張 茜, 張 丹, 周 楠, 賴曉蕊, 徐境一, 李嘉寶, 王 鑫, 楊 蕾

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 營養(yǎng)科,遼寧 沈陽 110016

糖尿病為常見的慢性病之一,慢性高血糖可以導致各種器官、尤其是心血管系統(tǒng)的損害,可能并發(fā)如冠心病、心肌病、心律失常等心血管疾病,主要原因是血管內(nèi)高血糖水平使血管內(nèi)皮結構產(chǎn)生改變,生理功能喪失導致血管損傷[1]。在高糖的環(huán)境下,內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶活性下降,一氧化氮(nitric oxide,NO)的生物利用度降低,導致血管舒張功能受損[2-3]。自然界中廣泛存在的多種天然活性植物化學物,對于防治高血壓、高血糖、高血脂等慢性代謝性疾病具有重要意義?；ㄇ嗨貫槭称分参镏蟹植驾^廣泛的黃酮類化合物之一,具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性等生物活性[4-5]。有研究報道,膳食中的花青素刺激胰島素分泌,減少細胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生,且對肥胖誘導的炎癥和氧化應激具有積極作用,與2型糖尿病的風險降低有關[6-7]。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside,C3G)為自然界中常見、廣譜存在的一類花青素,廣泛分布于黑色或紫紅色的蔬菜水果中[8-9]。有研究報道,C3G可保護大鼠心臟免受缺血/再灌注誘導的細胞凋亡和壞死,減輕多柔比星誘導的小鼠心臟毒性[10]。本研究構建了高糖誘導內(nèi)皮細胞損傷的體外細胞模型,旨在探討C3G對高血糖損傷血管內(nèi)皮細胞的保護作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 主要試劑:C3G購自Polyphenols公司,青霉素-鏈霉素購自Solarbio 公司,胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自康寧公司,胰蛋白酶購自美國Gibco公司,細胞增殖/毒性檢測試劑盒(cell counting kit,CCK-8)購自碧云天生物技術公司,凋亡染色試劑盒購自Roche公司,乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。主要設備:CO2培養(yǎng)箱(Sanyo公司,日本),多功能酶標儀(BioTek公司,美國),分析天平(上海天美天平儀器),超凈工作臺(蘇州博立斯凈化設備公司),倒置顯微鏡(Olympus公司,日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1 內(nèi)皮細胞培養(yǎng)、傳代和分組 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)購于上海中國科學院細胞庫。將HUVECs解凍復蘇后加入含10%胎牛血清的改良Eagle培養(yǎng)基,置于5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),當細胞生長至密度80%左右時進行傳代。將細胞分為普通對照組(5.5 mmol/L葡萄糖)、高滲對照組(5.5 mmol/L葡萄糖+27.5 mmol/L甘露醇)、高糖組(33.3 mmol/L葡萄糖)、高糖+低濃度C3G組(10.0 μmol/L)、高糖+中濃度C3G組(20.0 μmol/L)、高糖+高濃度C3G組(40.0 μmol/L)。

1.2.2 細胞活性檢測 取對數(shù)生長期細胞進行實驗,調(diào)整細胞密度至1×104個/ml后接種于96孔板,隨機分為普通對照組、高滲對照組、高糖組、高糖+低濃度C3G組、高糖+中濃度C3G組、高糖+高濃度C3G組,每組設8個復孔,按照不同分組分別添加培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)24、48 h后,采用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)清洗細胞3次,每孔中加入10 μl的CCK-8溶液,37℃孵箱中孵育1 h,酶標儀讀取每孔細胞上清液在450 nm波長時的吸光度值。

1.2.3 細胞凋亡檢測 細胞接種于24孔板,分別添加不同培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h后,棄去培養(yǎng)基,4%多聚甲醛固定30 min,0.3% Triton X-100通透5 min, 染色液避光孵育1 h,二氨基苯基吲哚(diamidino phenyl indole,DAPI)復染細胞核,封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍攝。

1.2.4 細胞乳酸脫氫酶與一氧化氮釋放量檢測 將HUVECs細胞按普通對照組、高滲對照組、高糖組、高糖+C3G中濃度組、高糖+C3G高濃度組分別種于6孔板中,每組4個復孔,添加不同培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后收集各組細胞上清液,按照試劑盒說明書,采用比色法測定各組上清液中細胞乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)與NO含量。

1.2.5 細胞中MDA、SOD與谷胱甘肽檢測 HUVECs細胞按照分組種于6孔板中,培養(yǎng)48 h后收集各組細胞。裂解液提取各組細胞中總蛋白,按照說明書測定HUVEC細胞中MDA、SOD與谷胱甘肽(glutathione,GSH)活性變化。

1.2.6 細胞中ROS含量檢測 細胞分組后種于96孔板中,培養(yǎng)48 h后換用無血清培養(yǎng)基,并在每孔中各加入1 μl DCFH-DA熒光探針,37℃孵育30 min。PBS洗滌3遍后,采用熒光酶標儀檢測各孔熒光強度,設置條件為激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm,ROS釋放量以平均熒光強度表示。

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附法檢測HUVECs細胞炎性因子分泌 細胞接種于24孔板中后,培養(yǎng)48 h,收集細胞上清液,根據(jù)試劑盒說明書進行腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、內(nèi)皮縮血管肽(endothelin,ET)-1、可溶性細胞間粘附分子-1(soluble intercellular cell adhesion molecule-1,sICAM-1)與可溶性血管間粘附因子-1(soluble vascular cell adhesion molecule-1,sVCAM-1)含量測定。實驗結果以培養(yǎng)液中所含上述炎性因子的質(zhì)量濃度表示。

2 結果

2.1 各組細胞活力比較 普通對照組與高滲對照組24、48 h的HUVECs細胞活力比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。普通對照組24、48 h的HUVECs細胞活力均高于高糖組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。培養(yǎng)24 h時,高糖+中濃度C3G組、高糖+高濃度C3G組細胞活力均高于高糖組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。培養(yǎng)48 h時,高糖+低濃度C3G組細胞活力高于高糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 CCK-8法檢測C3G對高糖作用下HUVECs活力的影響

2.2 各組細胞凋亡率比較 普通對照組與高滲對照組細胞凋亡率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。高糖組細胞凋亡率高于普通對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高糖+中濃度C3G組、高糖+高濃度C3G組細胞凋亡率均低于高糖組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 原位末端標記染色檢測C3G對高糖作用下HUVECs凋亡的影響

2.3 C3G對高糖作用下HUVECs中LDH、MDA、SOD、GSH影響 高糖組HUVECs細胞中LDH、MDA高于普通對照組,SOD、GSH低于普通對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高糖+中濃度C3G組、高糖+高濃度C3G組細胞中LDH、MDA均低于高糖組,SOD、GSH均高于高糖組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 C3G對高糖作用下HUVECs中LDH、MDA、SOD、GSH影響

2.4 C3G對高糖作用下HUVECs中ROS影響 普通對照組、高滲對照組、高糖組、高糖+中濃度C3G組、高糖+高濃度C3G組細胞內(nèi)ROS含量分別為(102.52±3.16)、(109.43±5.78)、(368.61±21.99)、(252.97±17.50)、(248.35±18.62)U/ml。高糖組細胞中ROS含量高于普通對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高糖+中濃度C3G組、高糖+高濃度C3G組細胞內(nèi)ROS含量均低于高糖組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.5 C3G對高糖作用下HUVECs內(nèi)炎性因子影響 高糖組中NO低于普通對照組,ET-1、TNF-α、IL-1β、sICAM-1、VCAM-1高于普通對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高糖+中濃度C3G組、高糖+高濃度C3G組NO均高于高糖組,ET-1、TNF-α、IL-1β、sICAM-1、sVCAM-1的分泌量均低于高糖組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 C3G對高糖作用下HUVECs中炎性因子生成的影響

3 討論

糖尿病已經(jīng)成為21世紀全球增長最快的疾病之一,心血管并發(fā)癥為糖尿病患者發(fā)病及死亡的主要原因[11-13]。藥食同源理論根植于傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論,不僅安全性高,還適于長期食用[14]?；ㄇ嗨貫橐淮箢慄S酮化合物,廣泛存在于自然界多種蔬菜水果中。有研究報道,花青素提取物具有預防或治療炎癥疾病的潛力,可以有效改善糖尿病癥狀、明顯降低血糖、改善肝功能、保護神經(jīng)元、提高記憶力[15-18]。糖尿病心血管病變、視網(wǎng)膜病變等多種并發(fā)癥均始于內(nèi)皮細胞功能紊亂,以內(nèi)皮細胞凋亡加速、內(nèi)皮細胞因子分泌失衡為主要表現(xiàn)[19]。內(nèi)皮細胞作為血管的機械屏障,通過調(diào)節(jié)血管張力、血流速度、氧化應激、炎癥等,在維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用。有研究報道,C3G能夠影響葡萄糖代謝和胰島素分泌,在高糖誘導血管內(nèi)皮細胞功能損傷中發(fā)揮重要作用[20]。

本研究結果顯示,與普通對照組比較,高糖組細胞活力下降,細胞凋亡水平增加,細胞內(nèi)LDH、MDA含量上升,SOD、GSH含量降低,而且,高糖組細胞中ROS含量顯著高于普通對照組,NO釋放量下降,ET-1、TNF-α等炎癥因子分泌量明顯增加。這說明,高糖通過抑制細胞活力,增加細胞凋亡水平,激活細胞內(nèi)氧化應激和炎癥反應,對HUVECs造成明顯損傷。本研究結果還顯示,與高糖組比較,高糖+中濃度C3G組與高糖+高濃度C3G組細胞活力增加,NO、SOD、GSH水平明顯升高,ET-1、TNF-α、IL-1β、sICAM-1和VCAM-1分泌顯著降低,且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應。這說明,C3G對高糖損傷的內(nèi)皮細胞具有保護作用,其作用機制可能是C3G通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮依賴的血管舒張功能、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞炎癥和氧化應激水平,進而抑制糖尿病患者微血管和大血管并發(fā)癥的發(fā)生。

綜上所述,C3G能夠明顯恢復高糖損傷導致的內(nèi)皮細胞活力下降,并抑制其凋亡、炎癥和氧化應激水平,C3G對高糖誘導的內(nèi)皮細胞損傷具有良好的保護作用,可能是一種新的治療炎性血管疾病的策略,為高血糖損傷的防治提供了新思路。