基因功能的重要途徑和方法，利用基因敲除對(duì)探究奇異變形桿菌的modABC基因在致病過(guò)程中的功能至關(guān)重要。

用于研究微生物基因功能的同源重組基因敲除的方法包括自殺載體同源重組和Red同源重組等。彭亮等［18］提出相比于用λRed同源重組技術(shù)進(jìn)行PMI的基因敲除，自殺載體系統(tǒng)的一次重組效率高，可進(jìn)行框內(nèi)缺失突變實(shí)現(xiàn)單純的基因閱讀框內(nèi)堿基序列的缺失，且可避免極性效應(yīng)的產(chǎn)生。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外已有許多基于自殺載體同源重組的基因敲除技術(shù)的報(bào)道［9,19,20］。因此本研究采用基于自殺載體的同源重組法構(gòu)建modABC基因缺失突變株。通過(guò)同源重組技術(shù)，利用含反向篩選基因sacB（蔗糖致死基因）的pCVD442 質(zhì)粒構(gòu)建modABC的缺失突變株，主要分2步，當(dāng)含有同源臂的自殺載體導(dǎo)入目的菌株時(shí)，在生存壓力下發(fā)生第一輪單交換，自殺載體與染色體DNA 發(fā)生同源重組，而后在反向篩選的壓力下發(fā)生第二輪的單交換消除質(zhì)粒，以在蔗糖平板上生長(zhǎng)，最終將基因敲除，成功構(gòu)建奇異變形桿菌modABC基因敲除株以研究其在菌株攝取鉬酸鹽、體外有氧及厭氧環(huán)境下培養(yǎng)的生長(zhǎng)能力的改變，重組效率高，有效避免了對(duì)上下游基因造成的潛在極性效應(yīng)。

modABCD基因在至少20多種細(xì)菌菌屬和古細(xì)菌菌屬中被鑒定報(bào)道［12,21-24］。ModABC蛋白在多種細(xì)菌中被證實(shí)是具有高親和力的鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)菌體內(nèi)的鉬不僅以鉬輔因子的形式參與鉬酶的合成，也可通過(guò)反式抑制（即高胞質(zhì)濃度的游離鉬酸鹽通過(guò)保持ModC與ModB的分離來(lái)抑制轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這一現(xiàn)象稱(chēng)為反式抑制）調(diào)控modABC的表達(dá)［8,10,13,25］。鉬酶在細(xì)菌中的生理作用包括硫化物氧化、芳香族化合物降解以及支持細(xì)菌中的厭氧呼吸，從而支持細(xì)菌能量的產(chǎn)生，其次與細(xì)菌毒力相關(guān)，在感染過(guò)程中對(duì)細(xì)菌適應(yīng)性起著核心作用［7,26-28］。多項(xiàng)研究證實(shí)modABC與某些細(xì)菌的致病性有著非常重要的關(guān)系。在缺乏有效鉬攝取的情況下，細(xì)菌的毒力顯著降低，生物被膜形成受到影響，因此鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ModABCD是潛在的藥物靶點(diǎn)。為了研究modABC與奇異變形桿菌致尿路感染的關(guān)系,我們首先通過(guò)ICP-MS方法明確modABC在奇異變形桿菌鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用。ICP-MS的結(jié)果表明modABC基因的缺失導(dǎo)致奇異變形桿菌胞內(nèi)鉬酸鹽含量下降，先前在銅綠假單胞菌中對(duì)modABC基因中的modA基因的鉬酸鹽和厭氧硝酸鹽生長(zhǎng)的研究結(jié)果也顯示出相似的趨勢(shì)［7］。我們的結(jié)果表明modABC的缺失使奇異變形桿菌無(wú)法合成高親和力的鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)鉬酸鹽，說(shuō)明modABC基因參與調(diào)控奇異變形桿菌鉬酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)。

轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)菌體內(nèi)的鉬酸鹽在厭氧呼吸中起著重要作用，它厭氧呼吸是第一階硝酸鹽還原途徑（將NO3-還原為NO2-）中鉬輔助因子的組成部分［11,13,15,29］。奇異變形桿菌可形成四種還原酶，作為厭氧呼吸鏈的末端氧化酶起作用，包括硝酸還原酶，氯酸鹽還原酶，連四硫酸鹽還原酶和延胡索酸還原酶，其中前三種酶已被鑒定為鉬酶。在硝酸鹽存在的厭氧生長(zhǎng)期間，細(xì)菌僅形成鉬酶中的硝酸鹽還原酶，其他三種還原酶的形成受到抑制；在沒(méi)有硝酸鹽的厭氧生長(zhǎng)期間，細(xì)菌僅形成氯酸還原酶，連四硫酸鹽還原酶和延胡索酸還原酶［25］。從生長(zhǎng)曲線(xiàn)結(jié)果可見(jiàn)，在有氧培養(yǎng)條件下，ΔmodABC和PMI菌株在LB 液體培養(yǎng)基中具有相似的增殖曲線(xiàn)，說(shuō)明modABC基因的缺失對(duì)細(xì)菌的有氧生長(zhǎng)未產(chǎn)生明顯影響。厭氧條件下，與有氧條件下生長(zhǎng)曲線(xiàn)相比，敲除株和親本株的生長(zhǎng)速率下降（圖6B），由此可見(jiàn)厭氧條件可抑制奇異變形桿菌的增殖。不添加硝酸鹽情況下，與親本株相比，modABC基因的缺失不影響敲除株的增殖速率（圖6B），而在添加20 mmol/L 硝酸鹽條件下，modABC基因的缺失使得細(xì)菌的厭氧生長(zhǎng)明顯受到抑制（圖6C）。這可能是由于在無(wú)硝酸鹽的培養(yǎng)基中，敲除株雖無(wú)法合成氯酸鹽還原酶和連四硫酸鹽還原酶這兩種鉬酶，但仍可以依靠非鉬酶延胡索酸酶進(jìn)行厭氧呼吸，而在硝酸鹽存在的條件下，由于細(xì)菌僅形成硝酸還原酶，敲除modABC基因?qū)е录?xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)鉬酸鹽能力受損，從而導(dǎo)致鉬酸鹽以鉬輔因子形式合成硝酸還原酶的能力受限。硝酸鹽還原酶作為奇異變形桿菌厭氧呼吸第一階段的關(guān)鍵酶，它的合成受限使得敲除株的厭氧呼吸被抑制。這些結(jié)果提示modABC基因通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)鉬酸鹽參與鉬酶的合成，促進(jìn)細(xì)菌的厭氧生長(zhǎng)，并且在硝酸鹽存在的厭氧條件下具有更強(qiáng)的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。UTI患者尿路的混合感染增加了對(duì)硝酸還原酶系統(tǒng)的需求，尿道的硝酸鹽環(huán)境為細(xì)菌的厭氧硝酸鹽生長(zhǎng)提供了便利。此外，由于導(dǎo)尿管的使用，奇異變形桿菌致UTI患者易于形成生物被膜從而形成細(xì)菌的厭氧環(huán)生長(zhǎng)環(huán)境，因此，modABC基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)菌在尿路感染患者的尿道環(huán)境的厭氧硝酸鹽生長(zhǎng)而在UTI的致病中發(fā)揮重要作用，具有更其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

本研究利用自殺載體pCVD442通過(guò)同源重組的方法成功構(gòu)建了奇異變形桿菌modABC基因缺失突變株，為后續(xù)modABC操縱子上各個(gè)結(jié)構(gòu)基因敲除株構(gòu)建提供基礎(chǔ)。本研究首次明確modABC基因在奇異變形桿菌體內(nèi)執(zhí)行轉(zhuǎn)運(yùn)鉬酸鹽的功能，并且modABC基因在細(xì)菌生長(zhǎng)代謝過(guò)程中調(diào)控奇異變形桿菌厭氧硝酸鹽生長(zhǎng)，為進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)深入研究modABC基因各個(gè)結(jié)構(gòu)基因的生物學(xué)功能提供思路。然而尚未明確modABC基因在細(xì)菌毒力和致病力方面的作用，這將是進(jìn)一步深入研究的方向，為最終闡明modABC在奇異變形桿菌致尿路感染中的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。