任賀賀， 吳夢靜， 常 青

（1.寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學生育力保持教育部重點實驗室，寧夏回族自治區(qū)生殖與遺傳重點實驗室，銀川 750004）

卵巢是女性重要的生殖與內(nèi)分泌器官。在40 歲以下的女性中，1.0%～1.5%的女性因卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）而面臨提前絕經(jīng)[1]。目前臨床上對于卵巢早衰的治療方法主要有激素療法[2]。對于青春期前患者也采用卵巢組織凍存移植技術[3]。然而，激素療法不能恢復POF患者的生育能力，同時具有潛在致癌風險，而卵巢組織凍存移植技術又有癌細胞回移至體內(nèi)的風險[4]。因此，迫切需要一種安全有效的方法，恢復POF 患者的生育力和內(nèi)分泌功能。組織工程卵巢重建有望解決這一問題[5]。近年來，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）支架作為卵巢再生的方法在生殖醫(yī)學領域引起了廣泛的關注[6-10]。ECM是一種存在于細胞外的三維結構，由周圍細胞分泌，主要由膠原蛋白、彈性蛋白、纖維連接蛋白和層粘連蛋白等組成[11-12]。細胞外基質支架一般由組織或器官脫細胞制作[13]。脫細胞化是通過物理、化學或組合方法從組織中去除細胞，只留下具有三維結構的細胞外基質支架[14-16]。已有報道[17]稱ECM 支架可以與卵泡體細胞進行細胞信號傳導，促進卵泡生長和分化，以及卵母細胞減數(shù)分裂能力。目前用于卵泡培養(yǎng)的ECM 支架多來源于異體的卵巢，這就存在免疫排斥的可能[2]。為了克服這個缺點，本研究選用自體腋下淋巴結作為ECM 支架的來源進行卵巢再生和觀察支架的結構及毒性，并植入腔前卵巢觀察卵泡的生長和功能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J 小鼠購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心，在SPF 實驗室飼養(yǎng)。本實驗通過了寧夏回族自治區(qū)動物保護委員會的批準［SCXK（寧）2014-050］。

1.2 小鼠淋巴結的獲取與脫細胞處理

收集8～10 周齡C57BL/6J 小鼠的淋巴結。分離剔除結締組織和脂肪，用磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate buffer saline，PBS）洗滌淋巴結，然后在-80 ℃冷凍以進行后續(xù)實驗。

脫細胞過程如下所示，分別在-80 ℃和37 ℃進行3 次冷凍和解凍。將淋巴結分別用0.5%十二烷基磺酸鈉（SDS，美國Sigma 公司）處理10 h和1% Triton X-100（美國Sigma 公司）處理24 h，置于室溫下200 r·min-1的搖床上。之后，用50 mL DI-H2O 沖洗支架3 次，每次5 min，轉移到新的50 mL DI-H2O 中，在室溫下用搖床以200 r·min-1洗滌9 h。在37 ℃下，用脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）溶液（40 IU·mL-1；美國Sigma 公司）處理30 min。然后用0.1%過氧乙酸消毒30 min，之后用含1% 100×青鏈霉素（美國Invitrogen 公司）的無菌PBS 洗滌24 h。將處理好的組織隨后放到超低溫冰箱進行保存，而用于再細胞化的淋巴結支架放于培養(yǎng)基中，之后在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中放置24 h。

1.3 新鮮淋巴結與脫細胞淋巴結的形態(tài)分析

新鮮淋巴結、脫細胞淋巴結在4%多聚甲醛中固定6 h。常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為5 μm。石蠟切片常規(guī)脫蠟水合，蘇木素染色1 min，鹽酸乙醇分化3 s，流水沖洗15 min，伊紅染色2 min，乙醇脫水，二甲苯透明封片。石蠟切片經(jīng)脫蠟入水處理后，進行DAPI 染色（北京索萊寶科技有限公司，中國）檢測組織中DNA 的殘余量。封片劑（北京索萊寶科技有限公司，中國）干燥后，經(jīng)熒光倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）拍照觀察上述組織結構。

為了觀察脫細胞淋巴結的結構，脫細胞淋巴結預處理后，采用掃描電子顯微鏡（SEM，中國Servicebio 公司）對樣品進行觀察。

1.4 新鮮淋巴結與脫細胞淋巴結的DNA 含量分析

新鮮淋巴結與脫細胞淋巴結的樣本經(jīng)干燥冷凍機（美國Thermo 公司）干燥。使用電子天平（瑞士Mettle Ttoledo 公司）測量組織干重（G）。之后通過DNA 提取試劑盒（中國TianGen 公司）提取DNA。樣本放入1.5 mL 離心管中，加入200 μL的蛋白酶K，56 ℃裂解3 h。余下提取步驟按說明書（DP304）執(zhí)行。提取后的DNA 溶液（ng·mL-1）通過分光光度計NanoDropRND-1000（美國NanoDrop 公司）在480 nm 的波長下，測定DNA濃度（C）值，然后通過1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，每孔12 μL 的DNA 溶液與2 μL 上樣緩沖液混合上樣。DNA maker 采用1 kb DNA ladder（中國TianGen 公司）（80 V，70 min）。使用Azure C600對DNA 進行可視化和拍照（美國Azure Biosystems公司）。組織中DNA 的含量/干重（ng·mg-1）=（C×100/G）。C=脫細胞支架與新鮮淋巴結DNA 含量（ng·μL-1），每個測量樣本的體積為100 μL，G=脫細胞支架與新鮮淋巴結的干重（mg）。

1.5 脫細胞淋巴結支架對細胞活性的影響

中國倉鼠卵巢細胞（CHO）在含有10%的胎牛血清（美國Invitrogen 公司）和1% 100×青鏈霉素的RPMI-1640 中培養(yǎng)。5×103（eus·mL-1）CHO細胞均勻鋪在96 孔培養(yǎng)皿中，5% CO2、37 °C 培養(yǎng)24 h；24 h 后將脫細胞淋巴結支架切成小塊放入各孔中；對照組CHO 細胞在無支架條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)24、48、72 和96 h 后，分別添加10×CCK-8 溶液，培養(yǎng)4 h 后，在480 nm 的波長下測量各組的吸光度（A）值，計算細胞存活率。細胞存活率=［（As-Ab）/（Ac-Ab）］×100%。As 為含有細胞、培養(yǎng)基、CCK-8 和脫細胞支架孔的吸光度，Ab 為含有培養(yǎng)基和CCK-8 的孔的吸光度，Ac 為含有細胞、培養(yǎng)基和CCK-8 的孔的吸光度。

1.6 小鼠腔前卵泡的分離與注射

雌性C57BL/6J 小鼠出生后12.5 d，頸椎脫位處死。從肋骨脊角逐層切開皮膚和肌肉，露出卵巢。摘除卵巢后，立即將其置于操作培養(yǎng)基中洗滌3 次，該培養(yǎng)基含有L-15（美國Invitrogen 公司）、10%胎牛血清、1%青霉素。之后利用30 G注射針將小鼠的腔前卵泡剝離出來，分離后的卵泡在生長培養(yǎng)基中洗滌3 次，該培養(yǎng)基含有MEM-alpha（美國Invitrogen 公司）、0.33 mmol·L-1丙酮酸鈉（瑞典Sigma 公司）、10%胎牛血清、1%青霉素、1% ITS（美國Invitrogen 公司）、100 mIU·mL-1FSH（中國寧波第二激素廠）。之后用內(nèi)徑大約200 μm 的玻璃管吸取70 μL 的包含5 個腔前卵泡的0.5%海藻酸鹽溶液（瑞典Sigma 公司），之后將海藻酸鹽包裹的卵泡注射到淋巴結內(nèi)，最后將注射后的淋巴結放于140 mmol·L-1氯化鈣溶液中進行交聯(lián)反應。將支架用鑷子夾出放于生長培養(yǎng)基中洗滌3 次后，將支架單獨放置在96 孔板孔中，收集培養(yǎng)基上清液用于雌二醇（estradiol，E2）檢測。收集再細胞化后的支架，檢測CYP-17/A1 和FSHR 陽性的細胞。

1.7 觀察再細胞化淋巴結支架內(nèi)卵泡的形態(tài)

對再細胞化淋巴結進行HE 染色。組織在4%的多聚甲醛中固定6 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片至5 μm 厚。石蠟切片常規(guī)脫蠟水合，蘇木素染色1 min，鹽酸乙醇分化3 s，流水沖洗15 min，伊紅染色2 min，乙醇脫水，二甲苯透明封片。采用TissueFAXS Viewer 軟件（奧地利Tissue Gnostics公司）在第0、4、8、12 天測量再細胞化淋巴結中卵泡長軸和短軸的直徑，取長軸與短軸的平均值作為支架中卵泡的直徑。

1.8 再細胞化淋巴結支架分泌的E2 水平的檢測

在培養(yǎng)再細胞淋巴結過程中，收集第0、4、8、12 天的培養(yǎng)基上清液，采用ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，中國）按試劑盒說明書操作，向孔中加入標準工作溶液和樣品（每孔50 μL），每孔立即加入50 μL 生物素化檢測Ab 工作液，37 °C 孵育45 min 后，洗滌3次后棄去洗滌液。每孔加入100 μL HRP 工作液，37 °C 孵育30 min。每孔加入90 μL 底物試劑，孵育約15 min，全程避光。加入50 μL 停止液后，在450 nm 處，立即測定每孔的光密度（OD）值。

1.9 再細胞化后淋巴結的免疫組化分析

組織在4%的多聚甲醛中固定6 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為5 μm。石蠟切片常規(guī)脫蠟水合，微波法修復抗原。使用兔二步法試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，中國），之后孵育一抗，促卵泡刺激素受體（FSHR，1∶100，中國ABclonal 公司），17α-羥化酶（CYP-17/A1，1∶100，中國ABclonal 公司）37 ℃，60 min。然后按照說明操作。使用熒光倒置顯微鏡拍照觀察上述組織結構和支架內(nèi)卵泡樣細胞CYP-17/A1和FSHR 的陽性表達情況。

1.10 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0 軟件進行分析，圖表由GraphPad Prism 8.0 軟件繪制。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 淋巴結脫細胞支架的形態(tài)學觀察

與未脫細胞的淋巴結比較，淋巴結脫細胞后顏色由紅色變?yōu)榘咨拾胪该鳡?，整體結構完整，器官體積變化不明顯（圖1a）。HE 染色見淋巴結經(jīng)典的皮質和髓質結構，內(nèi)部含大量的淋巴細胞（圖1b）。淋巴結脫細胞支架內(nèi)見網(wǎng)格狀分布的纖維結構，未見到完整的細胞（圖1c）。掃描電鏡見支架內(nèi)大量三維立體結構的細胞外基質纖維，纖維間形成小個空隙（圖1d）。

圖1 小鼠淋巴結脫細胞前后淋巴結的形態(tài)

2.2 脫細胞淋巴結支架細胞內(nèi)容物的去除效率

為了進一步評估淋巴結組織中細胞內(nèi)容物的去除情況，本研究對樣本進行DAPI 染色。淋巴結脫細胞支架內(nèi)見網(wǎng)格狀分布的纖維結構，未見到完整的細胞。與新鮮淋巴結相比，脫細胞淋巴結的DNA 含量降低，去除率為88%［（1 390.0±248.6）ng·mg-1vs.（342.6±116）ng·mg-1］（P＜0.05）。此外，凝膠電泳證實脫細胞支架中DNA含量較低（圖2c），無明亮的DNA 條帶出現(xiàn)，見圖2。

圖2 小鼠脫細胞淋巴結支架細胞內(nèi)容物的去除效率

2.3 脫細胞淋巴結支架對細胞活力的影響

CCK-8 檢測小鼠淋巴結脫細胞支架在與CHO 共培養(yǎng)24、48、72 和96 h 后細胞活力的變化結果顯示，對照組與脫細胞支架組的細胞活力24、48 和96 h 時差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），見圖3。

圖3 脫細胞淋巴結支架對細胞活力的影響

2.4 再細胞化淋巴結支架內(nèi)的卵泡形態(tài)

HE 染色后共培養(yǎng)第4、8、12 天后的再細胞支架結果顯示，淋巴結內(nèi)部的腔前卵泡從第0 天的2～3 層顆粒細胞逐步增殖到多層顆粒細胞。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，卵母細胞偏向卵泡的邊緣，與卵巢內(nèi)卵泡發(fā)育類似。但是隨著顆粒細胞與膜細胞的增殖，卵泡內(nèi)部細胞出現(xiàn)核碎裂或消失，見圖4。

圖4 共培養(yǎng)后再細胞化淋巴結支架中卵泡的形態(tài)

2.5 再細胞化淋巴結支架的卵泡直徑與分泌的E2 水平比較

再細胞化淋巴結HE 染色后測量再細胞化淋巴結中卵泡的直徑結果顯示，第0、4 天的卵泡直徑增長保持穩(wěn)定，第8、12 天卵泡直徑增長加速。培養(yǎng)到第12 天卵泡直徑可達到（248.4±28.9）μm，第8、12 天卵泡直徑均大于第0 天（P均＜0.05），見表1。

表1 再細胞化后淋巴結的體外生長和E2 分泌情況（±s）

表1 再細胞化后淋巴結的體外生長和E2 分泌情況（±s）

與第0 天相比*P＜0.05。

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ELISA 法檢測培養(yǎng)后第0、4、8、12 天的E2水平結果顯示，第0、4 天的E2平均分泌量保持穩(wěn)定，第8、12 天E2水平升高。與第0 天相比，第8、12 天的雌激素水平分泌量均增多（P均＜0.05），見表1。

2.6 再細胞化淋巴結支架中CYP-17/A1 和FSHR 陽性細胞的檢測

免疫組化檢測顯示卵泡在脫細胞淋巴結中的生長狀態(tài)。培養(yǎng)到第12 天后，支架內(nèi)卵泡直徑可達到300 μm 以上，大于注射前的卵泡直徑。并且第12 天后開始出現(xiàn)卵泡腔。此外，在再細胞支架中觀察到FSHR 和CYP-17/A1 陽性細胞，見圖5。

圖5 再細胞化淋巴結支架中CYP-17/A1 和FSHR 陽性細胞的檢測

3 討論

組織工程卵巢對女性原發(fā)性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency，POI）患者的生育能力保存和恢復具有重要意義[18]。組織工程人工卵巢以患者自身細胞或干細胞為種子細胞來源，在異源或同種支架上播種，進行細胞培養(yǎng)，形成具有生殖功能的“人工卵巢”，最后移植入體內(nèi)，恢復女性生殖內(nèi)分泌功能[2]。

本研究使用0.5% SDS 振蕩清洗聯(lián)合反復凍融和核酸酶消化的方法制作淋巴結脫細胞支架，所形成的支架結構完整，有利于后期再細胞化和體內(nèi)植入。顯微結構顯示支架內(nèi)存在網(wǎng)格樣分布的纖維以及纖維之間密集間隙，這為植入的細胞在細胞外基質之間的相互作用，并在空隙間遷移和生長提供了物理條件。Lenti 等[19]在構建淋巴結類器官的過程中也發(fā)現(xiàn)，脫細胞支架可以促進細胞遷移與增殖。也有研究[20]利用脫細胞淋巴結支架進行腎臟的再生。說明淋巴結脫細胞支架具有成為組織工程材料的基本特性，可為細胞的生長、增殖、遷移提供立體環(huán)境。

脫細胞支架中殘余的DNA 是誘導不良免疫反應重要的物質[2]，也會影響再細胞化后細胞的生長[21]。本研究通過DAPI 染色未在脫細胞淋巴結中發(fā)現(xiàn)細胞核的存在，并且通過DNA 定量分析發(fā)現(xiàn)脫細胞淋巴結的DNA 去除率為88%。DNA 去除率與其他研究[9]基本一致，達到組織工程DNA 殘留量的要求，這表明脫細胞淋巴結支架可以為植入的細胞提供一個較低的無淋巴細胞干擾的培養(yǎng)環(huán)境，并可降低后續(xù)體內(nèi)移植所引起的免疫反應。

由于脫細胞過程中使用SDS 去垢劑，殘余量過高時會影響細胞的活力。本研究通過CCK-8檢測脫細胞淋巴結支架對細胞活力的影響。結果表明，在支架與CHO 共培養(yǎng)的過程中，經(jīng)過多次洗滌后，SDS 處理的支架對細胞活力的影響較小。24、48、96 h 與對照組的細胞活力保持相似。Alshaikh 等[8]也證明經(jīng)SDS 去垢劑處理后的組織工程支架，經(jīng)洗滌后也不會影響細胞的生長活力。這表明本研究中制作的支架適合卵巢細胞的生長。

本研究將小鼠的腔前卵泡注射到支架內(nèi)后，經(jīng)過HE 染色發(fā)現(xiàn)，支架內(nèi)的卵泡可以維持一個球形立體的方式生長，卵泡中央為卵母細胞，卵母細胞外周是多層的顆粒細胞，顆粒細胞外側見卵泡膜。隨著培養(yǎng)時間的延長，卵泡逐漸增大，培養(yǎng)第12 天時卵泡的直徑達到第0 天直徑的2 倍多。這表明卵泡可以在脫細胞淋巴結支架內(nèi)生長，并與卵巢內(nèi)的生長模式相類似[22]。Nikniaz 等[23]也成功證明了卵泡在脫細胞支架中能夠生長到腔前卵泡階段。培養(yǎng)基中分泌的E2表明，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，再細胞化淋巴結中的卵泡可以合成雌激素且恢復一定的內(nèi)分泌功能。

FSHR 主要在顆粒細胞中表達，與FSH 結合后刺激顆粒細胞中類固醇激素合成限速酶的表達，在卵泡發(fā)育與卵子成熟中有重要意義[4]。CYP-17/A1 在卵泡膜細胞中表達，主要在調(diào)節(jié)類固醇生成過程中起作用[24]。將腔前卵泡注入脫細胞淋巴結培養(yǎng)第12 天后，再細胞化淋巴結中發(fā)現(xiàn)FSHR 陽性和CYP-17/A1 陽性細胞，表明淋巴結支架中有維持卵母細胞發(fā)育成熟所需的關鍵細胞的存在，并且隨著卵泡體積的增大出現(xiàn)卵泡腔樣的結構，與體內(nèi)卵泡發(fā)育情況相似[25]。因此，本實驗的脫細胞淋巴結支架可以支持小鼠腔前卵泡的體外生長。

本研究仍存在部分缺點需要改進。與體外第3 天培養(yǎng)的卵泡相比[26]，支架內(nèi)的卵泡雖然能保持一個發(fā)育的狀態(tài)，但其內(nèi)部結構出現(xiàn)一定的核固縮等凋亡現(xiàn)象。這可能由于支架的阻礙，細胞無法有效地與培養(yǎng)基進行互換。因此尋找一種合適的培養(yǎng)方法很重要。未來使用一種微流裝置進行動態(tài)培養(yǎng)可能會有改善效果[27]。

綜上所述，淋巴結脫細胞后形成細胞外基質支架，可以支持小鼠腔前卵泡的生長并具有內(nèi)分泌功能，可作為組織工程材料用于人工卵巢的構建。