王曉爽， 劉藝潔， 丁 雪， 李林隆， 李海林， 趙 薇， 王 銀，丁玉梅， 苗珍花

（1.寧夏醫(yī)科大學，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院中醫(yī)科，銀川 750004）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是以進行性癡呆為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變疾病，其患病率不僅與年齡增長密切相關，而且呈現(xiàn)性別差異[1]；女性絕經(jīng)后AD 的發(fā)病率是同齡男性的1.5～3 倍[2-3]。卵巢切除術已被提出作為手術絕經(jīng)的實驗模型[4]。AD 發(fā)病機制復雜，目前提出了有關AD 的若干學說，如β-淀粉樣蛋白級聯(lián)假說、膽堿能假說、自由基學說、免疫學說、細胞衰老學說等[5]，但無一假說能完整解釋AD的發(fā)病機制。由此，對于AD 的治療，目前觀點認為針對單一靶點的防治策略難以取得滿意療效，多靶點綜合干預才是提高AD 防治水平的重要策略[6]。中藥具有通過多途徑、多環(huán)節(jié)和多靶點發(fā)揮作用的特點，因此其在防治AD 這類多因素復雜疾病方面具有明顯的優(yōu)勢。研究[7]表明，枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharides，LBP）具有增強免疫、抗衰老、抗氧化等多種生物學活性，尤其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的應用日益受到重視。

長期以來，AD 的病理改變研究主要集中在海馬、前額葉等端腦區(qū)域，小腦不僅與運動有關，而且參與了認知加工，包括注意轉換、語言、圖像、決策和推理以及認知控制[8-10]。LBP 對AD 動物模型的學習記憶行為和海馬炎性因子表達有改善作用[11]，LBP 對AD 小腦的作用目前報道較少。因此本研究在前期實驗結果的基礎上，選用12 周齡C57BL/6J 去勢小鼠進行干預，觀察LBP對其小腦及學習記憶能力改變的影響，旨在為枸杞多糖防治女性AD 方面提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

LBP 購自寧夏沃福百瑞生物食品工程有限公司；曠場實驗、新物體識別實驗及Morris 水迷宮實驗所用儀器和分析系統(tǒng)均由深圳瑞沃德生物科技有限公司提供；雌二醇（estradiol，E2）酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPx）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；膽堿乙酰轉移酶（choline acetyltransferase，ChAT）抗體購自江蘇親科生物研究中心有限公司；白細胞介素（interleukin）-1β 抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；IL-6 抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；辣根過氧化酶標記的二抗購自碧云天生物技術有限公司；BCA 蛋白含量檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；PAGE 凝膠快速制備試劑盒購自上海雅酶生物科技有限公司。

1.2 實驗動物及分組

雌性C57BL/6J 小鼠均由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供［實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（寧）2020-0001］，經(jīng)寧夏醫(yī)科大學倫理審查委員會批準（倫理編號：2014-017）。喂養(yǎng)于晝夜12 h交替、濕度45%、室溫（23±1）℃環(huán)境中，自由進食。實驗前選取11 周齡雌性未孕C57BL/6J 小鼠45 只，適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為假手術組、模型組和LBP 干預組，每組15 只。

1.3 模型制備及給藥

將各組C57BL/6J 小鼠用4%水合氯醛溶液（10 mL·kg-1）腹腔注射麻醉，俯臥位固定小鼠。小鼠背部備皮，切口區(qū)域用乙醇及碘伏消毒，于肋下1 cm 水平做長約1 cm 的縱向切口，切開筋膜，鈍性分離肌肉及腹膜，在腸系膜脂肪中找到紅色顆粒樣腺體即卵巢，在子宮角上用絲線結扎輸卵管，LBP 干預組和模型組完整切斷輸卵管及卵巢，使用同樣的方法切除對側卵巢及輸卵管；假手術組僅去除與卵巢大小相當?shù)穆殉仓車闹?。使用可吸收線依次縫合肌肉及皮膚。術后每只小鼠每天給予10 萬單位青霉素腹腔注射3 d，防止感染。依據(jù)文獻及本實驗前期的研究結果[11-12]確定藥物濃度。術后1 周，LBP 干預組灌胃給予LBP 灌胃0.1 g·kg-1；假手術組和模型組灌胃等量蒸餾水，每天1 次，連續(xù)12 周。在12 周的灌胃期間，假手術組15 只小鼠全部進入實驗，模型組與LBP 干預組各死亡1 只小鼠（小鼠打架撕咬受傷感染所致），分別有14 只小鼠進入實驗。

1.4 小鼠去勢模型鑒定

各組小鼠去勢手術后，每周進行體質量記錄；行為學檢測結束后，取血清檢測E2含量；按公式計算：子宮系數(shù)=子宮濕重/每100 g 體質量。

1.5 行為學指標檢測

1.5.1 曠場實驗 曠場實驗由長、寬、高各50 cm的灰色行為箱、攝像頭和圖像采集系統(tǒng)組成。應用Smart 3.0 軟件將行為箱底面定義為中央?yún)^(qū)域和外周區(qū)域。中央?yún)^(qū)域長寬為外周區(qū)域長寬的一半。實驗開始時將小鼠放入行為箱中央?yún)^(qū)域，讓其在行為箱內自由探索10 min。記錄其活動軌跡，比較各組小鼠在中央?yún)^(qū)域停留時間和總運動距離。每只小鼠實驗結束后，用75%乙醇擦拭行為箱，以消除遺留的氣味和糞便對后續(xù)實驗結果的影響。

1.5.2 新物體識別實驗 該實驗由適應階段、熟悉階段及測試階段組成。1）適應階段：將小鼠放入40 cm×40 cm×40 cm 沒有放任何物體的實驗敞箱中自由活動10 min。2）熟悉階段：敞箱中呈對角線且對稱放置兩個相同的物體（A、B）。將小鼠從兩個物體連線的中點處面向箱壁放入。小鼠自由活動10 min，記錄其運動軌跡及探索A、B兩個物體的時間。3）測試階段：把B 物體換成顏色形狀不同、材質相同、大小相似的C 物體，將小鼠放入實驗敞箱，記錄其10 min 的運動軌跡及對A、C 兩個物體的探索時間。計算新物體識別指數(shù)（new object index，NOI）。NOI=探索新物體的時間/（探索新物體的時間+探索舊物體的時間）×100%。

1.5.3 Morris 水迷宮行為學檢測 Morris 水迷宮由圓形水池（直徑90 cm）、逃生平臺（直徑10 cm）和圖像采集分析軟件構成。圖像采集系統(tǒng)將水池分為4 個象限，每個象限池壁貼有不同參考物。水池中水面高于逃生平臺1 cm 并加入白色染料以隱蔽逃生平臺，水溫控制在（22±1）℃。該實驗由定位航行實驗、空間探索實驗和可視平臺實驗組成。1）定位航行實驗：于每天上午進行，持續(xù)5 d，從小鼠入水至找到逃生平臺的時間為逃避潛伏期。若小鼠60 s 未找到逃生平臺，則記錄逃避潛伏期為60 s。2）空間探索實驗：第6 天撤去逃生平臺，任選一個入水點將小鼠放入水中，記錄小鼠在120 s 內的游泳軌跡。3）可視平臺實驗：將逃生平臺移至原象限的對面象限，逃生平臺高于水面1 cm，選取2 個象限將小鼠放入水中，記錄其尋找逃生平臺的時間及軌跡。

1.6 標本采集與處理

行為學檢測結束后，各組小鼠采用4%水合氯醛溶液（10 mL·kg-1）進行腹腔麻醉。1）打開小鼠胸腔，心臟取血，收集并分裝血清后置于-80 ℃冰箱中保存；2）打開小鼠腹腔，取出子宮，剝離附著的脂肪，并精密稱重；3）各組均取小鼠8 只，打開顱腔，快速取出小腦，將其左、右半球分別置于-80 ℃冰箱中保存，用于生化及分子生物學檢測。

1.7 E2 含量檢測

ELISA 檢測血清E2含量。具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.8 氧化應激相關指標測定

取各組小鼠血清和右側小腦半球，采用TBA法檢測MDA 的含量；采用羥胺法檢測SOD 活力；采用比色法測定GSH-Px 活力；嚴格按照說明書進行具體操作。

1.9 膽堿乙酰轉移酶及炎性因子檢測

蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測各組小鼠右側小腦半球ChAT 和炎性因子的相對表達量。從-80 ℃冰箱取出小鼠右側小腦半球稱重，按比例加入全蛋白提取液研磨并離心，吸取上清液備用。BCA 法測定蛋白質含量。每組取30 μg蛋白進行SDS-PAGE 電泳分離，轉至PVDF 膜，5% 脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗（ChAT、IL-1β、IL-6、TNF-α 及β-Tubulin 均1∶1 000 稀釋）4 ℃于搖床孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜3 次，每次10 min。加入二抗（1∶2 000 稀釋）常溫下?lián)u床孵育1 h，TBST 緩沖液洗膜3 次，每次10 min，ECL法顯色，采用Image J 圖像分析軟件測定各電泳條帶的灰度值。

1.10 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 和GraphPad Prism 8.0.1統(tǒng)計學軟件進行分析與作圖。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析；Morris 水迷宮定位航行實驗階段所獲得的逃避潛伏期采用重復測量方差分析。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠體質量觀察結果

LBP 干預前，各組小鼠體質量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；LBP 干預12 周后，與假手術組比較，模型組小鼠體質量增加（P＜0.01）；與模型組比較，LBP 干預組體質量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 LBP 對去勢小鼠體質量的影響

2.2 小鼠子宮系數(shù)檢測結果

LBP 干預12 周后，與假手術組比較，模型組子宮系數(shù)減?。≒＜0.01）；與模型組比較，LBP 干預組子宮系數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 LBP 對去勢小鼠子宮系數(shù)的影響

2.3 行為學指標檢測結果

2.3.1 曠場實驗檢測結果 LBP 干預12 周后，與假手術組比較，模型組小鼠行動軌跡簡單，中央?yún)^(qū)域停留時間減少，總運動距離縮短（P均＜0.01）；與模型組比較，LBP 干預組行動軌跡復雜，中央?yún)^(qū)域停留時間增加，總運動距離增加（P均＜0.05），見圖3。

圖3 LBP 對去勢小鼠曠場實驗的影響

2.3.2 新物體識別實驗檢測結果 LBP 干預12周后，與假手術組比較，模型組NOI 降低（P＜0.01）；與模型組比較，LBP 干預組NOI 增高（P＜0.01），見圖4。

圖4 LBP 對去勢小鼠新物體識別的影響

2.3.3 Morris 水迷宮行為學檢測結果 LBP 干預12 周后，定位航行階段各組小鼠隨著訓練天數(shù)的增加，逃避潛伏期均縮短。與假手術組比較，模型組第3～5 天逃避潛伏期延長（P＜0.01）；與模型組比較，LBP 干預組第4、5 天逃避潛伏期縮短（P＜0.01），見圖5?？臻g探索階段，與假手術組比較，模型組穿越目標象限次數(shù)減少（P＜0.01）；與模型組比較，LBP 干預組穿越目標象限次數(shù)增多（P＜0.05），見圖6?？梢暺脚_實驗階段，各組小鼠到達新平臺所用的時間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖7。

圖5 LBP 對去勢小鼠定位航行的影響

圖6 LBP 對去勢小鼠空間探索的影響

圖7 LBP 對去勢小鼠可視平臺的影響

2.4 E2 檢測結果

LBP 干預12 周后，與假手術組比較，模型組血清E2含量減少（P＜0.01）；與模型組比較，LBP 干預組血清E2含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖8。

圖8 LBP 對去勢小鼠血清E2 含量的影響

2.5 氧化應激相關指標檢測結果

LBP 干預12 周后，與假手術組比較，模型組血清及小腦半球MDA 含量增高，SOD、GSH-Px活力降低（P均＜0.05）；與模型組比較，LBP 干預組血清及小腦半球MDA 含量降低，SOD、GSHPx 活力增加（P均＜0.05），見圖9、圖10。

圖9 LBP 對去勢小鼠血清氧化應激相關指標的影響

圖10 LBP 對去勢小鼠小腦半球氧化應激相關指標的影響

2.6 小腦半球ChAT 檢測結果

Western blot 結果顯示，LBP 干預12 周后，與假手術組比較，模型組ChAT 的相對表達量下調（P＜0.05）；與模型組比較，LBP 干預組ChAT 的相對表達量上調（P＜0.05），見圖11。

圖11 LBP 對去勢小鼠小腦半球ChAT 蛋白相對表達量的影響

2.7 小腦半球炎性因子檢測結果

Western blot 結果顯示，LBP 干預12 周后，與假手術組比較，模型組IL-1β、IL-6、TNF-α 的相對表達量均上調（P均＜0.05）；與模型組比較，LBP 干預組IL-1β、IL-6、TNF-α 的相對表達量均下調（P均＜0.05），見圖12。

圖12 LBP 對去勢小鼠小腦半球炎性因子蛋白相對表達量的影響

3 討論

AD 的臨床癥狀主要表現(xiàn)為記憶喪失、認知障礙、行為異常等，其大多數(shù)研究集中在內側顳葉，特別是海馬的受損，其功能障礙被認為是AD記憶喪失的主要原因[13]。近年來小腦在認知方面的研究成為熱點，即小腦除了在運動調節(jié)方面的傳統(tǒng)作用外，也參與了工作記憶、空間工作記憶、時間的感知處理等認知過程[14]。研究[15-16]表明，小腦亦是AD 發(fā)病過程中的易感區(qū)域。小腦影響認知功能的基礎是大腦-小腦環(huán)路[17]，即大腦與小腦間廣泛的纖維聯(lián)系，這解釋了小腦如何參與影響認知功能。

本研究結果顯示，C57BL/6J 小鼠去勢后，模型組小鼠體質量增加、子宮系數(shù)降低以及血清E2含量下降，LBP 干預并未發(fā)生改變，結果符合更年期婦女肥胖發(fā)生率增高的現(xiàn)象，推測肥胖的發(fā)生可能與去勢誘導低雌激素水平有關。曠場實驗結果表明LBP 干預可以改善去勢引起的小鼠運動能力損傷及焦慮行為。新物體識別實驗與Morris 水迷宮實驗結果表明LBP 干預可以增強去勢小鼠的非空間及空間學習記憶能力。

在對AD 病理機制的研究中，乙酰膽堿能系統(tǒng)對認知學習功能起到重要作用。ChAT 由于穩(wěn)定性高且僅存在于膽堿能神經(jīng)元內而被廣泛認為是膽堿能神經(jīng)元活性狀態(tài)的最佳標記物[18-19]。本實驗結果顯示，LBP 干預后上調去勢小鼠小腦半球ChAT 的相對表達量，表明LBP 在去勢小鼠膽堿能神經(jīng)環(huán)路ChAT 蛋白的表達方面有調控作用，能有效改善其記憶能力。去勢可誘導嚙齒類動物大腦中的神經(jīng)炎癥，導致學習、記憶和認知功能障礙。本實驗結果顯示，LBP 干預后上調去勢小鼠小腦半球IL-1β、IL-6 和TNF-α 的相對表達量，表明LBP 可減輕去勢小鼠小腦半球的神經(jīng)炎癥。

氧化應激已被證明是AD 進展的主要因素[20]。氧化應激被定義為由于過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平[21]導致大分子（如核酸、蛋白質、脂類等）的翻譯后化學修飾引起細胞損傷[22]，從而導致氧化劑和保護性抗氧化系統(tǒng)之間的失衡。在AD 患者萎縮的大腦中，往往存在顯著的神經(jīng)元組織氧化損傷[23]。ROS 通常具有高反應性、不穩(wěn)定性和極短的半衰期，因此很難直接測量。ROS 的氧化生物分子產(chǎn)物更加穩(wěn)定，常用作ROS 的標記物。此外，ROS 還可以通過測定抗氧化水平或抗氧化酶活性來間接評估。本研究結果顯示，對C57BL/6J 雌鼠去勢后，模型組小鼠的血清及小腦半球表現(xiàn)出脂質過氧化物MDA 含量增高、抗氧化酶SOD 和GSH-Px 活力降低，而LBP 干預后此狀況有所改善，提示LBP 干預可以改善去勢小鼠的氧化應激損傷情況。

在AD 病理中，越來越多的研究[24-25]將年齡和性別作為兩個獨立的生物學變量，但它們之間是存在相互作用的，性別差異可能是AD 疾病特異性、藥物特異性、年齡特異性或這些特異性的任何組合。鑒于此，本實驗中僅納入了雌性小鼠為研究對象。女性卵巢切除術或更年期后雌激素的喪失會增加患AD 風險、晚年情緒障礙以及年齡相關的認知能力下降[26-27]。因此，在AD 的實驗研究和臨床治療策略中，探尋雌激素發(fā)揮其神經(jīng)保護作用的“關鍵窗口期”尤為重要[28]。

AD 發(fā)病機制復雜，篩選開發(fā)治療藥物困難，近年來人們從草藥中尋找治療AD 的新藥。枸杞是中國傳統(tǒng)的中藥材和補品，研究[7]表明，LBP 具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗炎、神經(jīng)保護、生殖保護、護眼、免疫調節(jié)等作用。鑒于此，本研究選擇了LBP 作為干預藥物，并將其干預窗口期的開始時間選擇在C57BL/6J 小鼠去勢后1 周，通過為期12 周的干預，表現(xiàn)出了一定的干預效果，提示選擇的干預“窗口期”可能是“關鍵窗口期”。

目前枸杞抗衰老和防治AD 的基礎研究進展較迅速，本研究在將性別作為重要、獨立的影響因素的基礎上，初步引用了“圍絕經(jīng)期”和“關鍵窗口期”等臨床概念，由于去勢動物模型的局限性以及“窗口期”的不確定性，可能影響了實驗效果。因此今后需科學、合理、規(guī)范地開展枸杞的相關臨床研究，制備更加符合“圍絕經(jīng)期”的動物模型，并圍繞“圍絕經(jīng)期”進行防治。