楊曉瑩， 胡東來(lái)， 李 元， 楊 華， 楚元奎，2

（1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，銀川 750004）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。2020 年，全球有近140 萬(wàn)PCa 新發(fā)病例，37.5 萬(wàn)人因PCa 死亡[1]。在中國(guó)男性癌癥患者中，PCa 的發(fā)病率排名第6（8.16%），病死率排名第七（13.61%）[2]。目前，前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）篩查[3]結(jié)合影像學(xué)檢查有效地增強(qiáng)了PCa 的臨床診斷效果[4]。但雄激素受體的變異和PCa 的耐藥及轉(zhuǎn)移等使其診斷、預(yù)后和治療變得更難。因此進(jìn)一步揭示PCa 的分子發(fā)病機(jī)制，尋找新的更加有效地診斷和治療靶點(diǎn)對(duì)于PCa 的臨床診治具有積極意義[5]。

MicroRNAs（miRNAs）是一類(lèi)非編碼RNA，可通過(guò)識(shí)別靶基因3’-非翻譯區(qū)的互補(bǔ)序列導(dǎo)致mRNA 降解或抑制蛋白的翻譯，包括PCa 在內(nèi)的一些惡性腫瘤的起始和進(jìn)展與miRNAs 的異常表達(dá)密切相關(guān)[6]。miR-30 和miR-214-5p 可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[7-8]。已知miR-3064-5p 在肝癌、胃癌、宮頸癌等多種癌癥中表達(dá)下調(diào)，并發(fā)揮抑癌作用[9-11]。作為抑癌分子的miR-3064-5p 在多種癌癥中表達(dá)下調(diào)，其機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。有研究[12]表明，包括DNA 甲基化、組蛋白修飾等在內(nèi)的表觀遺傳學(xué)修飾調(diào)控著癌癥進(jìn)展中抑癌分子的表達(dá)。DNA 甲基化修飾可通過(guò)增強(qiáng)miRNAs 啟動(dòng)子內(nèi)CpG 區(qū)域的甲基化，導(dǎo)致miRNAs 的表達(dá)下調(diào)[13-14]。一些抑癌miRNAs，如miR-27a、miR-141 和miR-200C 已被證明在PCa 中呈高甲基化狀態(tài)[15-16]。

課題組前期研究[17]證實(shí)，miR-3064-5p 在PCa細(xì)胞中的表達(dá)降低。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-3064-5p 啟動(dòng)子區(qū)存在CpG 島，提示其可能受到了DNA 甲基化調(diào)控的影響。本研究通過(guò)使用去甲基化藥物地西他濱（decitabine，DAC）處理PCa細(xì)胞，甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR，MSP）和qRT-PCR 檢測(cè)miR-3064-5p 啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)和表達(dá)水平，明確PCa 細(xì)胞中miR-3064-5p 的沉默是否與甲基化調(diào)控有關(guān)，以期為后續(xù)miR-3064-5p 的相關(guān)抗腫瘤研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人前列腺癌細(xì)胞22RV1、DU145、PC3 細(xì)胞及正常前列腺細(xì)胞RWPE-1 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 試劑 RPMI1640 培養(yǎng)基和DMEM 高糖培養(yǎng)基購(gòu)自上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清購(gòu)自以色列Biological Industries 公司；DAC購(gòu)自上海藍(lán)木化工有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Lipofectamine 2000 transfection kit、TRNzol A-RNA 提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒、重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒、Golden Easy PCR System 產(chǎn)品購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；E-Cadherin、Vimentin和PCNA 抗體購(gòu)自Santa Cruz 公司；β-Actin、GAPDH、DNMT3B、山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-HRP 購(gòu)自Proteintech 公司；miR-3064-5p 模擬物（mimics）和陰性對(duì)照（NC）由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

圖1 過(guò)表達(dá)miR-3064-5p 對(duì)DU145 細(xì)胞增殖遷移能力的影響

圖2 miR-3064-5p 在正常前列腺上皮和前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

圖3 miR-3064-5p 啟動(dòng)子甲基化分析

圖4 DAC 對(duì)DU145 細(xì)胞中miR-3064-5p 啟動(dòng)子甲基化水平的影響

圖5 DAC 通過(guò)DNA 甲基化對(duì)DU145 細(xì)胞中miR-3064-5p 的影響

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 DU145 和PC3 細(xì)胞使用RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)；22RV1 細(xì)胞使用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；RWPE-1 細(xì)胞使用KSFM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染以及藥物處理：1）使用Lipofectamine 2000 試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，所有操作均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。2）將DAC 溶于DMSO 配制成儲(chǔ)存液，使用前加入完全培養(yǎng)液配制成濃度為5 μmol·L-1和10 μmol·L-1的工作液。

1.2.2 qRT-PCR 檢測(cè) TRizol 法提取各組細(xì)胞總RNA，NanoDrop one 分光光度計(jì)（Gene 公司）測(cè)定總RNA 濃度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和ChamQ SYBR qPCR Master Mix 試劑盒（南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司）對(duì)RNA 樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR 檢測(cè)，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。使用StepOne 熒光定量PCR 儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃，5 min；95 ℃，15 s；58 ℃，15 s；70 ℃，15 s；共40 個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，以U6 作為內(nèi)參對(duì)照。miR-3064-5p、U6 反轉(zhuǎn)錄引物和擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1、表2。

表1 反轉(zhuǎn)錄引物序列

表2 PCR 擴(kuò)增引物序列

1.2.3 生物信息學(xué)分析 使用UCSC 基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//genome.ucsc.edu）提取miR-3064-5p啟動(dòng)子3 000 bp 的基因序列，以在線軟件（https：//www.genscript.com/sms2/cpg_islands.html）分析miR-3064-5p 上游3 000 bp 的啟動(dòng)子區(qū)域的CpG 島。使用Methprimer 在線軟件（http：//www.urogene.org/methprimer/）在CpG 島區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)甲基化和非甲基化檢測(cè)引物。

1.2.4 DNA 的提取 使用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒提取細(xì)胞總DNA，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。使用NanoDrop one 分光光度計(jì)測(cè)定總DNA 濃度。

1.2.5 DNA 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化 使用重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒對(duì)所得細(xì)胞的總DNA 進(jìn)行亞硫酸鹽修飾，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.6 甲基化特異性PCR（MSP） 使用Golden Easy PCR System 產(chǎn)品，對(duì)重亞硫酸鹽處理的DNA 樣品進(jìn)行PCR 檢測(cè)。PCR 反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃，4 min；95 ℃，15 s；58 ℃，15 s；72 ℃，15 s；72 ℃，10 min；共35 個(gè)循環(huán)。取15 μL 反應(yīng)產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（110 V，20 min）。Image J 測(cè)量各基因的相對(duì)表達(dá)量，GAPDH 作為內(nèi)參。GAPDH 等擴(kuò)增引物見(jiàn)表2。

1.2.7 平板克隆實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染48 h 后的DU145細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以300 個(gè)/孔的密度接種于6 孔板中。置于培養(yǎng)箱中，連續(xù)培養(yǎng)10 d。多聚甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)＞100 個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.2.8 劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DU145 細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后使用槍頭對(duì)各孔平行畫(huà)線，PBS 洗后加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，對(duì)各孔細(xì)胞于指定位置進(jìn)行拍照，Image J 測(cè)量細(xì)胞遷移面積并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.9 Western blot 檢測(cè) 收集DAC 處理和轉(zhuǎn)染的DU145 細(xì)胞，Western blot 法檢測(cè)E-Cadherin、Vimentin、PCNA、DNMT3B、GAPDH 的表達(dá)。操作如下：使用試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，蛋白定量檢測(cè)（BCA）法測(cè)定蛋白含量，每組各取40 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5% 脫脂奶粉溶液封閉，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 漂洗，二抗室溫孵育2 h，TBS-T 漂洗，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯影，照相，Image J 軟件測(cè)量各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Graphad Prism 8.0 和SPSS 19.0 分析軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)miR-3064-5p 降低DU145 細(xì)胞的增殖和遷移能力

qRT-PCR 檢測(cè)miR-3064-5p mimics 的轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果顯示，與NC 組相比，轉(zhuǎn)染miR-3064-5p mimics 48 h 后，DU145 細(xì)胞中miR-3064-5p的表達(dá)水平增強(qiáng)（圖1A）。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)和Western blot 實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，與NC 組相比，miR-3064-5p 轉(zhuǎn)染組DU145 細(xì)胞的遷移能力和克隆形成能力降低（圖1B、圖1C）；miR-3064-5p 轉(zhuǎn)染組PCNA 和Vimentin 的表達(dá)均降低，E-Cadherin 的表達(dá)升高（圖1D）。

2.2 miR-3064-5p 在正常前列腺上皮和前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

qRT-PCR 檢測(cè)各細(xì)胞中miR-3064-5p 的表達(dá)結(jié)果顯示，與正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1細(xì)胞相比，前列腺癌細(xì)胞株中miR-3064-5p 的表達(dá)均下調(diào)（P均＜0.01），見(jiàn)圖2。

2.3 miR-3064-5p 啟動(dòng)子甲基化分析

使用UCSC 網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，miR-3064-5p 啟動(dòng)子區(qū)存在1 個(gè)CpG 島（圖3A）。MSP 檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常前列腺上皮細(xì)胞相比，22RV1、DU145 和PC3 細(xì)胞中miR-3064-5p 啟動(dòng)子甲基化水平增強(qiáng)（圖3B）。

2.4 DAC 對(duì)DU145 細(xì)胞中miR-3064-5p 啟動(dòng)子甲基化水平的影響

MSP 結(jié)果顯示，DAC 處理后，DU145 細(xì)胞中miR-3064-5p 啟動(dòng)子甲基化特異性產(chǎn)物減少（圖4A），Western blot 檢測(cè)DNMT3B 的表達(dá)結(jié)果顯示，DAC 處理后，DNMT3B 的表達(dá)降低（圖4B）。

2.5 DAC 恢復(fù)了DU145 細(xì)胞中miR-3064-5p的表達(dá)和作用

qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，與0 μmol·L-1組相比，5 μmol·L-1和10 μmol·L-1DAC 處理的DU145 細(xì)胞中miR-3064-5p 的表達(dá)均升高（P均＜0.05），并且在本研究劑量范圍內(nèi)，隨著DAC濃度升高，miR-3064-5p 的表達(dá)也隨之增強(qiáng)（圖5A）。Western blot 結(jié)果顯示，DAC 處理后，PCNA和Vimentin 的表達(dá)均降低，E-Cadherin 的表達(dá)增強(qiáng)（P均＜0.05），并且隨著DAC 處理濃度升高，PCNA 和Vimentin 的表達(dá)逐漸降低，E-Cadherin的表達(dá)則逐漸增強(qiáng)（圖5B）。

3 討論

PCa 在男性全球癌癥發(fā)病率中排名第2，是男性癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。目前對(duì)PCa 的治療方法，包括前列腺切除術(shù)、放療和雄激素剝奪治療（ADT）等，提高了存活率，但晚期PCa 治療效果仍然較差。因此，開(kāi)發(fā)針對(duì)PCa 的額外療法具有重要意義。

miRNAs 是一種內(nèi)源性非編碼小分子，通過(guò)降解mRNAs 和抑制蛋白質(zhì)合成來(lái)影響細(xì)胞的生物過(guò)程。研究[18]發(fā)現(xiàn)，miRNAs 影響著癌癥發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程，并且在多種癌癥中被作為潛在的診斷和預(yù)后標(biāo)記物。miR-30 可靶向PCa 中重要的致癌基因ERG，過(guò)表達(dá)miR-30 可抑制PCa 細(xì)胞的遷移和侵襲[7]。近年來(lái)，miR-3064-5p 作為抑癌基因在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)在癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在失調(diào)，它的異常表達(dá)可參與腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[9-11]。有研究[9]報(bào)道，miR-3064-5p 在肝癌中低表達(dá)，可靶向HMGA2 來(lái)抑制HCC 的惡性進(jìn)展；miR-3064-5p 在胃癌阿霉素耐藥細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-3064-5p 逆轉(zhuǎn)了對(duì)胃癌細(xì)胞的阿霉素耐藥性和腫瘤進(jìn)展的影響[10]。miR-3064-5p 作為一種抑癌分子，在多種癌中表達(dá)降低的調(diào)控機(jī)制報(bào)道較少。本課題組前期研究[17]，發(fā)現(xiàn)miR-3064-5p 具有抑制PCa 細(xì)胞增殖和遷移的能力，與正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1 相比，miR-3064-5p在22RV1、DU145 和PC3 細(xì)胞中的表達(dá)均降低。PCa 細(xì)胞中miR-3064-5p 表達(dá)降低而促進(jìn)PCa進(jìn)展的機(jī)制是本課題組關(guān)注的焦點(diǎn)。

DNA 甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的表觀遺傳修飾驅(qū)動(dòng)了前列腺的癌變[19]。PCa 的進(jìn)展、神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)分化和治療反應(yīng)均受到表觀遺傳學(xué)的調(diào)控[20]。包括PCa 在內(nèi)的許多癌癥的異常是由DNA 甲基化調(diào)控miRNAs 的表觀遺傳變化引起的[21]。在PCa 中，miR-27a-5p 啟動(dòng)子被DNA 甲基化調(diào)控，其表達(dá)被沉默，從而刺激癌細(xì)胞增殖和存活，促進(jìn)了PCa 的惡性進(jìn)展[15]。本研究探究了miR-3064-5p 在PCa 細(xì)胞中表達(dá)沉默是否與DNA 甲基化調(diào)控有關(guān)，課題組使用生信軟件預(yù)測(cè)miR-3064-5p 啟動(dòng)子區(qū)存在CpG島，MSP 檢測(cè)證實(shí)PCa 細(xì)胞中miR-3064-5p 啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平高于前列腺上皮細(xì)胞，因此推斷miR-3064-5p 可能受到甲基化的調(diào)控。為進(jìn)一步明確miR-3064-5p 啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化狀態(tài)與其低表達(dá)有關(guān)，DAC 處理DU145 細(xì)胞后，MSP 檢測(cè)結(jié)果表明DAC 處理后miR-3064-5p啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平降低，Western blot 檢測(cè)甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3B 蛋白表達(dá)降低，qRTPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-3064-5p 表達(dá)增強(qiáng)，并呈濃度依賴(lài)性升高。有研究[22]報(bào)道，miR-193b 啟動(dòng)子的高甲基化有助于侵襲性PCa 的進(jìn)展，通過(guò)DNMT 抑制劑（DAC）和HDAC 抑制劑治療可以恢復(fù)miR-193b 的表達(dá)從而抑制腫瘤的進(jìn)展。本課題組使用Western blot 檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)對(duì)于miR-3064-5p 的重新激活，DAC 恢復(fù)了其對(duì)PCa 細(xì)胞增殖和遷移的抑制能力。上述結(jié)果證實(shí)，PCa 細(xì)胞中miR-3064-5p 的低表達(dá)確實(shí)與其啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化狀態(tài)有關(guān)，使用去甲基化藥物DAC 可通過(guò)降低miR-3064-5p 啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平促進(jìn)其表達(dá)，從而恢復(fù)它的抑癌能力。

本研究結(jié)果進(jìn)一步揭示了PCa 細(xì)胞中miR-3064-5p 的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，將有助于更好地闡釋miR-3064-5p 的抑癌作用和機(jī)制，為未來(lái)表觀遺傳抑制劑或合成miR-3064-5p 模擬物作為治療前列腺惡性腫瘤的輔助治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。