姜玉秋，王頔*，姚遠(yuǎn)，閆智永，張爽

（1. 沈陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科，遼寧沈陽 110002；2. 遼寧省人民醫(yī)院腫瘤二科）

喉癌是頭頸部常見惡性腫瘤之一，占全身惡性腫瘤的1%～5%，發(fā)病人群以40 歲以上中老年男性為主，也有年輕化趨勢(shì)，已嚴(yán)重威脅到人們生命健康和生活質(zhì)量［1-3］。順鉑作為一種重要的腫瘤化療藥物，通過形成Pt-d（GpG）二元加成物破壞癌細(xì)胞DNA 而殺傷癌細(xì)胞［4-5］。喉癌目前的治療方案首選手術(shù)聯(lián)合放、化療，順鉑作為常見的化療藥物常單獨(dú)或者聯(lián)合治療頭頸部惡性腫瘤，但因其較大的毒副作用，患者易出現(xiàn)骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)等嚴(yán)重的不良反應(yīng)，嚴(yán)重限制了順鉑的用藥時(shí)間及劑量，因此迫切需要尋找毒性較小的臨床配伍用藥［6-7］。PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡抵抗和腫瘤發(fā)生的經(jīng)典通路，參與了多種人類腫瘤細(xì)胞自噬的調(diào)控［8-9］。研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT 通路抑制劑LY294002 可通過細(xì)胞自噬作用提高某些抗腫瘤藥物的療效，減少化療抵抗［10-11］。本研究探討LY294002 聯(lián)合順鉑對(duì)人喉癌HEP-2 細(xì)胞產(chǎn)生的藥理學(xué)功效，尤其是細(xì)胞自噬在這個(gè)過程中所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人喉表皮樣癌細(xì)胞株HEP-2 購自美國細(xì)胞保存中心（ATCC）；所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素以及鏈霉素購自美國Thermo 公司；LY294002、順鉑購自美國Sigma 公司；Muse 細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購自美國Millipore 公司；高純度RNA 提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒購自瑞士Roche 公司；Power SYBR Green PCR 預(yù)混液、RIPA細(xì)胞裂解液購自美國Life Technologies公司；細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購自美國Promega 公司；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、蛋白酶抑制劑及其他化學(xué)試劑購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將HEP-2 細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃，5%CO2，含15%胎牛血清、100 U/ml 的青霉素、100 μg/ml的鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。

1.3 細(xì)胞增殖檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，將濃度為1×104/ml 的HEP-2 細(xì)胞接種于96 孔板各孔中，待細(xì)胞進(jìn)行無血清同步化處理后加入（0、1、2、5、10、20及50 μg/ml）LY294002進(jìn)行孵育，另以（0、0.5、1、2、5、10 及20 μg/ml）DMF 處理組為對(duì)照，分別培養(yǎng)24、48 h 后，各孔加入50 μl MTT 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處的吸光度值，了解細(xì)胞增殖情況。

1.4 細(xì)胞活力的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，將濃度為5×105/ml 的HEP-2 細(xì)胞接種于6 孔板各孔中，細(xì)胞進(jìn)行無血清同步化處理24 h 后加入（0、1、2、5、10、20 及50 μg/ml）LY294002 進(jìn)行孵育，分別培養(yǎng)24、48 h 后，應(yīng)用Muse Cell Analyzer 全能細(xì)胞狀態(tài)分析儀測(cè)定HEP-2 細(xì)胞活力。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，將濃度為1×104/ml 的HEP-2 細(xì)胞接種于96 孔板各孔中，待細(xì)胞進(jìn)行無血清同步化處理后加入2 μg/ml LY294002以及（0、0.5、1、2及5 μg/ml）順鉑進(jìn)行孵育，另以（0、0.5、1、2、5、10 及20 μg/ml）順鉑處理組為對(duì)照，分別培養(yǎng)24、48 h 后，各孔加入50 μl MTT 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處的吸光度值，了解細(xì)胞增殖情況。

1.5 微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3B）熒光檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，將濃度為5×105/ml HEP-2 細(xì)胞分別接種于6 孔板各孔中，待細(xì)胞鋪滿率＞75%進(jìn)行無血清同步化處理，然后進(jìn)行給藥處理24、48 h（藥物濃度順鉑為1 μg/ml，LY294002 濃度為2 μg/ml）。LY294002 聯(lián)合順鉑共同孵育后，用預(yù)冷的PBS 清洗各孔5 min×3 次；各孔再加入4%甲醛固定10 min，再次用預(yù)冷的PBS 清洗各孔5 min×3 次；室溫封閉2 h；LC3B 一抗4 ℃過夜；PBS沖洗5 min×3次，DyLight 488熒光標(biāo)記的二抗（1∶200 稀釋）孵育1 h；PBS 沖洗5 min×3 次，加入DAPI 染色劑復(fù)染10 min。最后應(yīng)用熒光共聚焦顯微鏡Leica DMI6000B進(jìn)行熒光觀察。

1.6 RNA 的提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR （RTqPCR） 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞培養(yǎng)在60 mm 培養(yǎng)皿中，每個(gè)接種2.0×107個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿率＞50%時(shí)，換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 進(jìn)行同步化處理，然后進(jìn)行給藥處理48 h（藥物濃度順鉑為1 μg/ml，LY294002 濃度為2 μg/ml）。按照高純度RNA 提取試劑盒提取總RNA。利用試劑盒進(jìn)行cDNA 第一條鏈的合成。按照Power SYBR Green PCR 預(yù)混液試劑盒說明書進(jìn)行操作，25 μl 反應(yīng)體系包括：1×SYBR Green 染液，上游及下游引物各0.25 mmol/L 以及10 ng cDNA。具體的循環(huán)參數(shù)為：50 ℃2 min，95 ℃2 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min 進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照計(jì)算Ct值，將Ct 值輸入相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析模板，選擇合適的參照和分析參數(shù)，使用2-ΔΔCt計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析、t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LY294002 對(duì)HEP-2 細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示，與單獨(dú)培養(yǎng)基設(shè)立的空白對(duì)照組比較，不同劑量LY294002 對(duì)HEP-2 細(xì)胞生長的抑制效果不明顯。而隨著作用時(shí)長的延長，LY294002 也未顯現(xiàn)出對(duì)HEP-2 細(xì)胞生長有明顯的抑制作用。DMF 也未對(duì)HEP-2 細(xì)胞的生長有任何的影響。見圖1、圖2。

圖1 MTT檢測(cè)LY294002（A）和DMF（B）對(duì)HEP-2細(xì)胞生長增殖的影響（24 h）

圖2 MTT檢測(cè)LY294002（A）和DMF（B）對(duì)HEP-2細(xì)胞生長增殖的影響（48 h）

2.2 LY294002 對(duì)HEP-2 細(xì)胞活力的影響 細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果表明，LY294002 處理24 h 時(shí)對(duì)HEP-2細(xì)胞活力的作用效果不明顯，死細(xì)胞數(shù)增加不顯著；而當(dāng)作用時(shí)長延長到48 h 時(shí)，LY294002 處理對(duì)HEP-2 細(xì)胞的作用并沒有因?yàn)闀r(shí)間的延長有所改變，細(xì)胞數(shù)下降不明顯，細(xì)胞活力抑制作用仍然較弱。見圖3。

圖3 LY294002處理24 h（A）和48 h（B）對(duì)HEP-2細(xì)胞活力的影響

2.3 LY294002 聯(lián)合順鉑對(duì)HEP-2 細(xì)胞生長的作用 單獨(dú)順鉑處理時(shí)，低劑量順鉑對(duì)HEP-2 細(xì)胞無明顯毒性反應(yīng)，當(dāng)順鉑劑量達(dá)到2 μg/ml 以上時(shí)，開始對(duì)HEP-2 細(xì)胞的生長顯示出抑制作用；將順鉑和LY294002聯(lián)合作用HEP-2細(xì)胞后，1 μg/ml 劑量的順鉑就可顯現(xiàn)出對(duì)HEP-2 較強(qiáng)的生長抑制作用。因此決定2 μg/ml LY294002 和1 μg/ml順鉑對(duì)喉癌細(xì)胞聯(lián)合作用48 h 為最佳作用時(shí)間和最適作用濃度。見圖4。

2.4 LY294002 聯(lián)合順鉑對(duì)HEP-2 細(xì)胞生長的抑制與細(xì)胞自噬效應(yīng)的關(guān)系 LC3B 熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，在24 h 時(shí)，未處理的空白組HEP-2 細(xì)胞質(zhì)中僅有散在的LC3B 抗體標(biāo)記熒光點(diǎn)； 單獨(dú)LY294002 處理的HEP-2 細(xì)胞也未見大熒光團(tuán)塊出現(xiàn)；單獨(dú)順鉑處理的細(xì)胞熒光顯微鏡下出現(xiàn)大小不一的熒光團(tuán)塊，LY294002 聯(lián)合順鉑處理則使HEP-2 細(xì)胞質(zhì)中熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，呈現(xiàn)大量片狀熒光染色區(qū)，圍繞細(xì)胞核遍布整個(gè)細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。孵育48 h 后，空白對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)正常，生長狀況良好，LC3B 熒光信號(hào)散在分布，無聚集且微弱；單獨(dú)LY294002 處理對(duì)HEP-2 細(xì)胞形態(tài)及LC3B 熒光點(diǎn)分布無明顯變化；經(jīng)順鉑處理后，細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，鏡下可見LC3B 熒光信號(hào)明顯，出現(xiàn)多個(gè)明亮綠色熒光；但當(dāng)LY294002 聯(lián)合順鉑共同作用后，大部分細(xì)胞中能觀察到LC3B綠色熒光信號(hào)分布，且48 h 孵育后熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯強(qiáng)于24 h孵育后的信號(hào)強(qiáng)度。見圖5。

圖5 LY294002聯(lián)合順鉑熒光顯色結(jié)果

2.5 LY294002 聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)HEP-2 細(xì)胞自噬發(fā)生與某些ATGs 因子的表達(dá)有關(guān) RT-qPCR 結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，LY294002 和順鉑的聯(lián)合作用可顯著改變ATG3、ATG4A、ATG4B、ATG4C、ATG5 和ATG7 mRNA 的表達(dá)量（P＜0.05）。見圖6。

圖6 LY294002聯(lián)合順鉑RT-qPCR結(jié)果

3 討論

PI3K/AKT 是參與細(xì)胞生長、增殖、分化調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［12-13］。研究發(fā)現(xiàn)，該通路相關(guān)蛋白異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［14-15］。LY294002作為一種能夠特異性阻斷PI3K細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的蛋白激酶抑制劑，可通過啟動(dòng)細(xì)胞自噬效應(yīng)而起到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用［16-17］。

為了確定LY294002 對(duì)喉癌HEP-2 細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)，本研究先利用MTT 及細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)LY294002 對(duì)喉癌HEP-2 細(xì)胞無明顯毒性作用，而將0～5 μg/ml 順鉑和2 μg/ml LY294002 聯(lián)合作用HEP-2 細(xì)胞后可顯著增強(qiáng)順鉑的殺傷HEP-2細(xì)胞效能。

另外，當(dāng)利用熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞內(nèi)自噬特異性標(biāo)志蛋白LC3B 表達(dá)進(jìn)行觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，LY294002 聯(lián)合順鉑對(duì)HEP-2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變較單獨(dú)順鉑作用效果明顯，熒光顯微鏡下呈現(xiàn)大量片狀熒光團(tuán)塊，說明聯(lián)合作用可極大刺激LC3B的表達(dá)，這也進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞自噬在其中發(fā)揮重要的作用。

細(xì)胞自噬一方面起到保護(hù)細(xì)胞生存的作用，在化療藥物或放療治療過程中，癌細(xì)胞通過細(xì)胞自噬作用降低治療的敏感度同樣也可起到促使癌細(xì)胞得以幸存的效果。另一方面，細(xì)胞自噬也可參與細(xì)胞程序性死亡［18-19］。如果細(xì)胞啟動(dòng)的自噬作用強(qiáng)烈或持續(xù)時(shí)間過長，它可使癌細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的細(xì)胞程序性死亡。細(xì)胞自噬的產(chǎn)生與功能性自噬溶酶體的形成密切相關(guān)［20］。自噬的2 種途徑都需要ATG8家族蛋白與自噬體膜上磷脂酰乙醇胺的共價(jià)綴合，其他自噬相關(guān)蛋白如（ATG4、ATG12、ATG5、ATG16） 也參與這些途徑的調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)，順鉑聯(lián)合LY294002 對(duì)ATG3、ATG4A、ATG4B和ATG5 的表達(dá)刺激明顯。在自噬溶酶體形成后期ATG4A和ATG4B通過去脂化過程（Delipidation）將ATG8 從ATG8-PE 泛素化偶聯(lián)復(fù)合體中剔除，這樣去脂化的自噬體才能與細(xì)胞質(zhì)中溶酶體融合形成自噬溶酶體［21-22］。ATG3 可激活LC3 的表達(dá)［23］，而ATG5 也參與自噬小泡的形成［24］。這些都證實(shí)LY294002聯(lián)合順鉑對(duì)HEP-2細(xì)胞的藥理作用和細(xì)胞自噬效應(yīng)密切相關(guān)。

綜上所述，利用人喉癌HEP-2 細(xì)胞，探討了PI3K/AKT 通路抑制劑LY294002 聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物順鉑，通過啟動(dòng)細(xì)胞自噬反應(yīng)抑制喉癌細(xì)胞的生長。本實(shí)驗(yàn)的研究闡明了順鉑通過與LY294002的聯(lián)合介導(dǎo)了細(xì)胞自噬反應(yīng)的發(fā)生，對(duì)于臨床抗喉癌藥物的選擇提供了一定的理論基礎(chǔ)。