劉佳鑫， 曹傳尚， 金毅然， 馬曉娜， 李家輝， 郭松林， 牛建國， 梁雪云

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，寧夏干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004；2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏顱腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

腦卒中分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中出血性腦卒中占全部腦卒中的15%左右[1]。盡管腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）發(fā)病率低于腦缺血，但其更高的病死率和致殘率值得高度重視[2]。ICH 通常表現(xiàn)為腦內(nèi)動(dòng)脈突然破裂，血液釋放壓迫周圍腦組織，引起顱內(nèi)壓迅速升高，繼而導(dǎo)致腦水腫，導(dǎo)致炎癥、氧化應(yīng)激的發(fā)生和血腦屏障破壞[3-4]。當(dāng)前對(duì)于ICH 的治療主要體現(xiàn)在手術(shù)清除血腫、藥物止血以及調(diào)節(jié)血壓[5]，但療效以及預(yù)后仍不理想，給患者以及社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[6]。因此，探尋理想的ICH 治療手段仍是當(dāng)前研究者面臨的一項(xiàng)挑戰(zhàn)。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因其具有自我更新、免疫原性低、多向分化潛能及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)特性[7]，已被應(yīng)用于治療多種疾病的動(dòng)物模型中，例如ICH[8]、腦缺血[9]、脊髓損傷[10]、糖尿病[11]、關(guān)節(jié)炎等[12]，并展現(xiàn)出良好的治療效果。MSCs 對(duì)ICH 具有一定的治療作用[13]，但是對(duì)于ICH 這類神經(jīng)系統(tǒng)損傷的疾病，移植神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)可能更精準(zhǔn)、更高效[14-15]。內(nèi)源性NSCs 來源有限，不能滿足臨床移植所需，且不易對(duì)其標(biāo)準(zhǔn)化制備[16]。研究[17-18]發(fā)現(xiàn)，MSCs 具備在一定條件下能被誘導(dǎo)分化為NSCs 的潛能，這將為解決NSCs 移植治療ICH 等疾病面臨的細(xì)胞數(shù)量少、細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化制備等難題提供新思路。

本課題組前期已經(jīng)將胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞（placental mesenchymal stem cells，pMSCs）在誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下誘導(dǎo)生成神經(jīng)干細(xì)胞（induced neural stem cells，iNSCs）[19]，且iNSCs 條件培養(yǎng)基具有良好的抗氧化特性，能夠促進(jìn)受損海馬神經(jīng)干細(xì)胞的修復(fù)[20]。因此，本研究將進(jìn)一步探討iNSCs 對(duì)ICH 大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

實(shí)驗(yàn)中所用P3 代次的pMSCs 由寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院寧夏干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，細(xì)胞的采集及獲取獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：2020-289）。實(shí)驗(yàn)所用的SPF 級(jí)SD 雄性大鼠（250～280 g）購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并按寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)定進(jìn)行操作。Neurobasal-A Medium、B-27 Supplement（50×）、N-2 Supplement（100×）、胰蛋白酶、GlutaMAXTMSupplement、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）購自美國Gibco 公司；UltraCULTURETMSerum-free Medium 購自瑞士LONZA 公司；ultroser G 血清替代物（ultroser G serum substitute，UG）購自美國PALL 公司；表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）購自美國PeproTech 公司；Heparin 購自加拿大STEMCELL公司；層粘連蛋白包被液購自瑞典BioLamina 公司；Ⅶ型膠原酶購自美國Sigma-Aldrich 公司；兔抗Sox-2、β-actin，山羊抗兔CoraLiteR488 購自美國Proteintech 公司；兔抗GAP-43、超氧化物歧化酶（SOD），鼠抗NeuN，山羊抗兔Alexa FluorR555、H&L（HRP），山羊抗鼠Alexa FluorR488 均購自英國Abcam 公司；兔抗Nestin 購自美國Invitrogen 公司；兔抗Cleaved-Caspase-3 購自美國Affinity 公司；A 型膠原酶購自瑞士Roche 公司；異氟烷購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；尼氏染色試劑盒、HE 染色試劑盒、4%多聚甲醛、羊血清、含DAPI 封片劑購自北京索萊寶科技有限公司；ECL 檢測(cè)試劑盒購自凱基生物公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱、PRIMO 臺(tái)式高速離心機(jī)購自美國Thermo Fisher 公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司；其他細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞篩等耗材購自美國Corning 公司。

1.2 方法

1.2.1 pMSCs 分離及培養(yǎng) pMSCs 采集方法沿用課題組前期研究[21]，簡(jiǎn)要描述如下：獲取人源性胎盤母體側(cè)組織，采用無菌操作方法將其剪碎，PBS 洗滌后用0.1%的A 型膠原酶于37 ℃水浴處理2 h，每隔20 min 顛倒混勻，并將消化后的細(xì)胞懸液通過100 μm 的細(xì)胞篩，離心并棄掉上清液，加入適量培養(yǎng)液，將細(xì)胞混合液轉(zhuǎn)至培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度至80%左右進(jìn)行傳代。

復(fù)蘇P3 代次的pMSCs 并將其培養(yǎng)于添加了UG 的通用型無血清培養(yǎng)基（ultraculture serumfree medium）中，次日換液，待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，傳代擴(kuò)增至P5 代用于誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞。

1.2.2 iNSCs 誘導(dǎo)方法 配制iNSCs 誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其比例分別為Neurobasal-A Medium（97%）、B-27（2%）、N-2（1%）、bFGF（10 mg·L-1）、EGF（20 mg·L-1）、Heparin（2 mg·L-1）。將細(xì)胞數(shù)為2×106的P5 代pMSCs 重懸于10 mL 的iNSCs 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中并接種在100 mm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿懸浮誘導(dǎo)，每3 d 向培養(yǎng)皿中補(bǔ)充3 mL 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，只補(bǔ)液不棄液。

1.2.3 iNSCs 及pMSCs 的免疫熒光染色鑒定 復(fù)蘇P5 代次的pMSCs，以及在誘導(dǎo)后第7 天，收集直徑在100 μm 左右的iNSCs，將其輕柔吹散成單個(gè)細(xì)胞，將上述細(xì)胞接種在預(yù)先用層粘連蛋白包被的12 孔板中，過夜培養(yǎng)，待次日細(xì)胞貼壁后，棄掉培養(yǎng)液，PBS 清洗2 遍，用4%的多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20 min，加入0.5% Triton X-100室溫破膜20 min，再用5%的羊血清室溫封閉1 h后，分別與以下一抗，即Nestin（1∶200）、GAP-43（1∶500）、Sox-2（1∶500）于4 ℃孵育過夜。次日用PBS 清洗3 次，每次10 min，然后分別加入熒光二抗Alexa FluorR555（1∶500）或CoraLiteR488（1∶500）室溫避光孵育2 h。加入DAPI 染液對(duì)細(xì)胞核染色，并在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。每組蛋白鑒定設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，每個(gè)樣本孔隨機(jī)拍攝5個(gè)視野，計(jì)算陽性細(xì)胞率，最后再計(jì)算出各組蛋白陽性細(xì)胞率的均值。

1.2.4 大鼠ICH 模型 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham 組）、腦出血組（ICH 組）和誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞移植組（iNSCs 組），每組10 只。用異氟烷麻醉大鼠，將其固定在手術(shù)臺(tái)面，備皮，碘伏消毒，沿兩眼中點(diǎn)做矢狀切口暴露前囟，以前囟為坐標(biāo)原點(diǎn)，向后0.2 mm，向左旁開3.0 mm，深度6.0 mm 為左側(cè)紋狀體內(nèi)囊定位點(diǎn)，用微量注射器以0.4 μL·min-1的速率緩慢注射2 μL 的Ⅶ型膠原酶（0.2 U）。注射結(jié)束需停針10 min，垂直緩慢拔出針頭，并用骨蠟封閉針孔以及縫合傷口。ICH 模型以注射Ⅶ型膠原酶24 h 完成，Sham組在不注射膠原酶的情況下進(jìn)行相同的操作。

1.2.5 iNSCs 原位移植 將iNSCs 用胰酶預(yù)處理5 min 后，用培養(yǎng)基終止消化并輕柔吹打，使其成為單個(gè)細(xì)胞。大鼠麻醉、固定及紋狀體定位同ICH 造模方法。當(dāng)Ⅶ型膠原酶注射24 h 后，將1×106/30 μL 的iNSCs 用量程為100 μL 微量注射器原位緩慢注射到ICH 大鼠左側(cè)紋狀體內(nèi)囊，退出針頭，并用骨蠟封閉針孔以及縫合傷口。Sham組和ICH 組注射等體積的PBS，其他操作相同。

1.2.6 神經(jīng)功能評(píng)估 1）前肢放置實(shí)驗(yàn)：用于評(píng)估動(dòng)物的感覺運(yùn)動(dòng)功能障礙，實(shí)驗(yàn)前，讓動(dòng)物放松，輕柔抓住大鼠使其四肢自由懸空，讓大鼠的右側(cè)胡須觸碰桌角，誘導(dǎo)其將前肢放置于桌面，大鼠發(fā)生ICH 后，會(huì)對(duì)側(cè)前肢放置呈現(xiàn)一定障礙，每只大鼠測(cè)試10 次，記錄大鼠右側(cè)前肢放置成功的百分率反映動(dòng)物的損傷情況。分值越高，代表動(dòng)物損傷情況相對(duì)越小。2）轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)：用以評(píng)估動(dòng)物的肢體協(xié)調(diào)功能的損傷情況，將大鼠置于由兩塊擋板形成的30°夾角裝置中，大鼠會(huì)轉(zhuǎn)身，每只大鼠測(cè)試10 次，記錄大鼠右轉(zhuǎn)的百分率，每次測(cè)試間隔＞30 s。分值越高，代表動(dòng)物損傷情況相對(duì)越小。3）改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（modified neurological severity score，mNSS）：用以反映動(dòng)物神經(jīng)功能缺損情況，主要包括對(duì)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)、感覺、反射、平衡、肌力等功能的評(píng)價(jià)，其分值量化為0～18 分，分?jǐn)?shù)越高，表明神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.2.7 標(biāo)本制備 將大鼠麻醉后，暴露心臟，將灌注針頭沿左心室插入主動(dòng)脈，剪開右心耳，并灌注生理鹽水，待右心耳流出的液體變澄清時(shí)，換4%的多聚甲醛繼續(xù)灌注，待動(dòng)物肢體變硬后，停止灌注并取出整個(gè)腦組織，置于4%的多聚甲醛4 ℃過夜，30%的蔗糖溶液脫水完成后，去除腦干和小腦，以進(jìn)針點(diǎn)的冠狀面為基準(zhǔn)，向其前后各延伸1 mm，獲取2 mm 厚度的腦組織切片，并制備厚度為10 μm 的冰凍切片用于后續(xù)的組織免疫熒光、HE 及尼氏（Nissl）染色。

1.2.8 血腫體積量化 取材各組大鼠腦組織切成連續(xù)的組織切塊用以觀察血腫大小，并用Image J 量化各組大鼠腦組織的血腫大小，計(jì)算公式：血腫體積率（%）=血腫體積/全腦體積×100%。

1.2.9 HE 和Nissl 染色 HE 染色用以觀察腦組織周圍正常和病變細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量及分布情況。Nissl 染色用以觀察神經(jīng)元胞質(zhì)和樹突內(nèi)的尼氏小體的大小和數(shù)量。根據(jù)HE、Nissl 染色試劑盒的說明，將各組冰凍切片按照提示進(jìn)行染色，在正置顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.10 組織免疫熒光染色 將各組厚度為10 μm的冰凍切片用PBS 洗滌3 次，每次10 min。滴加0.5% Triton X-100 室溫破膜20 min，5%的羊血清室溫封閉1 h，分別與以下一抗，即NeuN（1∶200）、Cleaved-Caspase-3（1∶300）于4 ℃孵育過夜。次日將切片用PBS 洗滌3 次，每次10 min，然后分別加入熒光二抗Alexa FluorR555（1∶500）或Alexa FluorR488（1∶500）室溫避光孵育2 h，并在切片上滴加DAPI 染液，封片，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.11 Western blot 檢測(cè) 麻醉各組大鼠，迅速取出全腦，以注射點(diǎn)的冠狀面為基準(zhǔn)向其前后分別擴(kuò)展1 mm，獲取厚度為2 mm 的腦組織，并分離出損傷側(cè)紋狀體組織，迅速放入液氮速凍，再轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。向分離的腦組織中加入蛋白裂解液，并于組織研磨儀中研磨15 min，然后在4 ℃下，12 000 r·min-1離心15 min，收集上清液，并用BCA 試劑盒測(cè)取樣品中的蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)總含量為50 μg 的樣品加載到10%的SDS-PAGE 凝膠中分離各類蛋白質(zhì)，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，并用5%的脫脂奶粉封閉2 h。隨后分別在4 ℃下孵育SOD，β-actin 一抗過夜，次日用Tris 緩沖鹽溶液（TBST）清洗3 次后加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，對(duì)膜上的蛋白條帶用ECL 檢測(cè)試劑盒通過凝膠成像系統(tǒng)顯影。用Image-J 軟件分析各組蛋白條帶相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 9.0 進(jìn)行繪圖和統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，多組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pMSCs 誘導(dǎo)成iNSCs 形態(tài)學(xué)變化

pMSCs 是一種呈梭形、旋渦狀生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞，將pMSCs 用誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮誘導(dǎo)，可在24 h后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開始聚集成團(tuán)生長(zhǎng)，并有少量小細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)。在第7 天可見大量直徑在100 μm 左右狀態(tài)良好的iNSCs，iNSCs 折光性強(qiáng)，細(xì)胞之間聚合緊密呈桑葚樣或球體形態(tài)，見圖1。

圖1 iNSCs 誘導(dǎo)成球過程光鏡圖

2.2 pMSCs 及iNSCs 表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志蛋白的鑒定

對(duì)pMSCs 及iNSCs 進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志蛋白鑒定，結(jié)果顯示，85%以上的iNSCs 均表達(dá)Nestin、Sox-2 及GAP-43，而pMSCs 低表達(dá)上述蛋白（P均＜0.05），見圖2。

圖2 pMSCs 及iNSCs 免疫熒光染色鑒定

2.3 iNSCs 移植有效降低ICH 大鼠腦血腫體積

iNSCs 移植后在第7 天，取材各組大鼠腦組織并測(cè)量血腫大小。Sham 組大鼠腦血腫體積率為（0.5±0.1）%，ICH 組為（9.2±0.6）%，iNSCs 組為（5.6±0.9）%。與ICH 組比較，iNSCs 組大鼠的腦血腫體積率降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 iNSCs 移植對(duì)ICH 大鼠血腫體積的影響

2.4 iNSCs 移植有效改善ICH 大鼠神經(jīng)功能缺失

iNSCs 移植后第7 天，前肢放置試驗(yàn)、轉(zhuǎn)角試驗(yàn)和mNSS 評(píng)分的結(jié)果顯示，與ICH 組比較，iNSCs 組大鼠的前肢放置成功率和右轉(zhuǎn)成功率升高，mNSS 評(píng)分下降（P均＜0.05），見圖4。

圖4 iNSCs 移植對(duì)ICH 大鼠神經(jīng)功能缺失影響

2.5 iNSCs 移植有效改善ICH 大鼠神經(jīng)元損傷程度

對(duì)各組腦切片進(jìn)行HE 以及尼氏染色。HE染色結(jié)果顯示，Sham 組大鼠的細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，分布均一，胞體完整，染色均勻。ICH 組大鼠可見大量的炎細(xì)胞浸潤，細(xì)胞腫脹，胞膜邊界不清，細(xì)胞排列紊亂。而與ICH 組比較，iNSCs 組大鼠的細(xì)胞腫脹減輕，炎細(xì)胞浸潤減少，細(xì)胞排列相對(duì)均勻。尼氏染色結(jié)果顯示，Sham 組大鼠的尼氏小體陽性的神經(jīng)元數(shù)量較多，神經(jīng)元內(nèi)的尼氏小體含量高，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，染色均勻。ICH 組大鼠的尼氏小體陽性的神經(jīng)元比例減少，部分細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞膜破碎，染色較淺。而與ICH 組比較，iNSCs 組大鼠的尼氏小體陽性神經(jīng)元百分率增加（P＜0.05），凋亡退化的神經(jīng)元數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)相對(duì)規(guī)則，染色均勻，見圖5。

圖5 iNSCs 移植對(duì)ICH 大鼠神經(jīng)元損傷的影響

2.6 iNSCs 移植有效抑制ICH 大鼠血腫周圍神經(jīng)元的凋亡

各組腦切片NeuN/Cleaved-Caspase-3 免疫熒光雙標(biāo)染色分析結(jié)果顯示，與Sham 組比較，ICH 組大鼠血腫周圍NeuN/Cleaved-Caspase-3陽性的凋亡神經(jīng)元數(shù)量增加（P＜0.05）；與ICH 組比較，iNSCs 組大鼠血腫周圍凋亡神經(jīng)元數(shù)量減少（P＜0.05），見圖6。

圖6 iNSCs 移植對(duì)ICH 大鼠血腫周圍神經(jīng)元凋亡的影響

2.7 iNSCs 移植有效提高ICH 大鼠血腫周圍SOD 蛋白的表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示，與Sham 組比較，ICH組大鼠SOD 蛋白的表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與ICH 組比較，iNSCs 組大鼠SOD 蛋白的表達(dá)水平升高（P＜0.05），見圖7。

圖7 iNSCs 移植對(duì)ICH 大鼠血腫周圍SOD 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

ICH 是一種極具破壞性的腦血管病，一旦發(fā)生，會(huì)促使腦組織中的大量神經(jīng)細(xì)胞死亡，引發(fā)神經(jīng)炎癥和神經(jīng)功能障礙，繼而導(dǎo)致患者偏癱或死亡[22]。然而，當(dāng)前常規(guī)的手術(shù)療效有限，對(duì)于ICH 的長(zhǎng)遠(yuǎn)治療急需探尋新型理想的治療手段。有研究[23]發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)以及多向分化的潛能，能夠向大腦損傷區(qū)分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，幫助損傷區(qū)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建，對(duì)于ICH 疾病的治療表現(xiàn)出巨大的潛力。內(nèi)源性NSCs 主要存在于大腦腦室下區(qū)和海馬齒狀回顆粒下區(qū)，數(shù)量較少，其臨床應(yīng)用受限[24]。有研究[25]利用干細(xì)胞多向分化的特性，將誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）誘導(dǎo)為神經(jīng)嵴干細(xì)胞用于增強(qiáng)神經(jīng)肌肉再生。并且MSCs 來源廣泛，也具備向NSCs 分化的特性[18]，提示可將MSCs 誘導(dǎo)分化為NSCs 用以彌補(bǔ)內(nèi)源性NSCs 數(shù)量稀少等不足。以往的研究[20]發(fā)現(xiàn)，MSCs 誘導(dǎo)分化的iNSCs 在治療神經(jīng)損傷中具有較好的潛力。本研究重點(diǎn)觀察了iNSCs 移植治療ICH 大鼠的效果及其對(duì)損傷區(qū)神經(jīng)元的影響，目前類似的研究較少。

Nestin、Sox-2 是神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志蛋白[26]，GAP-43 是神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白，在神經(jīng)發(fā)育和軸突再生中具有重要意義[27]。本研究鑒定了iNSCs表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)蛋白的情況，發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志蛋白Nestin、Sox-2 以及促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育的GAP-43 蛋白，說明成功將間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成了具有神經(jīng)干細(xì)胞特性的細(xì)胞。

紋狀體內(nèi)囊為常見的ICH 部位，內(nèi)囊出血后通常引起嚴(yán)重運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能障礙[28]。為了評(píng)價(jià)iNSCs 對(duì)ICH 大鼠的治療效果，本課題組構(gòu)建了大鼠紋狀體出血模型后，將iNSCs 原位移植于ICH 大鼠內(nèi)囊區(qū)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，iNSCs 移植能夠改善ICH 大鼠的運(yùn)動(dòng)功能。

ICH 會(huì)引發(fā)神經(jīng)元凋亡[29]，Caspase-3 是細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白，Cleaved-Caspase-3 是其活性形式[30]。本研究將NeuN 與Cleaved-Caspase-3 共同標(biāo)記用以觀察各組神經(jīng)元凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，iNSCs 移植抑制了ICH 大鼠神經(jīng)元的凋亡。同時(shí)，組織形態(tài)學(xué)結(jié)果表明，iNSCs 移植能夠減輕ICH 造成的腦組織炎細(xì)胞浸潤，促進(jìn)損傷區(qū)受損神經(jīng)元修復(fù)。以上結(jié)果均證明，iNSCs 移植可以通過保護(hù)損傷區(qū)神經(jīng)元，進(jìn)而促進(jìn)ICH 大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。

細(xì)胞過氧化損傷是ICH 的病理改變之一，SOD 是一種具有抗氧化應(yīng)激特性的蛋白[31]。過表達(dá)銅鋅超氧化物歧化酶（copper/zinc-superoxide dismutase，SOD1）的神經(jīng)干細(xì)胞通過其旁分泌功能和抗氧化損傷能力發(fā)揮對(duì)ICH 大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，iNSCs 移植可提高ICH 大鼠大腦SOD 蛋白表達(dá)水平，說明iNSCs 可能通過良好的抗氧化功能發(fā)揮其神經(jīng)元保護(hù)功能。

綜上所述，iNSCs 可能通過發(fā)揮其抗氧化作用，抑制受損神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。后續(xù)將進(jìn)一步探討iNSCs 發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的具體機(jī)制。本研究結(jié)果將為今后臨床應(yīng)用iNSCs 移植治療ICH 提供理論基礎(chǔ)。