陳瑞蓮 毛維興 劉永紅 張樹武 徐秉良

摘要

通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定了1株殺線木霉D5菌株的種類，并評(píng)價(jià)了其孢子懸浮液和發(fā)酵液對(duì)禾谷孢囊線蟲Heterodera?avenae?2齡幼蟲的毒殺活性。結(jié)果表明，木霉D5菌株為綠色木霉Trichoderma?viride（ITS序列登錄號(hào)：OL661629;TEF序列登錄號(hào)：ON241311）。濃度為1.0×107?cfu/mL的D5菌株孢子懸浮液和發(fā)酵液原液處理2齡幼蟲72?h后，線蟲死亡率分別為85.20?%和86.57?%。在溫度為20～80℃范圍內(nèi)以及pH為2～10時(shí)，發(fā)酵液均具有較高殺線活性。

關(guān)鍵詞

綠色木霉;?鑒定;?禾谷孢囊線蟲;?發(fā)酵液;?殺線活性

中圖分類號(hào)：

S?476

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022184

Identification?of?Trichoderma?strain?D5?and?determination?of?its?nematicidal?activity

CHEN?Ruilian1，?MAO?Weixing1，?LIU?Yonghong1，?ZHANG?Shuwu1，2*，?XU?Bingliang1*

（1.?College?of?Plant?Protection，?Gansu?Agricultural?University，?Lanzhou?730070，?China;?2.?Biocontrol

Engineering?Laboratory?of?Crop?Diseases?and?Pests?of?Gansu?Province，?Lanzhou?730070，?China）

Abstract

The?species?of?Trichoderma?spp.?D5?strain?was?identified?by?morphology?and?molecular?biology?methods，?and?also?the?nematicidal?activity?of?its?spore?suspension，?fermentation?broth?were?evaluated?in?the?present?test.?The?results?showed?that?the?Trichoderma?spp.?D5?strain?was?identified?as?Trichoderma?viride?（ITS?sequence?accession?number：?OL661629;?TEF?sequence?accession?number：?ON241311）.?The?mortality?of?the?secondstage?juveniles?of?nematodes?were?85.20?%?and?86.57?%?72?h?after?treatment?with?the?concentration?of?1.0×107?cfu/mL?spore?suspension?and?fermentation?broth?of?D5?strain，?respectively.?The?highest?nematicidal?activity?of?fermentation?broth?was?found?at?the?temperature?from?20?to?80℃?and?the?pH?value?from?2?to?10.

Key?words

Trichoderma?viride;?identification;?Heterodera?avenae;?fermentation?broth;?nematicidal?activity

禾谷孢囊線蟲Heterodera?avenae?寄主范圍廣泛，可危害多種禾本科作物及牧草［1］。近年來(lái)危害面積不斷擴(kuò)大，已經(jīng)成為麥類作物的主要病害之一，每年造成經(jīng)濟(jì)損失近千億元［2］。目前，對(duì)于禾谷孢囊線蟲的防治主要以化學(xué)防治為主，但化學(xué)農(nóng)藥的大量使用不僅造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留，同時(shí)造成線蟲抗藥性逐漸增強(qiáng)。因此，開(kāi)發(fā)高效安全的生物殺線劑是當(dāng)前研究的主導(dǎo)方向。

木霉是一類廣泛存在于土壤中的習(xí)居菌［34］。Harman等報(bào)道，木霉至少對(duì)18個(gè)屬20余種病原真菌和多種病原細(xì)菌具有拮抗作用［5］。同時(shí)，已有研究表明，多種木霉對(duì)線蟲具有毒殺和寄生作用，如深綠木霉Trichoderma?atroviride、哈茨木霉T.harzianum、絨毛木霉T.tomentosum、綠木霉?T.virens、棘孢木霉?T.asperellum?和長(zhǎng)枝木霉?T.longibrachiatum等對(duì)植物寄生線蟲具有抑制作用，其發(fā)酵液對(duì)線蟲卵和幼蟲體壁有消解作用，可抑制或延遲卵孵化，并使幼蟲體內(nèi)空泡化［67］。此外，Siddiqui等［8］利用綠色木霉、哈茨木霉、康氏木霉T.koningii和擬康氏木霉T.pseudokoningii防治爪哇根結(jié)線蟲Meloidogyne?javanica，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液能明顯降低線蟲卵孵化率并提高對(duì)2齡幼蟲的致死率;馬金慧等［9］研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉TR12發(fā)酵液處理南方根結(jié)線蟲48?h致死率可達(dá)100?%。此外，毛維興［10］報(bào)道了溫度和酸堿度等不同外界因子對(duì)長(zhǎng)枝木霉T.longibrachiatum?T6菌株發(fā)酵液毒殺禾谷孢囊線蟲Heterodera?avenae?2齡幼蟲的殺線活性具有不同程度的影響;彭雙等［11］研究發(fā)現(xiàn)溫度、酸堿度和儲(chǔ)藏時(shí)間等不同外界因子對(duì)枯草芽胞桿菌Bacillus?subtilis和蠟樣芽胞桿菌B.cereus發(fā)酵液殺松材線蟲Bursaphelenchus?xylophilus活性也有不同程度的影響。但是有關(guān)本課題組分離的木霉D5菌株的種類及外界因素對(duì)其殺線活性影響尚未有報(bào)道。

因此，本試驗(yàn)以前期分離的1株木霉D5菌株為研究對(duì)象，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定了其種類，測(cè)定了其對(duì)禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲的毒殺活性及溫度和酸堿度對(duì)其殺線穩(wěn)定性的影響，以便為新型、高效的微生物殺線劑的研制、開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

木霉D5菌株由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病毒學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離并保存。供試線蟲采自河南省小麥禾谷孢囊線蟲發(fā)生較嚴(yán)重的地塊。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?木霉菌株D5形態(tài)學(xué)鑒定

將木霉D5菌株接種于PDA平板上，置于25℃、光周期L∥D=16?h∥8?h的條件下培養(yǎng)2?d后，顯微鏡下觀察其菌絲形態(tài)，培養(yǎng)4?d后待其大量產(chǎn)孢時(shí)，觀察和記錄其菌落形態(tài)、顏色。同時(shí)，在光學(xué)顯微鏡下拍照觀察其分生孢子梗和分生孢子形態(tài)特征，并測(cè)量其分生孢子大小，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)測(cè)量100個(gè)分生孢子，共重復(fù)3次并取其平均值。

1.2.2?木霉菌株D5分子生物學(xué)鑒定

采用CTAB法提取木霉D5菌株基因組DNA，并利用通用引物?ITS1/ITS4和TEFF/TEFR（表1）擴(kuò)增?ITS和TEF片段，引物合成及PCR產(chǎn)物測(cè)序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。然后，將測(cè)序獲得的ITS和TEF序列提交NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，利用MEGA?7軟件和鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（bootstrap=1?000），確定其分類地位，并結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果確定其種類。

1.2.3?木霉D5菌株分生孢子懸浮液和發(fā)酵液制備

參考張樹武等［12］的方法制備木霉D5菌株分生孢子懸浮液和發(fā)酵液。利用血球計(jì)數(shù)板制備濃度為1.0×104～1.0×107?cfu/mL的分生孢子懸浮液。然后，在PDB培養(yǎng)基?（60?mL，pH=7）?中加入1?mL的1.0×107?cfu/mL?D5菌株分生孢子懸浮液，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)7?d后，4℃，12?000?r/min離心20?min，利用0.22?μm孔徑的細(xì)菌過(guò)濾器去除孢子，即獲得無(wú)菌發(fā)酵液原液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4?禾谷孢囊線蟲分離及木霉D5菌株殺線活性測(cè)定

參考張樹武等［13］的方法，采用“漂浮法”分離禾谷孢囊線蟲孢囊和2齡幼蟲，并利用無(wú)菌水配制?（200±10）條/mL的2齡幼蟲懸浮液。

參考張樹武等［14］的方法，利用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板測(cè)定孢子懸浮液和發(fā)酵液的殺線活性，每孔加入10?μL?2齡幼蟲懸浮液和90?μL木霉D5菌株孢子懸浮液或發(fā)酵液，共5個(gè)處理（1.0×104～1.0×107?cfu/mL的分生孢子懸浮液和發(fā)酵液原液）和1個(gè)對(duì)照（無(wú)菌水），每個(gè)處理和對(duì)照均為16個(gè)重復(fù)。然后，分別置于25℃培養(yǎng)箱并每隔24?h在光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計(jì)死亡蟲數(shù)，連續(xù)觀察3?d，計(jì)算線蟲死亡率并進(jìn)行方差分析。

1.2.5?溫度對(duì)木霉D5菌株發(fā)酵液殺線活性的影響

參考張艷軍等［15］的方法略作修改。利用恒溫水浴鍋將50?mL木霉D5發(fā)酵液分別置于20、40、60、80℃和100℃下處理30?min，然后放置冰上待其冷卻至室溫后參照1.2.4方法測(cè)定殺線活性。試驗(yàn)以4℃保存的木霉D5菌株發(fā)酵液作為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，每個(gè)處理和對(duì)照均重復(fù)3次。

1.2.6?酸堿度對(duì)木霉D5菌株發(fā)酵液殺線活性的影響

參考陳超等［16］的方法略作修改。利用鹽酸和氫氧化鈉分別將木霉發(fā)酵液pH調(diào)至2、4、6、8、10和12，4℃放置24?h后，再利用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)至pH=7后參照1.2.4方法測(cè)定殺線活性。試驗(yàn)以4℃保存的木霉D5菌株發(fā)酵液作為陽(yáng)性對(duì)照（自然pH），以無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，每個(gè)處理和對(duì)照均重復(fù)3次。

1.3?數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel?2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，并采用SPSS?23軟件和Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較（P＜0.05）。

2?結(jié)果與分析

2.1?木霉D5菌株形態(tài)學(xué)鑒定

木霉D5菌株在PDA平板上培養(yǎng)初期（1～2?d）形成白色絨狀菌落，有少量白色氣生菌絲，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，菌落逐漸增大，并在菌落表面產(chǎn)生大量綠色分生孢子。培養(yǎng)4?d后，菌落長(zhǎng)滿整個(gè)平皿，菌落背面中央為綠色。菌絲無(wú)色，具有隔膜;分生孢子梗無(wú)色，有對(duì)生或互生分支，分支角度為銳角或近于直角，在分支頂端形成瓶狀小梗，小梗頂端簇生分生孢子;分生孢子多為卵圓形，無(wú)色，大小為（2.8×3.5）μm～（2.8×4.2）μm。結(jié)合其菌落、菌絲、分生孢子梗和分生孢子形態(tài)特征，并參考楊合同主編的《木霉分類與鑒定》［17］，將木霉D5菌株初步鑒定為綠色木霉Trichoderma?viride。

2.2?木霉D5菌株分子生物學(xué)鑒定

凝膠電泳結(jié)果表明，經(jīng)ITS和TEF引物擴(kuò)增分別得到大小約為600?bp（圖2a）和300?bp的條帶（圖2b），并經(jīng)BLAST序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)木霉D5菌株ITS和TEF序列與綠色木霉相似性分別為98.7?%（KY673213.1）和99.83?%（AM498595.1），且ITS（圖3）和TEF（圖4）分別與綠色木霉（KF881775.1）和綠色木霉（AM498579.1）聚為一支。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)檢測(cè)將木霉D5菌株鑒定為綠色木霉Trichoderma?viride（ITS序列GenBank登錄號(hào)：OL661629;TEF序列GenBank登錄號(hào)：ON241311）。

2.3?綠色木霉D5菌株孢子懸浮液及發(fā)酵液殺線活性測(cè)定

不同濃度綠色木霉D5菌株孢子懸浮液和發(fā)酵液對(duì)禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲均具有顯著的毒殺作用。處理24?h后2齡幼蟲開(kāi)始出現(xiàn)死亡，且隨著孢子懸浮液濃度的升高其殺線活性逐漸增強(qiáng)，1.0×107?cfu/mL孢子懸浮液和發(fā)酵原液處理72?h時(shí)線蟲死亡率高，分別為85.20?%和86.57?%，且無(wú)顯著差異（表2）。

2.4?溫度對(duì)綠色木霉D5菌株發(fā)酵液殺線活性的影響

試驗(yàn)表明，綠色木霉D5菌株發(fā)酵液具有較好的溫度穩(wěn)定性，在20～80℃的溫度區(qū)間均具有較高的殺線活性且與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，但當(dāng)溫度繼續(xù)升高至100℃時(shí)，其殺線活性顯著降低，處理線蟲72?h死亡率為77.74?%，與對(duì)照相比降低6.85?%（表3）。

2.5?pH對(duì)綠色木霉D5菌株發(fā)酵液殺線活性的影響

綠色木霉D5菌株發(fā)酵液具有較好的酸堿穩(wěn)定性，發(fā)酵液在pH?2～10條件下處理后，對(duì)禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲均具有較好的毒殺作用，處理線蟲72?h后死亡率均高于77?%，且與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，但是當(dāng)發(fā)酵液在pH?12條件下處理后，其殺線活性顯著降低，處理線蟲72?h后，線蟲死亡率僅為38.96?%（表4）。

3?結(jié)論與討論

木霉作為一種分布廣泛的生防菌，其對(duì)植物寄生線蟲毒殺和寄生作用方面已有相關(guān)報(bào)道，如張樹武等［1819］的研究表明，長(zhǎng)枝木霉T6菌株對(duì)禾谷孢囊線蟲的孢囊、卵及2齡幼蟲均具有較高的防治效果，其孢子懸浮液（1.5×107?cfu/mL）處理2齡幼蟲72?h后死亡率可達(dá)91.3?%，說(shuō)明木霉在防治禾谷孢囊線蟲方面有巨大的應(yīng)用前景［20］。本試驗(yàn)鑒定了一株對(duì)禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲具有較好毒殺作用的綠色木霉D5菌株，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液對(duì)2齡幼蟲的毒殺活性高于孢子懸浮液，并且其發(fā)酵液殺線活性在溫度和不同酸堿度等因素的脅迫下具有較好的穩(wěn)定性。

譚可菲等［21］的研究結(jié)果表明，不同溫度（30～100℃）對(duì)生防菌嗜松青霉Penicillium?pinophilum?SneF8發(fā)酵液毒殺南方根結(jié)線蟲活性無(wú)顯著影響，24?h后其校正死亡率均大于86?%。本試驗(yàn)中綠色木霉D5菌株發(fā)酵液在20～80℃均具有較高的殺線活性，但當(dāng)溫度升高至100℃時(shí)，殺線活性降低，這種差異可能是菌株來(lái)源以及不同發(fā)酵方式引起的。此外，胡紅濤等［22］研究發(fā)現(xiàn)生防菌弗氏鏈霉菌Streptomyces?fradiae?K7發(fā)酵液在80℃處理后對(duì)黃瓜枯萎病菌Fusarium?oxysporum和立枯絲核菌Rhizoctonia?solani的抑菌效果無(wú)顯著差異。趙雅等［23］的研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽胞桿菌B.?velezensis?HNQ8菌株發(fā)酵液在pH?4～10時(shí)，具有良好的穩(wěn)定性，對(duì)立枯絲核菌具有較高的抑菌活性，但是強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性環(huán)境均會(huì)造成其抑菌活性降低，本研究中，綠色木霉D5菌株發(fā)酵液具有良好的酸堿穩(wěn)定性（pH?2～10），這種差異可能是菌株不同造成的。

本研究鑒定了一株具有殺線活性的綠色木霉D5菌株，其發(fā)酵液具有較好的殺線活性且在20℃～80℃和pH?2～12時(shí)具有殺線穩(wěn)定性。目前已從木霉菌中提取的殺線活性物質(zhì)主要有木霉菌素［24］、乙酸［25］和膠酶毒素［26］等，如Yang等［27］研究發(fā)現(xiàn)木霉菌YMF1.00416能夠產(chǎn)生對(duì)秀麗隱桿線蟲?Caenorhabditis?elegans具有較強(qiáng)致死作用的揮發(fā)性有機(jī)物，且其對(duì)秀麗隱桿線蟲處理48?h后，致死率高達(dá)85?%以上。但是，有關(guān)綠色木霉D5菌株殺線活性物質(zhì)鑒定及其殺線作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：田?喆）