蔣 鑫， 任 藝， 柳媛媛， 汪 蕊， 馬 剛

（1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院麻醉科，銀川 750004； 3. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化內(nèi)科，銀川 750004； 4.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004）

手術(shù)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療疾病的重要方式，但手術(shù)創(chuàng)傷引發(fā)的并發(fā)癥近年越來(lái)越受到關(guān)注，大量臨床研究表明，術(shù)后并發(fā)癥多以炎性反應(yīng)為基礎(chǔ)[1-2]，如心臟手術(shù)后的急性腎損傷[3]、認(rèn)知功能障礙以及腹部大手術(shù)后的肺損傷[4-5]。因此，如何有效防治術(shù)后炎性反應(yīng)成為亟須解決的臨床問(wèn)題[6-7]。NLRP3（NOD-like receptor protein 3）是NOD 樣受體蛋白家族成員，其在NLRP3 炎癥小體中承擔(dān)著接收炎性信號(hào)的作用[8]。NLRP3 主要由3 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，包括中央核苷酸結(jié)合和寡聚化（NACHT）結(jié)構(gòu)域，富含亮氨酸的重復(fù)序列（LRR）以及pyrin 結(jié)構(gòu)域（PYD）[9]。當(dāng)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β 等炎性信號(hào)刺激LRR 后，NACHT 結(jié)構(gòu)域會(huì)促使PYD 結(jié)構(gòu)域與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）結(jié)合，將半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1 前體（pro-caspase-1）剪切成活化的caspase-1[10-11]，活化的caspase-1 將促進(jìn)IL-1β 和IL-18 剪切成熟[12]，誘發(fā)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)[13-15]，造成多個(gè)器官損害[16-18]。雖然NLRP3 炎癥小體活化是炎性發(fā)展的關(guān)鍵因素之一，但NLRP3 炎癥小體是否參與外周手術(shù)誘導(dǎo)全身無(wú)菌性炎性反應(yīng)尚不明確。為此，本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)探討NLRP3 炎癥小體在外周手術(shù)介導(dǎo)的全身性炎性反應(yīng)中的作用，以期為炎性相關(guān)術(shù)后并發(fā)癥的防治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究通過(guò)了寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2018-020）。14 只8 周齡雄性C57BL/6J 小鼠（25±3）g 采購(gòu)并飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。NLRP3 抗體（ab263899）購(gòu)于Abcam 公司。BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自凱基生物技術(shù)股份有限公司。IL-1β（EK0394）和IL-18（EK0433）ELISA試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司?？俁NA 提取試劑盒（AP-MX-MS-RNA-10G）購(gòu)自康寧公司，第一鏈cDNA 合成試劑盒、定量PCR 試劑盒（AQ601）均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司，所有引物由通用生物（安徽）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 小鼠飼養(yǎng)環(huán)境整潔安靜，飼養(yǎng)條件維持12 h/12 h 白晝循環(huán)光照，室溫（24±2）℃，相對(duì)濕度60%～80%，小鼠自由攝食和飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為對(duì)照組和手術(shù)組（7 只/組）：對(duì)照組不做任何處理；手術(shù)組依據(jù)文獻(xiàn)方法[19]，采用雙側(cè)頸動(dòng)脈剝脫手術(shù)，即禁食12 h 后稱(chēng)重，然后經(jīng)腹腔注射4%的水合氯醛（按劑量：0.1 mL/10 g）麻醉，頸前部剃毛，采用碘伏消毒。麻醉誘導(dǎo)10 min 后，切2.2 cm 的中線頸部切口，分離出1 cm 長(zhǎng)的雙側(cè)頸動(dòng)脈，在避免損傷迷走神經(jīng)的情況下，機(jī)械刺激血管壁100 次。生理鹽水沖洗傷口后，縫合手術(shù)部位。全程在無(wú)菌條件下進(jìn)行，持續(xù)30 min。麻醉期間，恒溫加熱毯維持小鼠體溫在37 °C。處理24 h 后，麻醉小鼠并采集小鼠血液樣本，頸椎脫臼處死小鼠后收集肝組織、脾組織及腦組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 定量PCR 檢測(cè)不同組織IL-1β 和IL-18 mRNA 表達(dá) 采用動(dòng)物組織總RNA 提取試劑盒在術(shù)后24 h 提取小鼠肝臟、脾臟和腦組織中總RNA，參照第一鏈cDNA 合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物，參照mRNA 實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)實(shí)施qPCR 擴(kuò)增。反應(yīng)程序：94 ℃30 s，94 ℃5 s，60 ℃30 s，共44 個(gè)循環(huán)，GAPDH 為mRNA 內(nèi)參，經(jīng)2-△△Ct計(jì)算mRNA 相對(duì)表達(dá)量（表1）。

表1 qPCR 采用的引物序列

1.2.3 Western blot 檢測(cè)不同組織NLRP3 蛋白表達(dá)情況 術(shù)后24 h 收集各組小鼠肝組織、脾組織和腦組織，用超聲研磨儀在4 ℃條件下研磨1 min，并于冰上進(jìn)行30 min 裂解。隨后，4 ℃、12 000×g離心10 min 并收集上清液。BCA 法測(cè)定總蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE（120 V，60 min）。經(jīng)90 min 轉(zhuǎn)膜后，用50 g·L-1脫脂牛奶封閉1 h；兔抗NLRP3 單克隆抗體（1∶10 000）、兔抗β-actin多克隆抗體（1∶10 000）、兔抗GAPDH 多克隆抗體（1∶10 000）4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶20 000），室溫孵育1 h。TBST 清洗后加入ECL 反應(yīng)底物并在暗室曝光和底片掃描，通過(guò)Image J 計(jì)算蛋白質(zhì)條帶灰度值。

1.2.4 炎性因子IL-1β 和IL-18 表達(dá)的檢測(cè) 采用ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)IL-1β 和IL-18 濃度，收集各組全血和腦組織進(jìn)行樣品制備；血漿：全血于4 ℃1 000×g離心10 min，取血漿檢測(cè)；腦組織：組織按比例（100 mg 組織加入1 mL 裂解液）與組織裂解液混合冰上裂解30 min，4 ℃11 000×g離心5 min 取上清液檢測(cè)。ELISA 試劑盒室溫（25～28 ℃）平衡30 min；配制1×洗滌液；取出所需板條放置在框架內(nèi)。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔并加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本；加入生物素標(biāo)記抗體；37 ℃恒溫孵育30 min；加入洗滌液反復(fù)洗板5 次；加入酶標(biāo)抗體；恒溫孵育結(jié)束后反復(fù)洗板5次；加入底物A 和B，混勻后封住反應(yīng)孔孵育15 min；加入終止液終止反應(yīng)，混勻后立即上機(jī)檢測(cè)各孔的光密度（OD）值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD 值為縱坐標(biāo)在Excel 工作表中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2＞0.99，按照曲線方程式得出各樣本濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.01 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本比較采用t檢驗(yàn)，P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)誘發(fā)小鼠血漿炎性因子表達(dá)水平變化

ELISA 法檢測(cè)小鼠血漿炎性因子水平結(jié)果顯示，術(shù)后24 h 手術(shù)組小鼠血漿中IL-1β 水平［（14.02±0.83）pg·mL-1］高于對(duì)照組［（11.47±0.23）pg·mL-1］（P＜0.01）。

2.2 手術(shù)誘發(fā)小鼠肝臟IL-1β mRNA、IL-18 mRNA 和NLRP3 蛋白表達(dá)水平變化

qPCR 和Western blot 檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，手術(shù)組小鼠IL-1β mRNA、IL-18 mRNA和NLRP3 蛋白水平均增高（P均＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 肝臟IL-1β mRNA、IL-18 mRNA 和NLRP3 蛋白表達(dá)水平比較

2.3 手術(shù)誘發(fā)小鼠脾臟IL-1β、IL-18 mRNA 和NLRP3 蛋白表達(dá)水平變化

qPCR 和Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，手術(shù)組小鼠脾臟組織IL-1β mRNA、IL-18 mRNA 和NLRP3 蛋白水平均增高（P均＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 脾臟IL-1β mRNA、IL-18 mRNA 和NLRP3 蛋白表達(dá)水平比較

2.4 手術(shù)對(duì)腦組織IL-1β mRNA、IL-18 mRNA及其蛋白和NLRP3 蛋白表達(dá)的影響

qPCR 結(jié)果表明，手術(shù)組小鼠IL-1β 和IL-18 的mRNA 水平均高于對(duì)照組（P均＜0.05）。ELISA 法檢測(cè)結(jié)果顯示，手術(shù)組小鼠腦組織IL-1β 和IL-18 蛋白水平均高于對(duì)照組（P均＜0.01）。Western blot 結(jié)果顯示，手術(shù)組NLRP3 蛋白水平較對(duì)照組增多（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 腦組織IL-1β、IL-18 mRNA 及其蛋白和NLRP3 蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

手術(shù)可以導(dǎo)致全身性炎性反應(yīng)，若不能有效控制，則會(huì)引發(fā)一系列術(shù)后并發(fā)癥[20-22]。本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[19]，制作經(jīng)典的頸動(dòng)脈剝脫手術(shù)模型來(lái)觀察手術(shù)對(duì)血漿、腦、肝臟等器官炎性反應(yīng)的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠術(shù)后24 h 外周血中IL-1β較對(duì)照組增高，表明手術(shù)可以誘發(fā)血中炎性因子表達(dá)增高。研究[23]表明，手術(shù)可引起外周循環(huán)IL-1β 等炎性因子表達(dá)增高。但關(guān)于NLRP3 炎癥小體在其中作用的研究較少。NLRP3 炎癥小體激活后可介導(dǎo)多種炎性疾病的發(fā)生、發(fā)展，推測(cè)手術(shù)后局部無(wú)菌性炎性反應(yīng)可通過(guò)炎性因子和免疫細(xì)胞激活NLRP3 炎癥小體，產(chǎn)生更多的IL-1β，加重肝臟、脾臟、腦等重要器官損傷。

肝臟存在大量的巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，這些細(xì)胞中含有豐富的NLRP3 蛋白，NLRP3 在肝臟的急性損傷過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[24]。本研究結(jié)果顯示，肝組織中NLRP3、IL-1β 和IL-18 表達(dá)在術(shù)后24 h 增高，表明手術(shù)通過(guò)激活NLRP3 炎癥小體導(dǎo)致肝臟產(chǎn)生炎性反應(yīng)。近期一項(xiàng)關(guān)于脾臟焦亡的研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3、IL-1β 和IL-18 發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[25]。本研究結(jié)果顯示脾臟NLRP3、IL-1β 和IL-18 表達(dá)增高，表明手術(shù)可通過(guò)NLRP3 炎癥小體影響到脾臟的炎性反應(yīng)。

腦是炎癥發(fā)生后最易受炎性因子侵犯的器官之一。炎性因子可通過(guò)直接和間接途徑通過(guò)血腦屏障，引發(fā)大腦炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)[20]。大量的IL-1β積累可以引起神經(jīng)細(xì)胞不同程度的損傷，從而影響到腦功能，這種損傷可以通過(guò)減少I(mǎi)L-1β 的產(chǎn)生來(lái)緩解[26-27]。也有研究[28]表明，抑制IL-18 可以加速修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘，從而削弱神經(jīng)反應(yīng)后的損傷作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，手術(shù)后腦組織IL-1β 和IL-18 的mRNA 表達(dá)增高，同時(shí)，IL-1β和IL-18 蛋白表達(dá)增高。IL-1β 和IL-18 主要通過(guò)NLRP3 炎癥小體相關(guān)通路剪切、激活。本研究也觀察到手術(shù)后腦組織NLRP3 蛋白表達(dá)明顯增加。這些結(jié)果表明，NLRP3 炎癥小體通路參與了手術(shù)引發(fā)的中樞炎性反應(yīng)。Fan 等[29]通過(guò)使用MCC950 抑制NLRP3 炎性小體改善了異氟醚麻醉誘發(fā)的中樞炎性反應(yīng)，因此，推測(cè)阻斷NLRP3可能會(huì)減輕手術(shù)導(dǎo)致的中樞炎性反應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示，手術(shù)后小鼠肝臟、脾臟、腦組織均有不同程度的炎性反應(yīng)及NLRP3 炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)增高，但并未進(jìn)行更加深入的機(jī)制研究，也未觀察這些器官的功能變化，將在將來(lái)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了手術(shù)可以激活NLRP3 炎性小體，促使炎性因子大量產(chǎn)生，誘導(dǎo)全身性炎性反應(yīng)的發(fā)生。NLRP3 炎癥小體可能是防治圍術(shù)期炎性反應(yīng)的一個(gè)重要靶點(diǎn)。