單 婧， 馬小發(fā)， 吳夢宇， 林雨佳， 王 義， 王 蕊， 徐海明

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏回族自治區(qū)環(huán)境因素與慢性病控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

四溴雙酚A（tetrabromobisphenol A，TBBPA）是應(yīng)用最廣泛的溴系阻燃劑（BFRs）之一，在生產(chǎn)和使用過程中會釋放到環(huán)境中，其在大氣、土壤、水體中均被檢出[1-2]，甚至在魚類、雞蛋、牛奶以及人類母乳等食品樣品中也檢測到了TBBPA[3-4]。TBBPA 可通過皮膚接觸、呼吸及飲食等途徑進(jìn)入生物和人體內(nèi)，產(chǎn)生心臟、生殖、內(nèi)分泌和神經(jīng)等毒性作用[5-8]，對生物存在健康風(fēng)險。Alzualde 等[8]研究也證實(shí)了BFRs 及其替代物暴露后，導(dǎo)致斑馬魚產(chǎn)生心臟毒性的濃度可能處于人類暴露的較高范圍內(nèi)。

芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）又稱二噁英（TCDD）受體，屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix Per-Arnt-Sim homologydomain bHLH-PAS）轉(zhuǎn)錄因子家族[9]，是一種最早被發(fā)現(xiàn)的環(huán)境污染物多環(huán)芳烴類配體激活轉(zhuǎn)錄因子[10]，具有誘導(dǎo)多種重要外源性化合物代謝酶的作用，可介導(dǎo)TCDD 和其他平面芳香烴的毒性[11]。鎘可以通過抑制代謝降解6-甲?；胚幔?，2-b］咔唑（6-Formylindolo［3，2-b］carbazole，F(xiàn)ICZ）并干擾AhR 的正常功能，后者在心臟發(fā)生過程中具有生理性調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 通路的作用[12]。另有研究[13]表明，PM2.5的有機(jī)物（EOM）能激活斑馬魚胚胎AhR，導(dǎo)致心臟發(fā)育關(guān)鍵表達(dá)異常。因此，AhR 是否能介導(dǎo)TBBPA 致斑馬魚心臟發(fā)育毒性成為本次研究重點(diǎn)。

由于斑馬魚（Danio rerio，Zebrafish）生長繁殖快、飼養(yǎng)成本低，80%基因與人類疾病基因同源，且其信號傳導(dǎo)通路和人類近似，已經(jīng)成為現(xiàn)代毒理學(xué)常用的模型生物之一。本研究以斑馬魚為模式生物，使用AhR 抑制劑CH223191（以下簡稱CH），通過TBBPA 和/或CH 暴露對斑馬魚成魚體質(zhì)量、體長、AhR 相關(guān)基因、心臟功能關(guān)鍵基因、氧化應(yīng)激相關(guān)基因以及抗氧化酶活性的影響來探討AhR 在TBBPA 致心臟毒性效應(yīng)中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)選用4 月齡AB 系野生型斑馬魚，共300條，雌雄各半，循環(huán)水系統(tǒng)適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周。自來水充分曝氣48 h 以充分除氯，除氯水中添加碳酸氫鈉以保持pH 值為7.4，水溫恒溫（28±1）℃，光照周期為12 h/12 h，每日早晚各喂食1 次凍干豐年蝦[14]。

1.2 主要試劑

TBBPA（Sigma 公司，美國），CH（MedChemExpress 公司，美國）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（北京索萊寶科技有限公司，中國）；總RNA 提取試劑盒、cDNA 第一鏈合成預(yù)混試劑盒、RealUniversal 彩色熒光定量預(yù)混試劑盒（北京天根生化科技有限公司，中國）；實(shí)時熒光定量（qRT-PCR）引物（上海生工生物工程股份有限公司，中國）；超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx/GPX）活性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，中國）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 斑馬魚暴露實(shí)驗(yàn) 將TBBPA 溶于DMSO溶劑中，配制成濃度為0.1 mol·L-1的TBBPA 貯存液。用DMSO 稀釋貯存液至濃度分別為0.1、1、10 mmol·L-1，按0.01%加入水中，至水中TBBPA終濃度分別為10、100、1 000 nmol·L-1；將CH 加入DMSO 溶劑中，配制成濃度為2.5 mmol·L-1的貯存液，后稀釋至0.5 mmol·L-1，按0.01%加入水中，至水中CH 濃度為0.05 μmol·L-1。實(shí)驗(yàn)分為溶劑對照組（DMSO 組）、CH 組（0.05 μmol·L-1）、TBBPA 暴露組（10、100、1 000 nmol·L-1）和CH+TBBPA 干預(yù)組（1 000 nmol·L-1），各組均含0.02%體積的DMSO。從同一馴養(yǎng)池中按隨機(jī)抽樣的方法將斑馬魚分別放入對應(yīng)的暴露缸中，每缸8 條魚，雌魚、雄魚各4 條。同步設(shè)置兩個平行組，魚缸體積為6 L，暴露液4 L，斑馬魚暴露液每隔1 d更換1 次，暴露持續(xù)30 d，暴露期間觀察各組斑馬魚的生長狀況。暴露結(jié)束后用濾紙吸干表面水分，稱重并測量每條魚的體長，后迅速將每條魚置于冰面解剖其心臟和肝組織后轉(zhuǎn)移至無RNA 酶離心管中冷凍保存在-80 ℃超低溫冰箱中。

1.3.2 qRT-PCR 本研究涉及的基因包括AhR 相關(guān)基因（ahr2、cyp1a1、cyp1a2）[15]、心臟功能關(guān)鍵基因（sox9b、nkx2.5、gate4、myh6、tbx5、vmhc）[16-20]和氧化應(yīng)激相關(guān)基因（nrf2、gpx1a、sod1、sod2、cat）[21]，所有引物序列合成均使用軟件Primer 5 設(shè)計(jì)，并通過Primer-BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）驗(yàn)證其特異性，引物序列見表1。將斑馬魚的心臟組織置于預(yù)先加入RNA 裂解液的離心管中進(jìn)行勻漿操作（4 ℃），充分研磨后進(jìn)行離心操作（12 000 r·min-1，4 ℃，10 min），取上清液。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行總RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR 操作。以gapdh為內(nèi)參基因，每個樣品設(shè)3 個復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3.3 抗氧化酶檢測實(shí)驗(yàn) 將斑馬魚的肝組織置于預(yù)先加入生理鹽水的離心管中進(jìn)行勻漿操作（4 ℃），充分研磨后，12 000 r·min-1、4 °C 離心10 min，取上清液進(jìn)行抗氧化酶活性檢測。分別采用WST-1 法、鉬酸銨法及微量法測定SOD、CAT及GSH-Px/GPX 活性，均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用GraphPad Prism 9.4.1 作圖。計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。在進(jìn)行多重比較時，方差齊性則采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05（雙側(cè)）。

2 結(jié)果

2.1 暴露對斑馬魚成魚生長發(fā)育的影響

在整個暴露過程中，未發(fā)現(xiàn)有明顯的畸形及死亡情況。雌、雄魚按照性別區(qū)分比較，與DMSO組相比，各暴露組和干預(yù)組體質(zhì)量、體長差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見圖1。

圖1 TBBPA 和/或CH 暴露對斑馬魚成魚體質(zhì)量、體長的影響（n=4）

2.2 暴露對斑馬魚成魚AhR 信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

TBBPA 暴露30 d 后，與DMSO 組相比，AhR相關(guān)基因ahr2、cyp1a1 和cyp1a2 在CH 組中表達(dá)下調(diào)（ahr2、cyp1a1：P均＜0.05），其中cyp1a2 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；ahr2、cyp1a1 和cyp1a2 在1 000 nmol·L-1TBBPA 暴露組和CH+1 000 nmol·L-1TBBPA 干預(yù)組中表達(dá)均上調(diào)（P均＜0.05）。與1 000 nmol·L-1TBBPA 暴露組相比，ahr2、cyp1a1和cyp1a2 在CH+1 000 nmol·L-1TBBPA 干預(yù)組中表達(dá)水平下降（P均＜0.05），見圖2。

圖2 TBBPA 和（或）CH 暴露對斑馬魚成魚AhR 信號通路相關(guān)基因mRNA 相對表達(dá)水平的影響（n=8）

2.3 暴露對斑馬魚成魚心臟功能關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

TBBPA 暴露30 d 后，與DMSO 組相比，nkx2.5和tbx5 在100 nmol·L-1TBBPA 暴露組表達(dá)下調(diào)（P均＜0.05）；sox9b、nkx2.5、gate4、myh6、tbx5和vmhc在1 000 nmol·L-1TBBPA 暴露組表達(dá)均下調(diào)（P均＜0.05）。與1 000 nmol·L-1TBBPA 暴露組相比，CH+1 000 nmol·L-1TBBPA 干預(yù)組各指標(biāo)表達(dá)均上調(diào)（P均＜0.05），見圖3。

圖3 TBBPA 暴露對斑馬魚成魚心臟功能關(guān)鍵基因mRNA 相對表達(dá)水平的影響（n=8）

2.4 暴露對斑馬魚成魚氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

在TBBPA 暴露30 d 后，與DMSO 組相比，gpx1a、sod1 和sod2 在100 nmol·L-1TBBPA 暴露組表達(dá)均下調(diào)（P均＜0.05）；gpx1a、sod1、sod2 和cat在1 000 nmol·L-1TBBPA 暴露組表達(dá)下調(diào)，nrf2表達(dá)上調(diào)（P均＜0.05）。與1 000 nmol·L-1TBBPA 暴露組相比，gpx1a、sod1、sod2 和cat在CH+1 000 nmol·L-1TBBPA 干預(yù)組表達(dá)上調(diào)，nrf2 表達(dá)下調(diào)（P均＜0.05），見圖4。

圖4 TBBPA 暴露對斑馬魚成魚氧化應(yīng)激相關(guān)基因mRNA 相對表達(dá)水平的影響（n=8）

2.5 暴露對斑馬魚成魚肝臟抗氧化酶的影響

經(jīng)過30 d 暴露之后，與DMSO 組相比，CH 組SOD、CAT 和GSH-Px/GPX 活性無變化（P＞0.05），1 000 nmol·L-1TBBPA 暴露組這三種抗氧化酶活性均下降（P均＜0.05），活性分別相當(dāng)于DMSO組的0.45、0.57 和0.44 倍。與1 000 nmol·L-1TBBPA暴露組相比，CH+1 000 nmol·L-1TBBPA 干預(yù)組各指標(biāo)均有所上升（P均＜0.05），見圖5。

圖5 TBBPA 和（或）CH 暴露對斑馬魚成魚肝臟抗氧化酶水平的影響（n=8）

3 討論

本研究以斑馬魚為對象，探究TBBPA 暴露對斑馬魚心臟毒性效應(yīng)以及AhR 在此過程中的作用機(jī)制。在參考國內(nèi)多地環(huán)境水體中TBBPA 實(shí)際劑量的基礎(chǔ)上[22]，本研究選取10、100、1 000 nmol·L-1作為暴露劑量。在參考相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，CH 暴露劑量設(shè)置為0.05 μmol·L-1[23]。本研究結(jié)果顯示，斑馬魚成魚暴露TBBPA 后，各暴露組和干預(yù)組與DMSO 組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，體質(zhì)量、體長無明顯變化，表明環(huán)境相關(guān)劑量的TBBPA 暴露對斑馬魚成魚生長發(fā)育無影響。

某些特定結(jié)構(gòu)的環(huán)境化合物可以通過激活A(yù)hR 信號通路而活化下游信號，引起一系列毒理學(xué)與健康效應(yīng)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)TBBPA 暴露30 d后，ahr2、cyp1a1 以及cyp1a2 表達(dá)水平均上調(diào)，CH 可以使其表達(dá)水平降低。這一結(jié)果提示，TBBPA 暴露后會激活A(yù)hR 信號通路。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致機(jī)體組織產(chǎn)生病理表現(xiàn)的關(guān)鍵因素，心血管、肝臟等疾病都與活性氧（ROS）密切相關(guān)[25]。AhR 被激活后通過上調(diào)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞色素酶P450的表達(dá)水平，引起ROS 水平升高，最終導(dǎo)致氧化損傷[15]。本研究首先關(guān)注了TBBPA 暴露對斑馬魚心臟組織中氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。同時，考慮到肝臟是機(jī)體內(nèi)最容易受到應(yīng)激損傷的器官之一，所以進(jìn)一步探究了TBBPA 暴露對斑馬魚肝組織中抗氧化酶活性的影響。

nrf2 是抗氧化反應(yīng)中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，可通過與多個抗氧化基因啟動子區(qū)抗氧化反應(yīng)元件（ARE）的結(jié)合來誘導(dǎo)下游基因表達(dá)。Zhang 等[21]的研究證實(shí)，TBBPA 暴露能夠激活nrf2 信號通路。本研究結(jié)果顯示，TBBPA 暴露可以引起斑馬魚心臟組織中nrf2 基因表達(dá)水平上調(diào)，同時導(dǎo)致gpx1a、sod1、sod2 和cat的表達(dá)水平下調(diào)。進(jìn)一步的研究表明，TBBPA 暴露可降低斑馬魚肝組織中抗氧化酶SOD、CAT 和GSH-Px/GPX 的活性，CH可從一定程度上逆轉(zhuǎn)TBBPA 所致的氧化損傷，提示AhR 信號通路介導(dǎo)了TBBPA 所致的氧化損傷效應(yīng)。

本研究選擇了sox9b、nkx2.5、gate4、myh6、tbx5 和vmhc這6 個與心臟功能密切相關(guān)的基因作為探究TBBPA 所致斑馬魚心臟毒性的分子指標(biāo)。Wnt/β-catenin 通路在心臟發(fā)育及正常功能的發(fā)揮過程中起著至關(guān)重要的作用，可調(diào)控心衰、心肌梗死后重構(gòu)和心律失常等心臟疾病的病理進(jìn)程[16，26-27]。β-catenin 靶基因sox9b 和nkx2.5是心臟發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。sox9b缺失會導(dǎo)致斑馬魚心包水腫和心臟腫大[17]。nkx2.5 位于眾多心臟結(jié)構(gòu)基因的上游，維持正常心臟結(jié)構(gòu)功能，nkx2.5基因突變或缺失會導(dǎo)致斑馬魚心臟畸形[18]。myh6參與構(gòu)成心肌細(xì)胞骨架，斑馬魚wea突變體可干擾myh6 基因表達(dá)而導(dǎo)致斑馬魚心房收縮障礙[19]。tbx5 基因突變可導(dǎo)致多種類型的先天性心臟病[20]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TBBPA 暴露可導(dǎo)致斑馬魚心臟內(nèi)sox9b、nkx2.5、gate4、myh6、tbx5 和vmhc基因表達(dá)下調(diào)，提示TBBPA 可導(dǎo)致一定的心臟毒性。

綜上所述，環(huán)境相關(guān)劑量的TBBPA 暴露對斑馬魚成魚體質(zhì)量及體長無影響，但可通過激活A(yù)hR 信號通路，引起氧化損傷并影響心臟功能關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，最終導(dǎo)致心臟毒性作用。