張莉，張磊，王艷梅，章辰琛，王鑫

（皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，安徽六安 237005）

心血管疾病是我國疾病死亡的主要原因，許多心臟疾病治療過程中都會出現(xiàn)心肌纖維化［1-2］。萊菔硫烷（sulforaphane，SFN）是我國的傳統(tǒng)中藥，主要存在于十字花科植物，如西蘭花、甘藍、花椰菜等［3］。SFN的有效成分是異硫氰酸鹽，具有抗氧化、抗炎、抗癌、誘導(dǎo)凋亡等作用，對心血管、神經(jīng)和癌癥等疾病均具有預(yù)防治療的潛力［4-5］。SFN尚具有抑制心肌、結(jié)膜、肝的纖維化的功能［6-8］，但是其發(fā)揮作用的具體機制尚不十分清楚。本研究擬以心肌成纖維細(xì)胞為研究對象，檢測SFN對其增殖、侵襲、氧化應(yīng)激和纖維化的影響，并揭示其與TGFβ1/Smads信號通路之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 10周齡普通級雌性SD大鼠3只，體重（220±30）g，購自廣東醫(yī)學(xué)實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK（皖）2019-0004。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本研究符合實驗動物的倫理原則。

1.2 材料 SFN（貨號：S10740）購自上海吉至生化科技有限公司；TGF-β1（貨號：TR-1003-50UL），購自上海浩然生物公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Transwell小室購自美國Corning公司；兔抗人MMP-9、α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、TGF-β1、p-Smad3、p-Smad2、Smad2/3抗體均購自上海艾博抗公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自北京博爾西科技公司；活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞的分離培養(yǎng) 30 mg/kg的劑量腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉正常飼養(yǎng)的大鼠，無菌摘取心臟，放入青霉素小瓶中。再將心臟剪成約1 mm3的小碎塊，均勻鋪在培養(yǎng)瓶底部，用含15%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)，4 h翻轉(zhuǎn)瓶身，每隔1 d更換1次培養(yǎng)液。直至細(xì)胞生長至鋪滿瓶底，進行傳代。使用傳至3代的心肌成纖維細(xì)胞用于本研究。

1.3.2 實驗分組與處理 將培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞分為對照組、TGF-β1組及SFN處理組（5、10、20 μg/ml）。對照組為正常培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞；TGF-β1 組為10 ng/ml TGF-β1處理的心肌成纖維細(xì)胞；SFN處理組為使用5、10、20 μg/ml的SFN聯(lián)合TGF-β1共同處理的細(xì)胞。

1.3.3 CCK8法檢測細(xì)胞的活性 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后調(diào)整濃度至1×105個/ml。將細(xì)胞懸液接種于96 孔板中，100 μl/孔，培養(yǎng)12 h 使其充分貼壁于96 孔板后，加入新鮮培養(yǎng)基并予以相對應(yīng)的刺激處理，分別培養(yǎng)12 、24、48 h。棄去舊液加10 μl CCK-8溶液，孵育2 h 后于酶標(biāo)儀490 nm 處測吸光度。每個樣本設(shè)置3個重復(fù)，實驗重復(fù)3次。

1.3.4 Transwell法檢測細(xì)胞遷移 先對需要檢測的細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng)液饑餓處理12 h，將細(xì)胞調(diào)整至105個/ml，待用。取200 μl細(xì)胞涂抹在小室的上室表面，下室加入500 μl含營養(yǎng)因子血清的培養(yǎng)液，37 ℃常規(guī)培養(yǎng)12 h。用結(jié)晶紫溶液染色后，顯微鏡下觀察發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)量，計數(shù)、取平均值。

1.3.5 Western blot法檢測細(xì)胞中MMP-9、α-SMA、Col Ⅰ、 Col Ⅲ、 p-Smad3、 p-Smad2、 Smad4、Smad2/3的蛋白表達 將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細(xì)胞用細(xì)胞裂解液在冰上充分裂解，提取總蛋白。對蛋白進行定量、沸水浴變性處理后，用上清液作為蛋白電泳的上樣模板。電泳結(jié)束后，瓊脂膠上的蛋白用轉(zhuǎn)膜儀在4 ℃環(huán)境下，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜。將膜在室溫下用2%的脫脂奶粉封閉30 min，在將膜浸入一抗稀釋液（兔抗人MMP-9、α-SMA、Col Ⅰ、Col Ⅲ、TGF-β1、p-Smad3、p-Smad2、Smad2/3抗體）（1∶1 000～1∶2 500）孵育過夜（4 ℃），取出膜充分清洗。接著將膜浸入二抗稀釋液（辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗）（1∶500），37 ℃孵育2 h，洗滌。滴加ECL顯色液進行顯影，曝光。蛋白的相對表達量用目的蛋白的灰度值與β-actin的灰度值之間的比值表示。

1.3.6 ELISA法檢測細(xì)胞上清液中氧化應(yīng)激相關(guān)因子的含量 收集需要檢測的細(xì)胞上清液，使用ROS、MDA、GSH、SOD試劑盒檢測不同組細(xì)胞上清液中ROS、MDA、GSH、SOD的含量。實驗重復(fù)3次，每次做3個復(fù)孔。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用LSD-t檢驗；2組比較使用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SFN對TGF-β1誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響 與對照組比較，TGF-β1組細(xì)胞在24、48、72 h時的細(xì)胞增殖均顯著升高（P＜0.05）；與TGF-β1組比較，5、10、20 μg/ml SFN組細(xì)胞在24、48、72 h時的增殖均顯著降低（P＜0.05）。見表1。

表1 SFN抑制TGF-β1誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖（±s，n=3）

表1 SFN抑制TGF-β1誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖（±s，n=3）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與TGF-β1組比較，2）P＜0.05

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2.2 SFN抑制TGF-β1誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞遷移 與對照組（87±5）比較，TGF-β1組細(xì)胞發(fā)生遷移的個數(shù)為（233±17），顯著升高（P＜0.05）；與TGF-β1組比較，5、10、20 μg/ml SFN組細(xì)胞發(fā)生遷移的個數(shù)顯著降低［分別為（181±22、161±18、156±12）］（P＜0.05）。

2.3 SFN抑制TGF-β1誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞中MMP-9、α-SMA、ColⅠ、ColⅢ蛋白表達 與對照組比較，TGF-β1組細(xì)胞中MMP-9、α-SMA、ColⅠ、ColⅢ蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與TGF-β1組比較，5、10、20 μg/ml SFN組細(xì)胞中MMP-9、α-SMA、ColⅠ、ColⅢ蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。見圖1、表2。

圖1 SFN抑制TGF-β1誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞中MMP-9、α-SMA、ColⅠ、ColⅢ蛋白的表達

表2 SFN對MMP-9、α-SMA、ColⅠ、ColⅢ蛋白表達的影響（±s，n=3）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與TGF-β1組比較，2）P＜0.05

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2.4 SFN對TGF-β1誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與對照組比較，TGF-β1組細(xì)胞中ROS、MDA的表達量顯著升高，GSH、SOD的表達量顯著降低（P＜0.05）。與TGF-β1組比較，5、10、20 μg/ml SFN組細(xì)胞ROS、MDA的表達量顯著降低（P＜0.05），GSH、SOD的表達量顯著升高（P＜0.05）。見表3。

表3 SFN對氧化應(yīng)激相關(guān)因子表達的影響（±s，n=3）

表3 SFN對氧化應(yīng)激相關(guān)因子表達的影響（±s，n=3）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與TGF-β1組比較，2）P＜0.05

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2.5 SFN對TGF-β1/Smads信號通路活性的調(diào)控 與對照組比較，TGF-β1組細(xì)胞中TGF-β1、Smad2/3蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），p-Smad3、p-Smad2的蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與TGF-β1組比較，5、10、20 μg/ml SFN 組細(xì)胞TGF-β1、Smad2/3的蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），p-Smad3、p-Smad2的蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。見圖2、表4。

圖2 SFN對TGF-β1/Smads 信號通路關(guān)鍵蛋白表達的影響

表4 SFN對TGF-β1/Smads 信號通路關(guān)鍵基因蛋白表達的影響（±s，n=3）

表4 SFN對TGF-β1/Smads 信號通路關(guān)鍵基因蛋白表達的影響（±s，n=3）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與TGF-β1組比較，2）P＜0.05

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3 討論

心肌成纖維細(xì)胞發(fā)生纖維化的標(biāo)志物有ColⅠ、ColⅢ、α-SMA等［9］。SFN在動物實驗研究中應(yīng)用普遍。胡麗貞等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，SFN預(yù)處理高脂肪損傷的心肌細(xì)胞能夠顯著地增強受損心肌細(xì)胞的活力，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，上調(diào)線粒體膜電位、線粒體琥珀酸脫氫酶活性；不僅如此，SFN預(yù)處理高糖誘導(dǎo)的損傷心肌細(xì)胞后，線粒體琥珀酸脫氫酶活性上調(diào)、線粒體膜電位也均顯著升高，ROS含量明顯降低。這證明，SFN對體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞具有保護作用。饒?zhí)m蘭等［11］制作心肌缺血再灌注損傷的大鼠模型，用SFN治療后，心臟組織心肌梗死面積明顯降低，大鼠血清中4項心肌酶含量均明顯降低，心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低。伊雪等［12］在大鼠心臟移植缺血再灌注損傷的研究中報道，SFN處理的大鼠心肌組織中p-Akt和p-GSK-3β表達異常上升，揭示SFN減輕心臟移植缺血再灌注損傷的機制與Akt/GSK-3β信號通路的活性相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，5、10、20 μg/ml SFN均抑制TGF-β1誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖和遷移，抑制細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)和纖維化標(biāo)志物α-SMA、ColⅠ、ColⅢ的蛋白表達水平，證實SFN在體外對心肌成纖維細(xì)胞纖維化的抑制作用。

TGF-β1、p-Smad3、p-Smad2作為TGF-β1/Smads信號通路的關(guān)鍵因子，對信號通路的活性至關(guān)重要［13］。據(jù)報道，TGF-β1促進多種組織發(fā)生纖維化［14-16］，其主要通過TGF-β1/Smad信號通路發(fā)揮作用。石斌豪等［17］的研究發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死中，TGF-β1/Smads信號通路的活性異常升高，促進成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為纖維細(xì)胞，揭示TGF-β1/Smads信號通路抑制劑的研發(fā)在心肌梗死后的纖維化中的治療價值。牛丕蓮等［18］的研究發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞纖維化中，TGF-β1/Smads信號通路活性異常升高，而枸杞中綠原酸處理后，該信號通路的活性得到抑制，成纖維細(xì)胞的增殖和纖維化程度均明顯降低，說明枸杞中綠原酸發(fā)揮抑制心肌成纖維細(xì)胞纖維化的功能與失活TGF-β1/Smads信號通路有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，SFN也呈濃度依賴性抑制TGF-β1、p-Smad3、p-Smad2、Smad4的表達，失活TGF-β1/Smads信號通路的活性，發(fā)揮與枸杞中綠原酸相似的作用。這些結(jié)果揭示SFN的抑制TGF-β1誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖、遷移、氧化應(yīng)激和纖維化功能與其對TGF-β1/Smads信號通路活性的抑制相關(guān)。

綜上所述，SFN可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖、遷移、氧化應(yīng)激和纖維化，其作用機制之一為抑制TGF-β1/Smads信號通路的活性，為SFN用于臨床治療心臟疾病奠定理論基礎(chǔ)。