田瑩 陳瑞朋 黃天宇 陳國華 王冰 王桂榮

摘要

豌豆蚜Acyrthosiphon?pisum氣味受體家族存在明顯擴張現(xiàn)象，推測在豌豆蚜寄主適應(yīng)過程中起著重要作用。本研究旨在克隆豌豆蚜特異性擴張分支上的氣味受體基因，明確這些氣味受體基因在不同組織中的表達水平。通過PCR技術(shù)克隆特異性擴張分支上氣味受體基因的全長序列，采用實時熒光定量RTqPCR技術(shù)測定這些基因在觸角及足中的表達水平?？寺～@得豌豆蚜特異性擴張分支中4個氣味受體基因全長序列（GenBank?登錄號：OL739156-OL739159），分別編碼374～376個氨基酸，序列相似性較高，為68.09%～83.11%，均具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域。熒光定量RTqPCR結(jié)果顯示ApisOR6、ApisOR8、ApisOR13和ApisOR14基因在豌豆蚜成蟲觸角及足中均有表達，其中ApisOR8、ApisOR13和ApisOR14基因在觸角中偏好表達，ApisOR13基因在觸角中的表達量最高。本研究為解析豌豆蚜特異性擴張氣味受體的功能提供了分子基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞

豌豆蚜;?氣味受體;?選擇壓;?基因克隆;?表達分析

中圖分類號：

S?433.3

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022068

Molecular?cloning?and?expression?analysis?of?specific?expansive?odorant?receptors?clade?in?Acyrthosiphon?pisum?（Hemiptera：?Aphididae）

TIAN?Ying1，2，?CHEN?Ruipeng2，?HUANG?Tianyu2，?CHEN?Guohua1*，?WANG?Bing2*，?WANG?Guirong2

（1.?College?of?Plant?Protection，?Yunnan?Agricultural?University，?Kunming?650201，?China;?2.?State?Key

Laboratory?for?Biology?of?Plant?Diseases?and?Insect?Pests，?Institute?of?Plant?Protection，?Chinese

Academy?of?Agricultural?Sciences，?Beijing?100193，?China）

Abstract

Gene?family?expansions?of?odorant?receptors?（OR）?were?found?in?the?pea?aphid，?Acyrthosiphon?pisum，?and?might?play?a?vital?role?in?the?host?plant?adaptation.?This?study?aims?to?clone?odorant?receptor?genes?of?a?specific?expansive?OR?clade，?and?to?assay?their?expression?levels?in?different?adult?tissues.?PCR?was?used?to?clone?the?fulllength?cDNA?sequences?of?four?OR?genes.?Realtime?quantitative?PCR?（RTqPCR）?was?used?to?assess?the?expression?patterns?of?specific?expansive?OR?genes?in?antennae?and?legs.?The?fulllength?cDNA?sequences?of?four?OR?genes?（GenBank?accession?no.：?OL739156-OL739159）?of?the?specific?expansive?OR?clade?in?A.pisum?were?cloned，?encoding?374-376?amino?acids，?having?the?high?sequence?similarities?from?68.09?%?to?83.11?%?and?all?containing?seven?transmembrane?domains.?The?RTqPCR?results?showed?that?the?four?OR?genes?were?expressed?in?both?antennae?and?legs?of?A.pisum?adult，?among?which，?ApisOR8，?ApisOR13，?and?ApisOR14?bias?to?express?in?the?antennae，?and?the?ApisOR13?has?the?highest?expression?level?in?the?antennae.?This?study?provides?a?basis?for?revealing?the?molecule?mechanism?of?specific?expansion?ORs?in?A.pisum.

Key?words

Acyrthosiphon?pisum;?odorant?receptor;?selection?pressure;?gene?cloning;?expression?level?analysis

昆蟲的嗅覺在寄主定位、產(chǎn)卵場所選擇、配偶選擇和危害逃避等方面起著至關(guān)重要的作用［1］。昆蟲能夠通過靈敏的嗅覺系統(tǒng)識別數(shù)千種不同化學信號以感知其周圍環(huán)境［2］。觸角是昆蟲主要的嗅覺感受器官，其表面分布著多種類型的感器，氣味分子通過感器表面的極孔進入到淋巴液中，與氣味結(jié)合蛋白（odorant?binding?protein，?OBP）結(jié)合后被運輸至感覺神經(jīng)元樹突膜上，激活神經(jīng)元樹突膜上表達的氣味受體（odorant?receptor，?OR）后，將化學信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，在昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)中加工整合，引起昆蟲的一系列行為反應(yīng)［27］。

氣味受體是一種疏水性膜蛋白，一般具有7個跨膜區(qū)域，具有300～500個氨基酸。昆蟲的氣味受體結(jié)構(gòu)與脊椎動物G蛋白偶聯(lián)受體相反，其N端位于細胞內(nèi)，C端位于細胞外［4，?8］。對于昆蟲OR的研究可追溯至1999年，第一個昆蟲OR在黑腹果蠅Drosophila?melanogaster中被鑒定出來［9］，隨著測序技術(shù)和生物信息學的快速發(fā)展，許多種昆蟲的基因組被公布，例如岡比亞按蚊Anopheles?gambiae［10］、意大利蜜蜂Apis?mellifera［11］、埃及伊蚊Aedes?aegypti［12］、赤擬谷盜Tribolium?castaneum?Herbst［13］、豌豆蚜Acyrthosiphon?pisum［14］等，并且越來越多的昆蟲的OR基因得以分析鑒定?；蚪M鑒定的OR多樣性與昆蟲生態(tài)學作用密切相關(guān)，包括昆蟲遺傳多態(tài)性和種間隔離，昆蟲與植物之間復(fù)雜的化學通訊，以及昆蟲的生態(tài)位分化及適應(yīng)性進化等［1523］。因此，OR被作為昆蟲進化生物學研究的重要模型，對昆蟲OR的進化研究有助于揭示化學生態(tài)學機制。

豌豆蚜Acyrthosiphon?pisum是第一個全基因組測序的半變態(tài)發(fā)育的模式生物［24］。目前已有染色體級別的豌豆蚜基因組可供研究者使用［25］。隨著豌豆蚜基因組測序質(zhì)量的不斷提高，對于豌豆蚜氣味受體的注釋分析也在更迭變化。Smadja等率先在第一版豌豆蚜基因組中鑒定了79個ORs基因，與其他蚜蟲ORs基因相比，基因數(shù)量顯著增多［14］。隨后，Robertson等［26］根據(jù)較高質(zhì)量的豌豆蚜和大豆蚜Aphis?glycines基因組和轉(zhuǎn)錄組對ORs基因進一步注釋，完善并更正了Smadja等［14］的注釋結(jié)果，所注釋的OR數(shù)量增加至87個，以上系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明了豌豆蚜氣味受體家族正在經(jīng)歷快速擴張的現(xiàn)象。

基因家族的擴張和收縮與導致遺傳變化的進化壓力密切相關(guān)。正選擇基因在適應(yīng)性進化中十分重要［27］，正選擇作為基因進化的主要驅(qū)動力推動著物種有利突變的遺傳，也有助于揭示物種復(fù)雜的適應(yīng)性表型的內(nèi)在遺傳機制［2835］。氣味受體在嗅覺感受過程中扮演著重要角色，處于正選擇狀態(tài)下的氣味受體基因很可能與昆蟲種群分化或者生態(tài)適應(yīng)性改變有關(guān)，基因新拷貝在適應(yīng)性進化驅(qū)動下獲得新的功能［3637］。處于正選擇狀態(tài)下的豌豆蚜氣味受體擴張分支的存在原因及意義同樣值得探究。Smadja等使用PAML軟件對豌豆蚜所有擴張的氣味受體分支進化壓和正選擇位點進行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豌豆蚜氣味受體的兩個擴張分支Clade?A和Clade?B處于正選擇狀態(tài)，除去假基因以外，擴張分支Clade?A中有17個OR基因，Clade?B中有8個OR基因，它們明顯經(jīng)歷了相對較新的基因復(fù)制［14］。這些基因的功能尚未明確，有待于進一步的研究。

本研究以Smadja等［14］分析的豌豆蚜氣味受體擴張現(xiàn)象作為研究背景，對OR擴張分支Clade?B中的氣味受體基因的表達模式進行初步探究。我們將處于正選擇狀態(tài)的Clade?B分支定名為OR6分支，采用PCR技術(shù)克隆了ApisOR6、ApisOR8、ApisOR13和ApisOR14這4個全長基因，通過熒光定量RTqPCR技術(shù)對克隆的4個基因在觸角及足中的表達譜進行分析，以期為進一步研究豌豆蚜氣味受體產(chǎn)生特異性擴張分支的原因及機制奠定必要的基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?供試蟲源及處理方法

本試驗蟲源為中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所昆蟲功能基因組飼養(yǎng)的豌豆蚜種群。使用土培蠶豆幼苗在人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)豌豆蚜，飼養(yǎng)條件：溫度?（21±2）℃，相對濕度?（70±5）%，光周期L∥D=16∥8?h。在此條件下豌豆蚜穩(wěn)定地進行孤雌生殖。

豌豆蚜組織樣品的準備：用鑷子將豌豆蚜成蟲觸角和足取下，立即放入液氮中暫存，立即提取組織總RNA或者轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。以相同方式收集不同批次的豌豆蚜組織樣品3組，每組觸角和足分別取自300頭和200頭豌豆蚜成蟲。

1.2?總RNA提取與cDNA合成

使用微量總RNA提取試劑盒（天漠生物）按照說明書步驟提取豌豆蚜成蟲觸角和足2個部位的總RNA。利用NanoDrop?2000檢測總RNA的濃度，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。使用Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書合成用于基因克隆及qPCR的cDNA，放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3?引物設(shè)計

基于豌豆蚜基因組及生物信息學分析，選擇豌豆蚜特異性擴張OR6分支上具有全長cDNA序列的4個氣味受體ApisOR6，?ApisOR8，?ApisOR13和ApisOR14進行基因克隆和表達量分析。利用Primer?Premier?5.0和Beacon?Designer?8分別設(shè)計基因克隆引物和實時熒光定量引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

1.4?基因克隆

以豌豆蚜的觸角cDNA為模板，利用特異性引物（表1）克隆ApisOR6、ApisOR8、ApisOR13和ApisOR14基因全長序列。50?μL反應(yīng)體系：2?×?PrimeSTAR?Mix（含DNA?Polymerase，?Buffer，?dNTP?Mixture）25?μL，正向和反向引物（10?μmol/L）各2?μL，cDNA模板?1?μL，ddH2O?20?μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性15?s;98℃變性10?s，50℃/55℃/56℃退火10?s，72℃延伸1?min，35個循環(huán);72℃延伸2?min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用膠回收試劑盒（全式金生物技術(shù)有限公司，北京）回收目的條帶。將回收后的PCR產(chǎn)物連接到pEASYBlunt克隆載體（全式金生物技術(shù)有限公司，北京）上，再轉(zhuǎn)入Trans1T1感受態(tài)細胞（全式金生物技術(shù)有限公司，北京），涂布到含有IPTG和Xgal的LB固體培養(yǎng)基（氨芐青霉素?50?μg/mL）上，37℃培養(yǎng)過夜。經(jīng)藍白斑篩選，挑取單個陽性克隆在含有50?μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中以200?r/min，?37℃，過夜培養(yǎng)，菌液送往北京六合華大基因科技有限公司進行測序。

1.5?序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

測序結(jié)果由DNAMAN軟件完成拼接;利用EXPASY蛋白質(zhì)組學網(wǎng)站（https：∥www.expasy.org）的翻譯工具Translate?tool?（https：∥web.expasy.org/translate）將核酸序列翻譯成氨基酸序列;使用TMHMM2.0網(wǎng)站?（http：∥www.cbs.dtμ.dk/services/TMHMM）預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域;使用Clustal?X??2.0軟件進行氨基酸序列比對［38］。

使用RaxML?8.0構(gòu)建豌豆蚜特異性擴張分支氣味受體的進化樹，氨基酸替換模型為JonesTaylorThornton（JTT），步長檢驗（Bootstrap）為1?000。建樹用的豌豆蚜、大豆蚜以及棉蚜Aphis?gossypii的氣味受體序列來源于Huang等［39］的數(shù)據(jù)。

1.6?實時熒光定量RTqPCR

以豌豆蚜成蟲觸角和足cDNA為模板，以ApisNADH和ApisSDHB基因為內(nèi)參［40］，利用特異性引物（表1）通過RTqPCR技術(shù)檢測ApisOR6、ApisOR8、ApisOR13和ApisOR14的表達水平。反應(yīng)體系15?μL：

上、下游引物各0.6?μL，cDNA?0.75?μL，ddH2O?5.25?μL，50×Passive?Reference?Dye?0.3?μL，2×PerfectTM?Green?qPCR?SuperMix?7.5?μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2?min;95℃變性5?s，58℃退火34?s，72℃延伸10?s，40個循環(huán)。所有樣品均使用獨立的RNA進行3次重復(fù)，每個基因的標準曲線包含至少5個濃度值，以評估PCR的擴增效率，保證單個基因的擴增效率在90%至110%之間。

1.7?數(shù)據(jù)分析

對OR6分支4個氣味受體在不同組織中的相對表達量進行數(shù)據(jù)分析?；虻南鄬Ρ磉_量計算采用2-ΔΔCt法，計算公式為ΔCt=Ct目標基因-Ct內(nèi)參基因;ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt參照物。利用SPSS軟件對不同組織間的表達水平進行獨立樣本t測驗，對4個基因相對表達量差異進行單因素方差分析，利用GraphPad軟件作圖。

2?結(jié)果與分析

2.1?豌豆蚜OR6分支4個氣味受體基因克隆、序列分析與系統(tǒng)發(fā)育分析

基于Smadja等［14］分析的豌豆蚜氣味受體擴張分支Clade?B?（我們命名為OR6分支）中的氣味受體基因序列，我們選擇具有全長開放閱讀框的ApisOR6、ApisOR8、ApisOR13和ApisOR14進行基因克隆，獲得這4個基因的cDNA全長序列。4個氣味受體基因的開放閱讀框全長分別為1?122、1?128、1?122?bp和1?125?bp，編碼374、376、374個和375個氨基酸。通過序列比對發(fā)現(xiàn)這4個氣味受體基因的序列相似度較高，核苷酸序列一致性為82.76%～92.69%，氨基酸序列相似性為68.09%～83.11%。其中ApisOR6和ApisOR13的序列一致性最高，核苷酸序列一致性為92.69%，氨基酸序列一致性為83.11%。利用TMHMM2.0網(wǎng)站預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)4個氣味受體均具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域（圖1）。

選擇豌豆蚜、大豆蚜和棉蚜中已注釋的OR構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），結(jié)果顯示豌豆蚜OR中具有2個氣味受體擴張分支Clade?A和Clade?B?（OR6分支），這與Smadja等［14］的分析結(jié)果相對應(yīng)。在OR6分支上的氣味受體中ApisOR6和ApisOR14距離較近，ApisOR8和ApisOR13與ApisOR6關(guān)系較遠。

2.2?4個氣味受體基因在豌豆蚜成蟲不同組織中的表達模式

利用實時熒光定量RTqPCR方法檢測豌豆蚜OR6分支ApisOR6，ApisOR8，ApisOR13和ApisOR14基因在豌豆蚜成蟲觸角和足中的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示4個ORs基因在豌豆蚜成蟲觸角及足中均有表達，其中ApisOR8、ApisOR13和ApisOR14這3個基因在觸角中的表達量均極顯著高于足中的表達量（P?0.05）（圖3）。對不同基因在觸角中的表達水平進行進一步分析，結(jié)果顯示ApisOR6、ApisOR8、ApisOR13和ApisOR14基因在觸角中的相對表達量有顯著差異，其中ApisOR13的表達量最高，ApisOR8的表達量最低（圖4）。

3?結(jié)論與討論

本研究克隆得到了豌豆蚜OR6特異性擴張分支上4個氣味受體ApisOR6、ApisOR8、ApisOR13和ApisOR14的全長序列。對跨膜區(qū)域的預(yù)測結(jié)果顯示，4個氣味受體均具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域，符合昆蟲氣味受體典型的二級結(jié)構(gòu)特征。序列分析結(jié)果顯示，豌豆蚜OR6分支上這4個氣味受體的核苷酸及氨基酸序列的一致性較高，表明這些基因可能存在基因復(fù)制事件。根據(jù)已報道的研究結(jié)果，我們推測這些受體在進化過程中可能具有不同的功能，是因為它們氨基酸序列具有一定的分化，進而導致嗅覺受體功能的改變［41］。系統(tǒng)發(fā)育進化樹的分析結(jié)果表明，ApisOR8、ApisOR13、ApisOR6和ApisOR14?4個氣味受體聚集在一支，其中ApisOR6和ApisOR14距離更近，表明它們的序列相似性更高，可能功能更接近;我們推測ApisOR14、ApisOR13和ApisOR6可能是由?ApisOR8?分化出來的，ApisOR13和ApisOR8可能與ApisOR6存在功能差異，但這一推論需要通過進一步的功能驗證。

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，ApisOR6、ApisOR8、ApisOR13和ApisOR14這4個氣味受體基因在豌豆蚜成蟲的觸角及足中均有表達，在組織表達模式上存在一定差異?；虻谋磉_水平較高往往表示該基因在維持正常生理狀態(tài)中發(fā)揮著重要作用［39，?4244］，ApisOR8、ApisOR13和ApisOR14基因在觸角中偏好表達，表明這3個氣味受體在豌豆蚜的嗅覺識別過程中起到一定的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在嗅覺識別過程中發(fā)揮重要作用的氣味受體其功能與其表達模式有密切聯(lián)系［45－46］，ApisOR13基因在觸角中的表達量最高，推測ApisOR13在豌豆蚜正常嗅覺識別中可能發(fā)揮著相對重要的作用。OR6分支基因表達模式的分析為豌豆蚜基因組中氣味受體擴張分支基因功能的研究奠定了一定的分子基礎(chǔ)。

豌豆蚜基因組的發(fā)表為揭示該物種在寄主選擇、適應(yīng)性進化和生態(tài)物種形成等方面提供了研究基礎(chǔ)［14，?2426，?4749］。對豌豆蚜氣味受體家族的分析結(jié)果顯示有兩個特異性擴張分支受到了正選擇壓力的影響，其進化機制及形成原因尚不清楚，推測可能與豌豆蚜對寄主植物等生存環(huán)境識別的進化特點有關(guān)，即蚜蟲對新寄主的適應(yīng)可能來自于正選擇驅(qū)動的化學感受基因的適應(yīng)性進化。另外，處于進化中的基因一般涉及較多的生物學功能，表明在進化過程中這種新功能的分化很可能是隨著基因的進化而產(chǎn)生的［17，?49］。氣味受體基因家族的進化從嗅覺識別的角度反映了物種化學感受的生態(tài)適應(yīng)性，對豌豆蚜OR6分支氣味受體基因的克隆與表達模式分析是解析氣味受體家族特異性擴張現(xiàn)象的第一步，也是探究豌豆蚜生物進化和群體遺傳學的關(guān)鍵，為研究半翅目物種的化學感受進化機制奠定了分子基礎(chǔ)。

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（責任編輯：田?喆）