龔成慧 渠成 魏亦云 王然 羅晨 石旺鵬

摘要

為明確Cry3Aa蛋白對(duì)黃曲條跳甲成蟲的致死效果及作用機(jī)理，采用浸葉法測(cè)定了黃曲條跳甲成蟲取食Cry3Aa蛋白后的死亡情況，并利用透射電鏡觀察了Cry3Aa蛋白處理后成蟲中腸組織的病理學(xué)變化。結(jié)果顯示，取食濃度為2?mg/mL的Cry3Aa蛋白6?d和12?d后黃曲條跳甲成蟲的死亡率分別為33.33%和77.78%;透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，蛋白處理后成蟲中腸發(fā)生了明顯的病理變化，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，病理變化更加明顯，主要表現(xiàn)為：柱狀細(xì)胞變形、細(xì)胞間隙增大、微絨毛縮短并腫脹、線粒體變形、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹。本研究表明黃曲條跳甲成蟲中腸是Cry3Aa蛋白的重要作用部位，研究結(jié)果為揭示Cry3Aa蛋白對(duì)黃曲條跳甲成蟲的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞

黃曲條跳甲;?Cry3Aa蛋白;?致死效果;?中腸組織;?病理變化

中圖分類號(hào)：

S?433.5;?S?476.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022182

Pathological?changes?in?the?midgut?of?Phyllotreta?striolata?adults?after?feeding?on?Cry3Aa

GONG?Chenghui1，2，?QU?Cheng1，?WEI?Yiyun1，?WANG?Ran1，?LUO?Chen1*，?SHI?Wangpeng2*

（1.?Institute?of?Plant?Protection，Beijing?Academy?of?Agriculture?and?Forestry?Sciences，?Beijing?100097，?China;

2.?College?of?Plant?Protection，China?Agricultural?University，?Beijing?100083，?China）

Abstract

In?order?to?clarify?the?lethal?effect?and?mechanism?of?Cry3Aa?protein?on?adults?of?Phyllotreta?striolata，the?mortality?of?adults?fed?with?Cry3Aa?protein?was?determined?by?leaf?dipping?method，and?the?pathological?changes?of?midgut?tissue?of?adults?were?observed?by?transmission?electron?microscopy.?The?results?showed?that?the?mortality?rates?of?adults?fed?with?Cry3Aa?protein?at?2?mg/mL?were?33.33%?and?77.78%?after?six?days?and?12?days，respectively.?Obvious?pathological?changes?were?observed?in?the?midgut?of?adult?treated?with?protein?by?transmission?electron?microscopy，and?the?pathological?changes?became?more?obvious?with?the?extension?of?time，mainly?including?deformation?of?columnar?cells，enlargement?of?intercellular?space，?shortening?and?swelling?of?microvilli，deformation?of?mitochondria?and?swelling?of?endoplasmic?reticulum.?The?above?results?showed?that?the?midgut?of?P.?striolata?adults?was?the?important?action?site?of?Cry3Aa?protein.?This?study?laid?a?foundation?for?the?mechanism?study?of?Cry3Aa?protein?on?P.?striolata?adults.

Key?words

Phyllotreta?striolata;?Cry3Aa?protein;?lethal?effect;?midgut?tissue;?pathological?change

黃曲條跳甲Phyllotreta?striolata屬鞘翅目Coleoptera葉甲科Chrysomelidae，是我國(guó)十字花科作物的重要害蟲，喜食油菜、芥菜、白菜等［12］，以成蟲和幼蟲取食為害，成蟲常聚集在蔬菜葉片背面取食，造成葉片穿孔，影響光合作用，也可取食莖、葉柄、花或頂端分生組織，導(dǎo)致植株萎蔫死亡;幼蟲在地下蛀蝕根皮，咬斷須根，導(dǎo)致植株萎蔫，還可傳播十字花科軟腐病，影響經(jīng)濟(jì)價(jià)值［3］。隨著種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整和設(shè)施栽培的推廣，其發(fā)生為害逐年加重，在廣東的為害面積已超過小菜蛾P(guān)lutella?xylostella。黃曲條跳甲成蟲善跳躍，卵、幼蟲、蛹土棲，導(dǎo)致防治困難，加之長(zhǎng)期不合理的施用化學(xué)農(nóng)藥使其產(chǎn)生了極高的抗性。

蘇云金芽胞桿菌Bacillus?thuringiensis（Bt）是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，會(huì)形成伴孢晶體蛋白［45］，其致病作用依賴于殺蟲蛋白，如Cry蛋白［6］。Cry蛋白對(duì)靶標(biāo)昆蟲特異性強(qiáng)，對(duì)人類、脊椎動(dòng)物、植物無(wú)害，可全部生物降解［7］，是替代化學(xué)農(nóng)藥的重要生物防治產(chǎn)品。Cry蛋白在對(duì)鱗翅目害蟲的防治中已有廣泛應(yīng)用，對(duì)鞘翅目害蟲防治的應(yīng)用亦逐漸增多。目前Cry3、Cry5、Cry7和Cry8等Cry蛋白均可用于防治鞘翅目昆蟲，但Cry3Aa蛋白效果最好，專一性最強(qiáng)［8］。

Cry蛋白被昆蟲攝入中腸腸腔后，會(huì)被中腸堿性環(huán)境激活，穿過圍食膜，與中腸刷狀緣膜囊泡（brash?border?membrane?vesicle，?BBMV）上的受體蛋白結(jié)合，造成細(xì)胞穿孔、中腸溶解、昆蟲死亡［7，?9］。鱗翅目昆蟲幼蟲取食Bt蛋白后中腸組織會(huì)發(fā)生明顯的病理學(xué)變化。如棉鈴蟲Helicoverpa?armigera取食含?Bt?蛋白（Cry1Ac或?Cry2Ab?或?Vip3Aa）的飼料后，其中腸微絨毛會(huì)腫脹、脫落，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會(huì)出現(xiàn)斷裂、變形等現(xiàn)象［1012］。鞘翅目昆蟲取食Bt蛋白后亦有類似的組織病理變化，如：大黑鰓金龜Holotrichia?oblita取食Bt?HBF18、FCD114、QDL402等菌株后中腸腸壁細(xì)胞出現(xiàn)變形、排列疏松、空洞等現(xiàn)象［13］;暗黑鰓金龜Holotrichia?parallela取食Bt菌株HD8E和HD8G后中腸出現(xiàn)微絨毛脫落、細(xì)胞間隙增大、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、線粒體變形等現(xiàn)象［14］;黃曲條跳甲取食Bt菌株HA和HD會(huì)導(dǎo)致其中腸微絨毛腫脹、底膜脫落［15］。

蘇云金芽胞桿菌菌株G033A于2007年獲得國(guó)家發(fā)明專利授權(quán)，于2017年在我國(guó)登記用于防治黃曲條跳甲，取食G033A中Cry3Aa蛋白后中腸組織的病理變化尚未見報(bào)道。因此，本研究在測(cè)定Cry3Aa蛋白對(duì)黃曲條跳甲成蟲殺蟲活性的基礎(chǔ)上，利用透射電鏡觀察了Cry3Aa蛋白對(duì)成蟲中腸組織造成的病理學(xué)影響，為進(jìn)一步明確Cry3Aa蛋白的作用機(jī)制和更好地應(yīng)用于生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?供試材料

黃曲條跳甲種群采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地，在北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所養(yǎng)蟲室內(nèi)用油菜（品種：‘夏綠2號(hào)）飼養(yǎng)2代后取羽化后3?d的成蟲試驗(yàn)。飼養(yǎng)溫度為（26±1）℃，濕度為（75±5）%，光周期L∥D=16?h∥8?h。

Cry3Aa蛋白購(gòu)于美延（北京）農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司;ME204型電子天平，梅特勒托利多儀器（上海）有限公司;SZM42型體視顯微鏡，奧斯微光學(xué)儀器有限公司;HT7800型透射電子顯微鏡，日立高新技術(shù)公司。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?Cry3Aa蛋白對(duì)黃曲條跳甲成蟲的致死效果

采用浸葉法測(cè)定Cry3Aa蛋白對(duì)黃曲條跳甲成蟲的致死效果。將Cry3Aa蛋白用50?mmol/L?Na2CO3溶液稀釋成2、1、0.5、0.25、0.125?mg/mL?5個(gè)濃度。

選取溫室種植的新鮮無(wú)蟲孔帶根的健壯10葉期油菜洗凈晾干，油菜去掉嫩心處葉片，僅留最外層2～3片葉，浸葉2?min后自然風(fēng)干，

每處理3個(gè)重復(fù)，以不做任何處理的油菜為空白對(duì)照。

將上述處理過的油菜單株栽種于育苗盆（上口徑90?mm，底徑60?mm，高65?mm）中，用封口膜將育苗盆封住（避免昆蟲與土壤接觸），并在封口膜上扎孔透氣，外邊罩上一次性塑料瓶，每瓶接入饑餓處理24?h的黃曲條跳甲成蟲10頭，瓶口用紗布包住。每24?h觀察1次黃曲條跳甲死亡情況，連續(xù)觀察14?d。輕觸無(wú)明顯反應(yīng)的試蟲視為死亡。

1.2.2?成蟲中腸組織樣品處理及電鏡觀察

黃曲條跳甲成蟲處理方法同1.2.1，處理濃度為2?mg/mL，取樣時(shí)間為處理后6?d和12?d。用自制吸蟲器吸取成蟲，每處理取至少3頭放入50?mL離心管中，饑餓24?h后置于冰上解剖。用滅菌解剖鑷去除成蟲足、翅和頭部，使成蟲背面朝上，沿背側(cè)線輕輕撕開體壁，去除氣管、脂肪、肌肉等，取出黃曲條跳甲成蟲腸道，截取中腸（中腸位于胃盲囊和馬氏管中間）（圖1），用1?mL預(yù)冷的0.15?mol/L?NaCl溶液漂洗3次后，放入固定液中固定2?h。送至中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)研究中心制作切片（超薄、橫切）進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.3?數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel?2003進(jìn)行整理，計(jì)算校正死亡率，用Graphpad?Prism?5作圖軟件繪制折線圖。

死亡率=死亡蟲數(shù)/處理總蟲數(shù)×100%；

校正死亡率=（處理組死亡率-空白對(duì)照組死亡率）/（1-空白對(duì)照組死亡率）×100%。

2?結(jié)果與分析

2.1?Cry3Aa蛋白對(duì)黃曲條跳甲成蟲的致死效果

取食Cry3Aa蛋白后6?d和12?d，黃曲條跳甲成

蟲的校正死亡率隨著Cry3Aa蛋白濃度的降低而逐漸降低（圖2）。處理，2?mg/mL處理后6?d和12?d，成蟲校正死

亡率分別為33.33%和77.78%。

2.2?取食Cry3Aa蛋白6?d和12?d后黃曲條跳甲成蟲中腸柱狀細(xì)胞及細(xì)胞間隙變化

對(duì)照組成蟲中腸腸壁柱狀細(xì)胞形狀規(guī)整，細(xì)胞飽滿，內(nèi)容物多，排列緊密，細(xì)胞間隙小或沒有細(xì)胞間隙（圖3a）。Cry3Aa蛋白處理后6?d，細(xì)胞出現(xiàn)破裂、變形現(xiàn)象，有部分細(xì)胞內(nèi)容物散入腸腔，細(xì)胞排列相對(duì)疏松，細(xì)胞間隙變大（圖3b）。處理后12?d，中腸細(xì)胞排列混亂，形態(tài)難以辨別，細(xì)胞內(nèi)容物大量散落至腸腔中，細(xì)胞間隙大，腸道穿孔（圖3c）。

2.3?取食Cry3Aa蛋白6?d和12?d后黃曲條跳甲成蟲中腸細(xì)胞微絨毛的變化

對(duì)照組成蟲中腸腸壁柱狀細(xì)胞頂部的微絨毛細(xì)長(zhǎng)，數(shù)量較多，排列整齊有序（圖4a）。Cry3Aa蛋白處理后6?d，成蟲中腸微絨毛腫脹變粗，長(zhǎng)度明顯變短（圖4b）。處理后12?d成蟲中腸微絨毛同樣表現(xiàn)為腫脹、變粗、變短，與處理6?d無(wú)明顯差異（圖4c）。

2.4?取食Cry3Aa蛋白6?d和12?d后黃曲條跳甲成蟲中腸細(xì)胞線粒體的變化

對(duì)照組成蟲中腸腸壁柱狀細(xì)胞線粒體呈橢圓形或紡錘形，輪廓完整，雙層膜結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)脊可見（圖5a）。Cry3Aa蛋白處理后6?d，成蟲中腸少量線粒體出現(xiàn)變形現(xiàn)象，線粒體被拉長(zhǎng)、變細(xì)，輪廓相對(duì)不完整，但仍然可見雙層膜結(jié)構(gòu)（圖5b）。處理12?d后，成蟲中腸線粒體變形更加嚴(yán)重，線粒體集中且偏向于細(xì)胞邊緣，或集中散落至腸腔，輪廓不清晰（圖5c）。

2.5?取食Cry3Aa蛋白后6?d和12?d黃曲條跳甲成蟲中腸細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化

結(jié)果如圖6所示，對(duì)照組成蟲中腸腸壁柱狀細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈扁平囊狀，排列整齊（圖6a）。蛋白處理后6?d，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輪廓不清晰，輕微腫脹，整體上看較為模糊（圖6b）。蛋白處理后12?d，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，整體上非常模糊，已無(wú)法明確觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的具體構(gòu)造（圖6c）。

3?結(jié)論與討論

已有研究表明，Cry3Aa蛋白主要對(duì)鞘翅目昆蟲起作用，如對(duì)谷蠹Rhyzopertha?dominica［16］和椰心葉甲Brontispa?longissima［17］均有較好的致死效果。黃曲條跳甲幼蟲在地下為害，成蟲取食地上部植物葉片。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Cry3Aa蛋白對(duì)黃曲條跳甲成蟲有一定的致死作用，在田間施用Cry3Aa蛋白防治黃曲條跳甲成蟲也可有效降低下一代幼蟲的數(shù)量，從而起到防治效果。

Bt?Cry蛋白經(jīng)昆蟲攝入后，在其體內(nèi)被活化，會(huì)與昆蟲中腸上皮的靶標(biāo)結(jié)合，造成細(xì)胞穿孔，引起昆蟲中腸超微結(jié)構(gòu)發(fā)生病理學(xué)變化，導(dǎo)致昆蟲死亡［18］。Sousa等［19］、Cunha等［20］的研究也證明Cry蛋白會(huì)造成昆蟲中腸的病理學(xué)變化，例如中腸細(xì)胞變形、細(xì)胞間隙增大、微絨毛腫脹變粗、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹變形。

本研究使用透射電鏡觀察Cry3Aa蛋白處理后黃曲條跳甲中腸，發(fā)現(xiàn)其柱狀細(xì)胞變形、細(xì)胞間隙變大、微絨毛腫脹脫落、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹變形、邊界不清晰。在鱗翅目昆蟲中，如棉鈴蟲［11］、歐洲玉米螟Ostrinia?nubilalis［21］、黏蟲Mythimna?separata［21］、二點(diǎn)委夜蛾Athetis?lepigone［22］等昆蟲經(jīng)Cry蛋白處理后其中腸上皮柱狀細(xì)胞、微絨毛等組織都發(fā)生了明顯的變化，表現(xiàn)為微絨毛脫落、杯狀細(xì)胞和柱狀細(xì)胞變形、邊界模糊、線粒體等細(xì)胞器變形等病理學(xué)變化，本研究得到了類似的結(jié)果。但鞘翅目中并無(wú)杯狀細(xì)胞（主要存在于鱗翅目和毛翅目幼蟲），因此本研究中所說(shuō)的細(xì)胞變化僅指柱狀細(xì)胞。在鞘翅目中，Bt菌株HD8E和HD8G對(duì)暗黑鰓金龜［14］、?BtHA和BtHD菌株對(duì)黃曲條跳甲［15］、?Bt?HBF1菌株對(duì)銅綠異麗金龜Anomala?corpulenta［23］等中腸病理學(xué)變化都與本研究結(jié)果一致。宋健等的研究發(fā)現(xiàn)隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，昆蟲中腸病理變化更加顯著且嚴(yán)重，本研究結(jié)果也與其一致［23］。以上研究均可證明使用Bt處理不同目的昆蟲，都會(huì)導(dǎo)致昆蟲中腸發(fā)生病理學(xué)變化，這也驗(yàn)證了Bt蛋白主要作用于昆蟲中腸，與昆蟲中腸上特異位點(diǎn)結(jié)合，相互作用后導(dǎo)致昆蟲中腸穿孔這一理論。但本試驗(yàn)僅為對(duì)Cry3Aa蛋白對(duì)黃曲條跳甲致死作用的初步研究，還需開展進(jìn)一步分子生物學(xué)相關(guān)研究，明確Bt?Cry蛋白與黃曲條跳甲中腸受體作用機(jī)制，為Cry3Aa蛋白的田間應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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