劉春影, 周 婷, 李佳蔭,3, 梅 竹, 楊晢銘,3, 張 艷, 劉 丹, 宋海旭

1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科,遼寧 沈陽(yáng) 110016;2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué),遼寧 沈陽(yáng) 110122;3.東北大學(xué),遼寧 沈陽(yáng) 110167

骨骼肌為人體最具活力與可塑性的組織之一,約占人體總體質(zhì)量的40%[1]。作為氨基酸與碳水化合物等重要底物的存儲(chǔ)場(chǎng)所,骨骼肌能夠產(chǎn)生熱量以維持核心溫度[2-3]。線粒體為調(diào)節(jié)骨骼肌能量代謝的重要細(xì)胞器,通過(guò)調(diào)整其體積、結(jié)構(gòu)與功能來(lái)應(yīng)對(duì)慢性運(yùn)動(dòng)、衰老及疾病等。線粒體為高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器,經(jīng)歷裂變和融合的協(xié)調(diào)循環(huán),稱為“線粒體動(dòng)力學(xué)”,以保持其形狀、分布和大小[4-6]。熱休克蛋白60(heat shock protein 60,Hsp60)為一種線粒體的分子伴侶蛋白,可維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)[7-8]。有研究證實(shí),Hsp60參與多種細(xì)胞與組織的線粒體自噬過(guò)程,并與骨骼肌線粒體的發(fā)生與肌纖維的生成存在相關(guān)性[9-10]。本研究旨在探討Hsp60對(duì)骨骼肌線粒體動(dòng)力學(xué)穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5只8周齡雄性健康C57/BL小鼠,體質(zhì)量20～25 g,購(gòu)自集萃藥康生物有限公司。經(jīng)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn),標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件,室內(nèi)溫度 22℃,保持 12 h晝夜節(jié)律。

1.2 研究方法

1.2.1 C2C12細(xì)胞培養(yǎng)與siRNA轉(zhuǎn)染 小鼠成肌細(xì)胞系C2C12購(gòu)自ATCC公司,培養(yǎng)條件為37℃,5%二氧化碳,并應(yīng)用10%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí),可進(jìn)行干擾RNA(siHsp60)與對(duì)照試劑轉(zhuǎn)染,分別設(shè)為siHsp60組與對(duì)照組。

1.2.2 免疫熒光染色與MitoTracter染色 小鼠麻醉后,取腓腸肌樣本,以4%多聚甲醛固定24 h后脫水、石蠟包埋、脫蠟、伊紅染色與乙醇脫水。孵育一抗Hsp60與TOMM20,以4℃過(guò)夜。第2天復(fù)溫30 min,加入熒光二抗,室溫避光 1 h。4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染細(xì)胞核,拍照后分析數(shù)據(jù)。C2C12細(xì)胞應(yīng)用線粒體紅色熒光探針染色 15～30 min,染核,拍照分析。

1.2.3 Western blot法 在siHsp60 組與對(duì)照組細(xì)胞中加入RIPA buffer蛋白裂解液,冰上裂解30 min,4℃溫度下,以12 000 r/min離心10 min。等量樣本通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(120 V,1 h)分離,蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h,孵育一抗。TBST緩沖液清洗3次后,加入二抗孵育2 h,TBST清洗4次,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑曝光,分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 透射電鏡 采用2%戊二醛將siHsp60 組與對(duì)照組細(xì)胞在4℃條件下固定24 h。對(duì)樣品進(jìn)行不同處理步驟,如固定、梯度乙醇脫水、置換,然后用透射電鏡成像,采用iTEM軟件對(duì)線粒體的數(shù)量與大小進(jìn)行形態(tài)測(cè)量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hsp60在小鼠骨骼肌與C2C12細(xì)胞系線粒體中表達(dá) 在小鼠腓腸肌中Hsp60與線粒體膜蛋白標(biāo)記分子TOMM20有共定位表達(dá)(圖1a),在骨骼肌成肌細(xì)胞系C2C12中同樣發(fā)現(xiàn)Hsp60與TOMM20有共定位表達(dá)(圖1b)。

圖1 Hsp60在骨骼肌線粒體中表達(dá)情況(a.免疫熒光染色檢測(cè)Hsp60與TOMM20在骨骼肌腓腸肌中表達(dá)情況;b.免疫熒光染色檢測(cè)Hsp60與TOMM20在C2C12細(xì)胞中表達(dá)情況)

2.2 Hsp60敲減后線粒體形態(tài)的變化 與對(duì)照組比較,siHsp60 組細(xì)胞中異常線粒體的數(shù)量顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。siHsp60組細(xì)胞中線粒體呈點(diǎn)狀和碎裂的狀態(tài),而對(duì)照組細(xì)胞中線粒體形態(tài)規(guī)則,呈長(zhǎng)棒狀。見(jiàn)圖3。

圖2 透射電鏡檢測(cè)細(xì)胞中異常線粒體的表達(dá)(a.透射電鏡檢測(cè)C2C12細(xì)胞中線粒體的表達(dá)情況;b.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析)

圖3 MitoTracker紅色探針染色檢測(cè)細(xì)胞中線粒體表達(dá)

2.3 Hsp60敲減后線粒體動(dòng)力蛋白的表達(dá)變化 Western blot法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,siHsp60組細(xì)胞中線粒體融合蛋白(optic atrophy 1,OPA1)表達(dá)量顯著降低,而線粒體分裂與融合蛋白即動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1)表達(dá)量顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 線粒體蛋白OPA1與DRP1表達(dá)情況(a.Western blot法檢測(cè)線粒體中OPA1與DRP1蛋白的表達(dá)情況;b.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析)

3 討論

線粒體在細(xì)胞中起到重要作用,包括調(diào)控能量供應(yīng)、Ca2+穩(wěn)態(tài)與細(xì)胞凋亡等。骨骼肌細(xì)胞通過(guò)線粒體動(dòng)力學(xué)(融合與裂變)等途徑維持線粒體的形態(tài)與生理學(xué)功能[11-12]。年齡引發(fā)的骨骼肌萎縮為世界范圍內(nèi)的一個(gè)主要健康問(wèn)題[13]。線粒體動(dòng)力學(xué)損傷為導(dǎo)致骨骼肌萎縮的主要機(jī)制之一。

本研究結(jié)果顯示,Hsp60在骨骼肌纖維與C2C12細(xì)胞系的線粒體中大量表達(dá)。這提示,Hsp60可能在線粒體的生物活性中發(fā)揮重要作用。Hsp60作為一種線粒體蛋白,在調(diào)節(jié)線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)中起到關(guān)鍵作用[14]。有研究報(bào)道,Hsp60不僅定位線粒體,在細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜和胞外,以及血液循環(huán)中均有表達(dá),不僅調(diào)控線粒體伴侶活性,還在細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和免疫應(yīng)答等多種細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮作用[15-16]。在C2C12細(xì)胞中給予Hsp60敲減后,透射電鏡發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)中異常的線粒體數(shù)量增加,MitoTracker紅色探針染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)線粒體的形態(tài)發(fā)生改變,分裂的線粒體數(shù)量增多。線粒體為一個(gè)動(dòng)態(tài)細(xì)胞器,不斷發(fā)生裂變和融合,以使其形態(tài)適應(yīng)細(xì)胞環(huán)境。本研究Western blot法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,siHsp60組細(xì)胞中OPA1表達(dá)量顯著降低,而DRP1表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。這提示,Hsp60減少可引起線粒體動(dòng)力蛋白的表達(dá)異常。有研究證實(shí),Mfn1與 Mfn2雙基因骨骼肌特異性敲除的小鼠骨骼肌中線粒體破壞,骨骼肌運(yùn)動(dòng)功能嚴(yán)重?fù)p傷[17-20]。OPA1的特異性敲除同樣會(huì)導(dǎo)致骨骼肌線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥等。骨骼肌特異性DRP1基因敲除會(huì)引起骨骼肌萎縮,再生障礙。

綜上所述,Hsp60作為線粒體伴侶蛋白,可能參與維持線粒體的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)態(tài),在骨骼肌萎縮等病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。