李 濤，張 璽，張曉妮

（臨沂市疾病預(yù)防控制中心細(xì)菌檢驗(yàn)科，山東臨沂 276000）

沙門(mén)菌是導(dǎo)致人類(lèi)和動(dòng)物胃腸炎和腹瀉的最常見(jiàn)病原體之一，其中鼠傷寒沙門(mén)菌（S.typhimurium）在全球沙門(mén)氏菌感染中占很大比例[1]。鼠傷寒沙門(mén)菌單相變異株由于編碼基因（如fljA、fljB或hin）的缺失，導(dǎo)致沙門(mén)菌第二相鞭毛蛋白表達(dá)方面產(chǎn)生缺陷[2]。近年來(lái)，歐洲、美國(guó)和亞洲的臨床分離株中，鼠傷寒沙門(mén)菌單相變異株I4,[5],12:i:-大幅增加，其流行趨勢(shì)已成為全球公眾關(guān)注的問(wèn)題[3]。

2020年4月，山東省臨沂市某機(jī)構(gòu)發(fā)生一起食源性疾病暴發(fā)事件，患者主要表現(xiàn)為發(fā)熱、腹瀉并伴有惡心、嘔吐、腹痛等癥狀。由于該機(jī)構(gòu)相對(duì)封閉，患者有明確的共同就餐史，結(jié)合臨床表現(xiàn)及血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果，判斷為細(xì)菌性食源性疾病事件，隨后采集可疑樣本至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

采集樣本包括患者糞便17份，食品、餐具及食物制作器具涂抹拭子24份。

沙門(mén)菌診斷血清（丹麥SSI）；XbaI限制性?xún)?nèi)切酶（大連TaKaRa）；革蘭氏陰性菌藥敏檢測(cè)板(上海復(fù)星）；沙門(mén)菌血清型分子鑒定試劑盒（山東美正）；標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812及ATCC25922均來(lái)自山東省疾控中心。

熒光PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)賽默飛）；全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)VITEK2（法國(guó)梅里埃公司）；CHEFMAPPER脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀及成像系統(tǒng)和全自動(dòng)凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR檢測(cè)

使用商品化試劑盒應(yīng)用Realtime PCR法對(duì)采集到的糞便樣本進(jìn)行沙門(mén)菌、志賀菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和致瀉大腸埃希氏菌的多病原檢測(cè)。

1.2.2 致病菌的分離及鑒定

糞便樣本參照《感染性腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)》（WS 271—2007）進(jìn)行分離培養(yǎng)，食品、餐具及食物制作器具涂抹拭子樣本按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.4—2016）要求進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 菌株血清型鑒定

使用沙門(mén)菌血清型分子鑒定試劑盒和沙門(mén)菌診斷血清鑒定分離株血清型。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)

采用微量肉湯稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC），按照商品化藥敏檢測(cè)板說(shuō)明書(shū)進(jìn)行具體操作和結(jié)果判讀，使用標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922作為質(zhì)控對(duì)照。

1.2.5 脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型

參照國(guó)家致病菌識(shí)別網(wǎng)沙門(mén)菌PFGE分子分型方法，以H9812為標(biāo)準(zhǔn)Marker。限制性?xún)?nèi)切酶XbaI進(jìn)行酶切，經(jīng)電泳、染色，獲得圖譜，上傳至國(guó)家致病菌識(shí)別網(wǎng)平臺(tái)進(jìn)行聚類(lèi)分析。

1.2.6 全基因組測(cè)序分析

使用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction KitVer.3.0試劑盒提取分離株核酸后，送諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序（Whole Genome Sequencing，WGS）。測(cè)序數(shù)據(jù)采用Center for Genomic Epidemiology（http://www.genomicepidemiology.org/）在線分析工具，預(yù)測(cè)沙門(mén)菌血清型[4]、ST型別[5]、耐藥表型及耐藥基因[6]，基于VFDB（Virulence Factor Database）數(shù)據(jù)庫(kù)[7]對(duì)沙門(mén)菌分離株毒力基因進(jìn)行注釋分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR鑒定結(jié)果

結(jié)果顯示11份患者糞便沙門(mén)菌基因檢測(cè)陽(yáng)性，食品、餐具及食物制作器具涂抹拭子樣本檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.2 分離鑒定及血清分型結(jié)果

41份流調(diào)樣本共分離沙門(mén)菌7株，編號(hào)分別為SDLY20Sal001、SDLY20Sal002、SDLY20Sal003、SDLY20Sal004、SDLY20Sal005、SDLY20Sal007和SDLY20Sal011，均來(lái)自患者糞便樣本。食品、餐具及食物制作器具涂抹拭子樣本增菌培養(yǎng)后，沙門(mén)菌檢測(cè)結(jié)果均為陰性。分離株經(jīng)沙門(mén)菌血清型分子鑒定試劑盒鑒定為鼠傷寒沙門(mén)菌，診斷血清凝集結(jié)果為4,12:i:-，WGS測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)血清型為I4,[5],12:i:-，其ST型為34。

2.3 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）結(jié)果

7株分離株的PFGE帶型一致，判斷此次事件中患者感染同一鼠傷寒沙門(mén)菌，該分離株與臨沂市2019年收集的兩簇鼠傷寒沙門(mén)菌相似度只有47.56%和35.33%（圖1）。

圖1 7株鼠傷寒沙門(mén)菌PFGE聚類(lèi)分析圖譜

2.4 藥物敏感試驗(yàn)及WGS耐藥基因分析結(jié)果

藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果顯示，本案例沙門(mén)分離株對(duì)氨芐西林、四環(huán)素、鏈霉素、多西環(huán)素及米諾環(huán)素耐藥，ResFinder4.0預(yù)測(cè)分離株攜帶6個(gè)耐藥基因，分別是氨基糖苷類(lèi)耐藥基因[aac（6’）-Iaa、aph（6）-Id、aph（3’’）-Ib]、β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因（blaTEM-1B）、磺胺類(lèi)耐藥基因（sul2）及四環(huán)素類(lèi)耐藥基因tet（B）。阿米卡星、氨芐西林-克拉維酸鉀及磺胺甲惡唑3種抗生素藥敏試驗(yàn)與WGS耐藥表型預(yù)測(cè)不同（表1）。

表1 藥物敏感試驗(yàn)及WGS耐藥性預(yù)測(cè)分析結(jié)果

2.5 毒力基因分析結(jié)果

基于VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析本案例分離株WGS測(cè)序數(shù)據(jù)共注釋110個(gè)毒力基因，其中101個(gè)毒力基因可根據(jù)文獻(xiàn)中描述的沙門(mén)菌屬致病的4個(gè)關(guān)鍵階段[8]進(jìn)行分類(lèi)（表2）。與附著相關(guān)毒力因子有bcf、csg、fim、lpf、shd、mis，與侵襲/細(xì)胞內(nèi)存活相關(guān)毒力因子有inv、org、pip、prg、sic、sif、sip、ssp、slr、sod、sop、sig、spa、spt，與巨噬細(xì)胞內(nèi)存活相關(guān)毒力因子有mgt、spi、ssa、ssc、sse、srf，未比對(duì)出與系統(tǒng)傳播相關(guān)毒力因子，前3個(gè)階段對(duì)應(yīng)毒力基因數(shù)量分別是26、40及35。

表2 沙門(mén)菌致病機(jī)制4個(gè)已知步驟的毒力基因分布情況

3 結(jié)論與討論

我國(guó)鼠傷寒沙門(mén)菌分離株中鼠傷寒沙門(mén)菌單相變異株占32.67%，自2011年來(lái)呈上升趨勢(shì)，尤其值得注意的是其中兒童感染病例占63.29%[9]。由于傳統(tǒng)血清分型方法局限[3]，本案例最終通過(guò)WGS數(shù)據(jù)分析確定分離株血清型，引起該事件的沙門(mén)菌是鼠傷寒沙門(mén)菌單相變異株I4,[5],12:i:-，結(jié)合PFGE分子分型結(jié)果，判定該分離株為引起本次事件暴發(fā)的致病菌。

我國(guó)沙門(mén)菌分離株常見(jiàn)耐藥基因多與磺胺類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)和酚類(lèi)抗生素相關(guān)，最常見(jiàn)的耐藥基因是aph（3’）-IIa、blaCTX-M-55和blaTEM-1B，藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果和基于WGS的表型預(yù)測(cè)結(jié)果往往高度一致[9]，基于WGS的耐藥表型預(yù)測(cè)在指導(dǎo)臨床用藥方面有廣闊的應(yīng)用前景。本案例分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果中阿米卡星及磺胺甲惡唑2種抗生素與WGS耐藥表型預(yù)測(cè)不同，耐藥基因分析結(jié)果顯示存在與2種抗生素對(duì)應(yīng)的耐藥基因，提示可通過(guò)分析這2個(gè)耐藥基因序列，進(jìn)一步探尋其耐藥機(jī)制。

GAO等[10]按照與沙門(mén)菌發(fā)病相關(guān)的4個(gè)關(guān)鍵階段，即附著、入侵、巨噬細(xì)胞內(nèi)存活和系統(tǒng)傳播，對(duì)227個(gè)沙門(mén)菌屬毒力基因進(jìn)行分類(lèi)，4個(gè)階段對(duì)應(yīng)的毒力基因數(shù)量分別是49、73、39和66。毒力相關(guān)基因中，目前共發(fā)現(xiàn)129種不同的毒力因子[9]。劉理慧等[11]提出一般菌株的致病性越強(qiáng)，其攜帶的毒力基因的種類(lèi)和/或數(shù)量越多。結(jié)合本案例毒力基因預(yù)測(cè)結(jié)果推測(cè)，該鼠傷寒沙門(mén)菌單相變異株致病性相對(duì)較弱，引起全身感染性疾病表現(xiàn)概率較低。

在食源性疾病事件調(diào)查中，多病原篩查PCR技術(shù)能夠與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法互補(bǔ)，實(shí)現(xiàn)病原的快速確定，縮短實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)時(shí)間，對(duì)流行病學(xué)調(diào)查有積極的指導(dǎo)意義；PFGE分子分型技術(shù)則一直是致病菌溯源分析的“金標(biāo)準(zhǔn)”，而全基因組測(cè)序技術(shù)能為分析病原的毒力基因、耐藥基因及分子溯源提供更多的病原學(xué)信息。全基因組測(cè)序技術(shù)還可以用于預(yù)測(cè)與毒力、生存壓力或微生物耐藥性相關(guān)的各種遺傳特征，這對(duì)改善食品安全管理和公眾健康有很大益處。