劉力赫，朱明芮，王一凡，萬 波，姜 智

蘇州大學(xué)蘇州醫(yī)學(xué)院，江蘇 蘇州215000

脊髓性肌萎縮癥（SMA）是兒童常見的常染色體隱性遺傳病，是2歲以下嬰幼兒致死性遺傳病的首位病因［1,2］。SMA患者由于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活蛋白（SMN）1基因發(fā)生突變或丟失，僅依賴SMN2所表達(dá)的少量全長(zhǎng)SMN蛋白。SMN的缺乏會(huì)導(dǎo)致脊髓前角α-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡，進(jìn)一步引發(fā)其支配的肌肉進(jìn)行性萎縮，最終因呼吸衰竭而夭亡或終身癱瘓［3］。SMN在多種組織中廣泛表達(dá)，在RNA加工過程中發(fā)揮作用，包括mRNA的運(yùn)輸和snRNP復(fù)合物的組裝等功能［4-6］。

研究發(fā)現(xiàn)SMA病變不局限于神經(jīng)系統(tǒng)，在SMA患者和小鼠模型的肝臟、小腸、胰腺、脾臟等外周組織中均存在異常［7-9］。肝臟特異性敲除SMN1的小鼠胚胎致死；嚴(yán)重型SMA小鼠和患者在發(fā)病過程中會(huì)出現(xiàn)代謝紊亂。本研究團(tuán)隊(duì)前期研究也發(fā)現(xiàn)I型SMA小鼠的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和白蛋白（ALB）3個(gè)肝功能指標(biāo)異常，外周血中的葡萄糖、血清鐵、甘油三酯（TG）、總酮體（TBK）、游離脂肪酸（NEFA）含量明顯低于同窩健康對(duì)照小鼠［10］；肝臟不僅是機(jī)體最大的消化與代謝器官，而且是重要的免疫器官。SMA小鼠肝臟代謝功能紊亂的分子機(jī)制是什么？SMA小鼠肝臟代謝功能紊亂是否影響SMA病程的進(jìn)展？面對(duì)以上問題，目前尚未有系統(tǒng)性的深入研究和闡述。因此，本研究首先探索腹腔注射葡萄糖溶液對(duì)I型SMA小鼠壽命的影響；為尋找I型SMA小鼠的肝臟代謝紊亂的分子病理機(jī)制，對(duì)I型SMA小鼠肝臟組織RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行再分析，篩選、驗(yàn)證相關(guān)信號(hào)通路的變化；分析基因表達(dá)發(fā)生顯著變化的原因，進(jìn)一步加深對(duì)SMA發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 I型SMA小鼠（Smn-/-SMN20tg/2tg）和對(duì)照小鼠（Smn+/-SMN20tg/2tg）（Jackson實(shí)驗(yàn)室，美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送）；所用小鼠飼養(yǎng)于蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF動(dòng)物房。本研究所涉及的實(shí)驗(yàn)和操作均通過蘇州大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查，嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）試劑盒（南京諾唯贊生物科技公司）。PPAR激動(dòng)劑WY-14643（MCE），DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-AzaC（MCE），膠原酶（Roche），透明質(zhì)酸酶（Sigma-Aldrich），脫氧核糖核酸酶I（Sigma-Aldrich），Percoll 細(xì)胞分離液(上海優(yōu)寧維)，F(xiàn)asn 多克隆抗體（Proteintech），SMN 單克隆抗體（BD Bioscience）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息分析 下載I型SMA小鼠P5肝臟組織RNA 測(cè)序數(shù) 據(jù)，利 用Gene Ontology（http://geneontology.org/）對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO terms富集度統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算出差異基因GO term的P-value，定位差異基因最可能相關(guān)的分子功能或信號(hào)通路。運(yùn)用TRANSFAC 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://genexplain.com/transfac/）的預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的MATCH工具分析顯著變化基因啟動(dòng)子區(qū)域潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.2 細(xì)胞/組織總RNA的提?。═RIZOL法）及逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 50～100 mg細(xì)胞/組織加入1 mL TRIZOL，隨后加入200 μL氯仿?lián)u晃混勻，室溫靜置10 min。在4 ℃下以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速冷凍離心15 min。RNA分布在上層的水相中，用異丙醇沉淀水相中的RNA，并用70%乙醇洗滌沉淀，得到純凈的總RNA。取1 μg總RNA，進(jìn)一步采用逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR 實(shí)時(shí)定量PCR 在Applied Biosystems7500 Real Time PCR system（CA）上進(jìn)行，定量所用試劑為2×SYBR Green real-time PCR master mix（TOYOBO）。每個(gè)反應(yīng)的特異性可用溶解曲線反映。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，使用2-ΔΔCt方法定量。實(shí)時(shí)定量PCR方法步驟：95 ℃預(yù)變性5 min，其次是45個(gè)循環(huán)的95 ℃退火15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，延伸結(jié)束后在85 ℃檢測(cè)信號(hào)。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，使用2-ΔΔCt方法定量，內(nèi)參為Gapdh。

1.2.4 肝細(xì)胞分離 小鼠冷凍麻醉后，取肝臟至培養(yǎng)皿剪碎，在含1 mg/mL 膠原酶、2 mg/mL 透明質(zhì)酸酶、20 μg/mL脫氧核糖核酸酶I的RPMI 1640培養(yǎng)基37 ℃孵育、消化45 min 70 μm濾網(wǎng)過濾后離心分離，將細(xì)胞沉淀重懸于紅細(xì)胞裂解液，離心獲得單細(xì)胞混合體。

肝細(xì)胞（HC）的細(xì)胞密度比肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞（NPCs）大，采用低速離心（4 ℃，50×g，2～4 min）分離HC 和NPCs。經(jīng)過離心后，HC沉降至管底，NPCs 處于細(xì)胞懸液中。移棄上層液體，將沉淀的HC 細(xì)胞用10 mL 的RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸于50 mL 離心管中，再移取10 mL Percoll細(xì)胞分離液至HC細(xì)胞懸液中，上下顛倒離心管，混勻細(xì)胞。采用低速離心（4 ℃，200×g，10 min），離心后活的HC細(xì)胞沉淀于管底，死的或者破碎的HC懸浮于液體中。移棄細(xì)胞懸液，用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸管底的HC，再次低速離心（4 ℃，50×g，2～4 min），獲得高純度的HC細(xì)胞，計(jì)數(shù)接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 亞硫酸鹽測(cè)序法定量分析Fasn啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平 實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［11］。經(jīng)亞硫酸鹽處理后PCR 擴(kuò)增Fasn 基因啟動(dòng)子區(qū)的引物F: 5'-TGTATTGAGGAGGATATTAGGGTTA-3'，R:5'-AAA TAACCACAAAAAATAAAAATCC-3'。使用在線軟件QUMA（http://quma.cdb.riken.jp/）定量分析甲基化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graphpad prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較，符合正態(tài)分布的采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；兩組生存曲線之間的比較，采用Kaplan-Meier生存分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有的實(shí)驗(yàn)都是獨(dú)立重復(fù)3次或3次以上。

2 結(jié)果

2.1 I型SMA小鼠體質(zhì)量降低

觀察I型SMA和同窩正常對(duì)照小鼠在出生后連續(xù)7 d的外型和體質(zhì)量變化，結(jié)果顯示，I型SMA和對(duì)照小鼠胃內(nèi)都充滿白色奶汁，但I(xiàn)型SMA小鼠體形明顯小于對(duì)照小鼠（圖1A）；P2的I型SMA小鼠還處于癥狀前期，其體質(zhì)量開始輕于同窩健康對(duì)照小鼠（n≥14，P<0.001），SMA小鼠表現(xiàn)出明顯的消耗性疾病的癥狀（圖1B）。

圖1 SMA和對(duì)照小鼠喝奶及體質(zhì)量變化情況Fig. 1 Milk suckling and body weight of type I SMA and control mice.A:Type I SMA mice have a lower body weight.P4 type I SMA and control littermates mice are filled with white milk,but the body shape of type I SMA mice are smaller.B:Body weight of type I SMA and control mice from 0 to 6 days of age(Mean±SD,n≥14,**P<0.001).

2.2 腹腔注射葡萄糖溶液能延長(zhǎng)I型SMA小鼠生存時(shí)間

在I型SMA小鼠出生后，每隔12 h給小鼠腹腔注射15 μL 20%濃度的葡萄糖溶液，I型SMA小鼠生存時(shí)間由9±1.3 d延長(zhǎng)至11±1.5 d（P<0.05，圖2A），但其體形和體質(zhì)量仍明顯小于同窩健康對(duì)照小鼠（圖2B）。

圖2 葡萄糖溶液治療I型SMA小鼠Fig. 2 Intraperitoneal injection of dextrose(glucose)prolonged the survival of type I SMA mice.A:Kaplan-Meier survival curves of the mice treated with saline or glucose.B:Type I SMA mice injected with 20% glucose solution had smaller body size than the littermate controls mice on the 10th day after birth.P<0.05(log-rank test).

2.3 I型SMA小鼠發(fā)病過程中肝臟內(nèi)PPARα 正調(diào)控的代謝相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)

分析P5 的I 型SMA 小鼠肝臟RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，共有5372個(gè)基因表達(dá)失調(diào)。對(duì)表達(dá)失調(diào)的基因進(jìn)行GO terms富集分析，發(fā)現(xiàn)與脂代謝、糖代謝等相關(guān)基因顯著下調(diào)表達(dá)（圖3B）。運(yùn)用TRANSFAC 數(shù)據(jù)庫(kù)中的預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的MATCH工具分析發(fā)現(xiàn)這些顯著下調(diào)表達(dá)的基因是過氧化物酶體增殖激活受體α（PPARα）靶向調(diào)控的基因。

圖3 P5 I型小鼠肝臟組織RNA-seq 數(shù)據(jù)再分析Fig. 3 Reanalysis of RNA-seq data in the liver tissue of P5 type I mice.A: RNA-seq data volcano map of the liver tissue of P5 type I SMA mice.The red dot indicates the genes with significant differential expression between type I and control mice(FDR<10%,P<0.05).B:Enrichment of the differentially expressed genes by GO terms.

為驗(yàn)證上述基因表達(dá)變化，本研究利用定量PCR檢測(cè)了脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)變化情況，結(jié)果顯示P4的I型SMA小鼠與同窩健康對(duì)照小鼠相比較，脂蛋白攝取/代謝（Lipc、Vldlr、Fabp1-5、Fasn）、線粒體β 氧化（Cpt1a、Cpt2、Decr1、Hadha、Hadhb）等代謝通路中的一些代表性基因都顯著下調(diào)表達(dá)（圖4A），蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示，脂代謝關(guān)鍵酶基因Fasn在I型SMA小鼠肝臟組織中顯著下調(diào)表達(dá)（P<0.01，圖4B）。

圖4 SMA與對(duì)照小鼠肝臟脂代謝、線粒體β氧化相關(guān)基因表達(dá)情況Fig. 4 Expression of genes related to liver lipid metabolism and mitochondrial β oxidation in SMA mice and control mice.A:Results of RT-qPCR for detecting mRNA levels of the genes related to lipid metabolism and mitochondrial β oxidation in the liver of P4 type I SMA and control mice.Data were normalized to GAPDH and presented as fold changes relative to the controls(n=4,*P<0.05,**P<0.01).B:Representative Western blots(left panel)and quantitative analysis(right panel)of Fasn and SMN expressions in the liver of in type I SMAmice and control mice(n=4,**P<0.01).

2.4 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑能增加SMA小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因表達(dá)

本研究抽提小鼠肝組織DNA，經(jīng)重亞硫酸鹽測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，出生后第4天的I型SMA小鼠肝組織中Fasn基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度（76.44%）高于同窩正常對(duì)照小鼠（58.67%）（圖5A）。原代培養(yǎng)新生SMA小鼠的肝細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加PPAR激動(dòng)劑WY-14643（終濃度10 μmol/L）或DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-AzaC（20 μmol/L）培養(yǎng)36 h后，定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)5-AzaC刺激后Cpt1a、Acox1、Ehhadh、Fasn等基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是空白對(duì)照的2倍以上（P<0.001）；WY-14643能上調(diào)Cpt1a、Fasn 等部分基因的表達(dá)，其作用弱于5-AzaC（圖5B）。原代培養(yǎng)新生SMA小鼠的肝細(xì)胞經(jīng)5-AzaC誘導(dǎo)后，細(xì)胞內(nèi)的Fasn蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.001，圖5C）。

圖5 WY-14643和5-AzaC 對(duì)SMA小鼠肝細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 5 Effects of WY-14643 and 5-AzaC on the expression of genes related to lipid metabolism in primary cultured hepatocytes of SMA mice.A:Methylation of Fasn gene promoter region in the liver tissues of P1 and P4 type I SMA mice and control mice analyzed by bisulfite sequencing.Filled circles are methylated and open circles are unmethylated CpGs.B:Effect of WY-14643(10 μmol/L)and 5-AzaC(20 μmol/L)on mRNA expressions of the genes related to lipid metabolism in primary cultured SMA mouse hepatocytes detected by qPCR.GAPDH was used as the reference gene (n=4,*P<0.05,**P<0.001). C: Representative Western blots of Fasn (left) and quantitative analysis (right) in primary cultured SMA mouse hepatocytes treated with DMSO or 5-AzaC(n=3,**P<0.001).

3 討論

本研究I型SMA小鼠和對(duì)照小鼠喝奶及體質(zhì)量變化情況實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠都能正常喝奶，但對(duì)照小鼠體質(zhì)量保持上升趨勢(shì)且上升速率逐漸加快；而I型SMA小鼠從P2開始明顯體型偏小、體質(zhì)量偏低，表現(xiàn)出消耗性的狀態(tài)。這說明SMA小鼠在相同的攝入情況下無法吸收利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。本研究從P1起持續(xù)每隔12 h給I型SMA小鼠腹腔注射葡萄糖溶液，SMA小鼠的平均生存時(shí)間延長(zhǎng)2 d，其體質(zhì)量及體型仍明顯小于對(duì)照小鼠，且其生存時(shí)間仍短于正常小鼠。進(jìn)一步說明葡萄糖的利用不足和能量缺乏是SMA小鼠體質(zhì)量下降且生存時(shí)間縮短的重要原因之一，僅依靠葡萄糖供能仍無法滿足SMA小鼠發(fā)育所需。

為分析SMA小鼠早期出現(xiàn)代謝紊亂的原因，有研究報(bào)道I型SMA臺(tái)灣小鼠模型脊髓、腦、骨骼肌和肝4種組織的轉(zhuǎn)錄組分析，顯示出P5的I型SMA小鼠肝臟組織中有5372個(gè)基因表達(dá)失調(diào)，遠(yuǎn)高于其他組織失調(diào)表達(dá)基因的數(shù)目［4］，提示I型SMA小鼠肝臟受到損害相對(duì)嚴(yán)重。對(duì)表達(dá)失調(diào)的基因進(jìn)行信號(hào)通路聚類分析，發(fā)現(xiàn)肝臟中與脂代謝、糖代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖相關(guān)的基因則顯著下調(diào)表達(dá)。結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)這些顯著變化的基因是PPARα靶向調(diào)控的基因［12-14］。

PPAR 是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族，目前有3個(gè)成員：PPARα，PPARγ和PPARδ。其在肝臟、骨骼肌、腎臟、心臟、腸和血管等組織中高豐度表達(dá)，廣泛參與機(jī)體的脂質(zhì)代謝、糖代謝、線粒體功能、血壓調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)分化及生殖過程，在維持機(jī)體脂質(zhì)和能量平衡過程中發(fā)揮重要作用，并在病理性損傷引起的炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要的保護(hù)作用［15］。有研究表明，PPARα是肝臟脂質(zhì)代謝的主要調(diào)節(jié)因子，特別是在禁食期間，PPARα能誘導(dǎo)肝臟脂肪酸氧化和生酮，并調(diào)節(jié)肝臟葡萄糖的產(chǎn)生［16-18］。除此之外，PPARα能有效誘導(dǎo)多種脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，包括微粒體、過氧化物酶體和線粒體脂肪酸氧化，脂肪酸結(jié)合和激活、脂肪酸伸長(zhǎng)和去飽和、甘油三酯和脂滴的合成和分解、脂蛋白代謝、糖異生、膽汁酸代謝以及各種其他代謝途徑和基因［19］。PPARα與維甲酸X受體α（RXRα）等結(jié)合成異源二聚體，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)的特定序列靶元件結(jié)合，招募DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白乙?；揎椕富蚪M蛋白甲基化修飾酶等蛋白，引起核小體和染色體重塑，影響RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄復(fù)合體對(duì)PPARα靶基因的轉(zhuǎn)錄［20,21］。

胎兒出生前通過臍帶血直接從母體獲得葡萄糖，作為發(fā)育的主要能量［22］。而胎兒期脂肪酸β氧化等代謝途徑基因處于DNA甲基化轉(zhuǎn)錄失活狀態(tài)［23-25］。出生后肝臟脂肪酸β氧化被激活，由合成代謝轉(zhuǎn)為分解代謝，從母乳脂質(zhì)中產(chǎn)生能量［26］。最近研究證實(shí)胎兒出生后DNA去甲基化而mRNA表達(dá)增加的基因，與代謝功能顯著相關(guān)。脂肪酸β氧化途徑相關(guān)基因的DNA甲基化程度具有發(fā)育階段特征性［23］；PPARα是哺乳期肝臟代謝基因DNA去甲基化的關(guān)鍵因子［23］。胎兒出生后PPARα轉(zhuǎn)錄調(diào)控的脂肪酸β氧化等代謝途徑基因：如?；o酶a氧化酶1（Acox 1）和烯酰輔酶a，以及水合酶/3-羥基?；o酶a脫氫酶（Ehhadh）的甲基化水平顯著降低。與此同時(shí)，這些基因的mRNA表達(dá)和蛋白水平在母乳喂養(yǎng)開始時(shí)顯著升高，即通過DNA去甲基化等表觀遺傳學(xué)機(jī)制活化［11,23-25,27］。肝內(nèi)糖/脂代謝途徑激活，新生兒通過肝內(nèi)逐漸表達(dá)的代謝酶消化乳汁，滿足生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)和能量［28,29］。脂肪酸氧化為心臟、肝臟、腦、骨骼肌等器官提供了80%的能量；尤其是在空腹組織糖原耗盡時(shí)，脂肪酸β氧化途徑產(chǎn)生的酮體，被脊髓和腦中的神經(jīng)元以及肌肉細(xì)胞直接利用［28,29］。如果脂肪酸氧化等代謝酶缺陷，新生兒將出現(xiàn)新陳代謝轉(zhuǎn)換障礙，導(dǎo)致嬰幼兒死亡［28,30］。本研究通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)I型SMA小鼠肝臟脂蛋白攝取/代謝、線粒體β氧化等代謝通路中的一些代表性基因都顯著下調(diào)表達(dá)。通過重亞硫酸鹽測(cè)序，本研究檢測(cè)到I型SMA小鼠肝臟組織中Fasn基因啟動(dòng)子區(qū)域高度甲基化，I型SMA小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞中添加DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-AzaC能顯著增加Fasn 等脂代謝相關(guān)基因表達(dá)。進(jìn)一步說明了I 型SMA小鼠的肝臟代謝轉(zhuǎn)換障礙。

綜上所述，可以初步得出嚴(yán)重肌萎縮癥肝臟代謝紊亂的病理機(jī)制：嚴(yán)重型SMA小鼠出生后，由于SMN缺乏，導(dǎo)致PPARα調(diào)控的糖脂代謝相關(guān)基因持續(xù)甲基化而低表達(dá)，引發(fā)代謝轉(zhuǎn)換障礙，無法滿足腦、脊髓和肌肉等組織的發(fā)育生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)和能量，加速SMA病程發(fā)展。本研究進(jìn)一步加深了對(duì)SMA病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)，也為尋找新的SMA治療方案提供理論基礎(chǔ)。