楊倩 張琳 曹曉云 唐素芳

摘要：目的 建立反相高效液相色譜法測定頭孢地尼及制劑中的聚合物雜質。方法 以CAPCELL PAK C18 MGⅡ為色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），0.25%四甲基氫氧化銨溶液（pH 5.5）[每1000mL中加入0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液0.4 mL]-甲醇-乙腈為流動相系統(tǒng)，梯度洗脫，建立了頭孢地尼聚合物類雜質的分析方法并進行了方法學驗證。采用二維液質聯用法對檢出的聚合物類雜質進行定性分析。結果 在該色譜條件下頭孢地尼及已知雜質均與頭孢地尼聚合物間分離良好，頭孢地尼檢測濃度的線性范圍為0.30～30.1 μg/mL（r=1.0000），方法的檢測限與定量限分別為1.5 ng和4.5 ng。所建立的方法能夠檢出頭孢地尼二聚體，頭孢地尼二聚體的多個同分異構體及頭孢地尼三聚體。結論 本方法專屬性好，靈敏度高，耐用性好，可用于頭孢地尼及其制劑中聚合物雜質的控制。

關鍵詞：頭孢地尼；聚合物；雜質；反相高效液相色譜法；二維液質聯用

中圖分類號：R978.1 ? ? ? ?文獻標志碼：A

Determination of polymer impurities in cefdinir and preparations by RP-HPLC

Yang Qian， Zhang Lin， Cao Xiao-yun， and Tang Su-fang

（Tianjin Institute for Drug Control， Tianjin 300070）

Abstract Objective To establish a reverse high-performance liquid chromatography （HPLC） for the separation and determination of polymers in cefdinir and its preparations. Methods The method was performed by using CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ column （250 mm×4.6 mm，5 μm）. The mobile phase was 0.25% tetramethyl ammonium hydroxide （pH5.5） containing 0.1 mol/L disodium EDTA solution （0.4 mL per 1000 mL）-acetonitrile-methanol. The gradient elution was used. The method was validated， and the polymer impurities were analyzed by the two dimensional liquid chromatography-mass spectrometry method. Results Cefdinir， the identified impurities and polymers were separated effectively. The linear range of cefdinir was 0.30～30.1 μg/mL （r=1.0000）. The limit of detection was 1.5 ng and the limit of quantitation was 4.5 ng. Cefdinir dimer， isomers of cefdinir dimer， and cefdinir trimer can be detected by the new method. Conclusion The established RP-HPLC method with good robustness is specific and sensitive. Therefore， it can be used for the control of polymer impurities in the pharmaceutical preparations.

Key words Cefdinir; Polymers; Impurities; RP-HPLC; 2D-LC-MS

頭孢地尼為半合成第三代β-內酰胺類抗生素，由日本藤澤藥品工業(yè)公司研發(fā)，1991年首次在日本上市，2001年國產仿制藥獲準上市。頭孢地尼通過抑制細菌細胞壁的合成產生抗菌作用，對革蘭陽性菌和陰性菌均有抗菌活性，在臨床上廣泛應用于內外科、皮膚科和婦產科等敏感菌導致的感染。不良反應輕微，以消化道反應和過敏反應最為常見。而過敏反應正是β-內酰胺類抗生素最受關注的一類不良反應，引發(fā)過敏反應的過敏原是β-內酰胺類抗生素中的聚合物雜質[1-3]。該類雜質在藥品的生產、貯藏、運輸過程中均有可能產生，因此《中國藥典》從2000年版開始對其進行控制。

頭孢地尼分子結構7位側鏈存在氨基活性基團，理論上可以發(fā)生L型和N型聚合反應生成聚合物類雜質?！吨袊幍洹?020年版、USP2021、《日本藥局方》XVⅡ均收載了頭孢地尼，但標準中均未設定聚合物類雜質檢查項。有文獻報道采用葡聚糖凝膠G10法和高效凝膠色譜法測定頭孢地尼中的高分子雜質[4-5]，這也是目前對β-內酰胺類抗生素中聚合物類雜質進行控制的主要方法。但上述方法對聚合物的分離分析能力有限，專屬性差，一般無法滿足準確控制該類雜質的要求。研究表明，通過色譜條件的優(yōu)化，很多β-內酰胺類抗生素中的聚合物類雜質可以在反相高效液相色譜系統(tǒng)中被測定[6-8]。本研究參考文獻[9]建立了頭孢地尼原料和制劑中聚合物雜質的分析方法并利用二維液質聯用技術對檢出的聚合物類雜質進行了定性研究。

1 儀器與試藥

LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司），1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司），Waters ACQUITY UPLCTM2D色譜儀及Xevo G2-S QTof質譜系統(tǒng)（美國Waters公司），Mettler Toledo XS 205型電子分析天平（瑞士Mettler公司）。

頭孢地尼（3家生產企業(yè)，7批樣品），頭孢地尼膠囊（6家生產企業(yè)，17批樣品），頭孢地尼分散片（7家生產企業(yè)，21批樣品），頭孢地尼片（1家生產企業(yè)，3批樣品），頭孢地尼對照品（批號130502-201904，純度98.1%）購自中國食品藥品檢定研究院，頭孢地尼已知雜質對照品A～U由廠家提供；甲酸（LCMS級）購自美國Sigma公司；乙腈、甲醇（色譜純）購自美國Merck公司；其他試劑（分析純）均購自國藥集團化學試劑公司；水為屈臣氏純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 ? ?反相液相色譜條件（一維色譜）

色譜柱：CAPCELL PAK C18 MGⅡ（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相A：0.25%四甲基氫氧化銨溶液（用磷酸調節(jié)pH值至5.5），每1000 mL中加入0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液0.4 mL；流動相B：0.25%四甲基氫氧化銨溶液（用磷酸調節(jié)pH值至5.5）-乙腈-甲醇（500：300：200），每1000 mL中加入0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液0.4 mL，線性梯度洗脫。洗脫梯度：0～10 min（20%～50% B）→10～1 5 min（50%～75% B）→15～20 min（75% B）→20～21 min（75%～20% B）→21～30 min（20% B）。流速：1.1 mL/min；柱溫：40℃；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μL。

2.1.2 ? ?二維液相色譜條件

色譜柱：Waters HSS T3 C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。流動相A ：0.1%甲酸溶液；流動相B：乙腈；在線除鹽后，線性梯度洗脫：0～5 min（2%～95% B）。柱溫：35℃；流速：0.4 ?mL/min。

2.1.3 ? ?質譜條件

離子源為ESI源，正離子模式，掃描范圍：m/z 50～1500；離子源溫度：110℃；毛細管電壓 3.0 kV；霧化器溫度：450℃；霧化器流速800 L/h。

2.2 溶液的配制

溶劑：0.l mol/L磷酸鹽緩沖液[0.l mol/L磷酸氫二鈉溶液-0.l mol/L磷酸二氫鉀溶液（2：1）]。

系統(tǒng)適用性溶液：取頭孢地尼原料（批號Ap006-2011-009）約500 mg，加入三氯甲烷8 mL，三乙胺2 mL，振搖5 min，密封，室溫避光放置48 h。旋轉蒸發(fā)去除三氯甲烷和三乙胺，制成固體粉末作為堿破壞樣品[9]。稱取上述堿破壞樣品約15 mg，置于10 mL量瓶中，加溶劑2 mL溶解，再用流動相A（一維）稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：取頭孢地尼約37.5 mg（制劑：取重量差異項下細粉或裝量差異項下內容物適量，約相當于頭孢地尼37.5 mg），精密稱定，置25 mL量瓶中，加溶劑4 mL溶解后，用流動相A（一維）稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。制劑過濾后，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

對照品溶液：取頭孢地尼對照品約37.5 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加溶劑4 mL溶解后，用流動相A（一維）稀釋至刻度，搖勻。精密量取該溶液1 mL置100 mL量瓶中，用流動相A（一維）稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗試驗

考察了系統(tǒng)適用性試驗溶液、頭孢地尼已知雜質對照品混合溶液及頭孢地尼原料（批號Ap006-2011-009）在酸、堿、氧化、高溫和光照條件下產生雜質的分離情況。結果表明，在新建立的色譜系統(tǒng)中，已知雜質、破壞所產生的降解雜質均能與頭孢地尼實現良好分離。除系統(tǒng)適用性試驗溶液中的相對保留時間為2.1特定雜質外，已知雜質和主要降解雜質的相對保留時間均小于2.0，該方法專屬性良好，見圖1～3。

2.3.2 線性范圍

取頭孢地尼對照品按逐步稀釋法制成不同濃度的對照品溶液進行試驗，結果表明頭孢地尼在0.30～30.1 μg/mL范圍內，濃度與峰面積呈線性相關y=37014x-612.84（r=1.0000）。對照品溶液濃度在供試品溶液濃度的0.02%到2%范圍內線性良好。

2.3.3 檢測限和定量限

以頭孢地尼對照品溶液（約15 μg/mL）標化堿破壞樣品中頭孢地尼二聚體的含量，頭孢地尼二聚體的檢測限（按S/N=3計）為1.5 ng，相當于0.005%；定量限（按S/N=10計）為4.5 ng，相當于0.015%。

2.3.4 溶液穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液（頭孢地尼分散片，批號10201103）分別于4℃放置0、1、2、4、8和12 h后進樣分析，該供試品溶液中檢出雜質個數相同，聚合物類雜質均小于定量限，聚合物類雜質低溫放置12 h未見明顯增多。

2.3.5 耐用性試驗

試驗考察了不同儀器、不同色譜柱在不同流速下對聚合物類雜質的檢出能力，結果表明色譜條件的變化對測定結果影響不大，見表1。

2.4 聚合物類雜質定性分析

取系統(tǒng)適用性溶液注入二維液質聯用儀，記錄色譜圖，對圖3中檢出的雜質1～9進行定性研究，結果見表2，聚合物特征質譜圖見圖4～5。研究表明，堿破壞樣品中含有多個頭孢地尼二聚體和頭孢地尼三聚體，互為同分異構體，存在優(yōu)勢聚合，以雜質2（相對保留時間為2.12）的二聚體雜質為主。專屬性試驗顯示出峰時間最晚的雜質U的相對保留時間為2.0（圖2），而頭孢地尼聚合物類雜質的相對保留時間均大于2.0，考慮到該保留時間范圍內檢出的雜質除聚合物雜質外還存在少量的小分子雜質，故將相對保留時間大于2.0的雜質作為有關物質Ⅱ，對其總量進行控制。

2.5 樣品測定結果

取頭孢地尼原料、頭孢地尼膠囊、頭孢地尼分散片及頭孢地尼片，照“2.1”項下色譜條件測定，特征色譜圖見圖6，結果見表3。

3 討論

3.1 系統(tǒng)適用性溶液的選擇

頭孢地尼分子結構7位側鏈存在氨基活性基團，在堿性條件下，氨基活性基團更易進攻β-內酰胺環(huán)發(fā)生L型反應；酸性條件下，更易發(fā)生N型聚合反應。試驗對酸加熱破壞破壞樣品和堿破壞樣品進行了測定，結果表明堿破壞樣品中存在多個頭孢地尼的二聚體雜質和少量的三聚體雜質，其中以相對保留時間約為“2.1”的頭孢地尼二聚體最多。酸加熱破壞樣品中產生的相對保留時間大于“2.1”的雜質中經質譜鑒定均不是聚合物類雜質。

3.2 梯度洗脫條件的選擇

《中國藥典》2020年版收載的頭孢地尼有關物質檢查項色譜條件由于有機相比例較低且變化緩慢（42 min有機相比例變化為2.5%～25%），無法在一個梯度程序內將極性較小雜質洗脫出色譜柱。試驗嘗試了3種梯度程序，15 min內有機相的比例變化分別為10%～37.5%、10%～45%、10%～50%。結果表明3個條件均可將系統(tǒng)適用性溶液中破壞生成的極性較小雜質有效洗脫，對樣品中極性較小雜質的檢出結果相同。故最終選擇有機相比例變化范圍在10%～37.5%的梯度洗脫程序。

3.3 檢測波長的選擇

頭孢地尼和堿破壞生成的頭孢地尼二聚體的紫外特征圖譜在建立的色譜系統(tǒng)中相似，均在225 nm和280 nm附近存在最大吸收，而《中國藥典》2020年版收載的頭孢地尼有關物質檢查方法檢測波長為254 nm。試驗采用頭孢地尼堿破壞樣品（約含頭孢地尼二聚體15 μg/mL）考察了頭孢地尼二聚體在這3個波長處的信噪比。結果顯示雖然該雜質在225 nm波長處的響應值最高，但基線波動也隨之加大，綜合比較最終選擇254 nm為測定波長。

3.4 聚合物雜質及未知雜質結構分析

由表2可知相對保留時間大于2.0的雜質包括多個互為同分異構體的頭孢地尼二聚體和頭孢地尼三聚體，這些同分異構體的結合位點和取代位點各異，質譜碎片信息相似，僅憑質譜信息很難確證其結構，但可以確定其為聚合物類雜質。另試驗還對[M+H]+為442的雜質推斷了可能的結構。雜質的可能結構見圖7。

4 結論

本實驗所建立的方法能夠在較短分析時間內完成對頭孢地尼及制劑中存在的微量聚合物雜質的測定。對不同來源的原料和3種口服制劑共48批樣品檢測，結果表明，僅1個廠家生產的頭孢地尼分散片（批號：20033002）有關物質Ⅱ總量超過0.1%，這說明頭孢地尼原料和制劑在生產和貯藏過程中不易聚合生成聚合物類雜質。

參 考 文 獻

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收稿日期：2022-02-17

作者簡介：楊倩，女，生于1982年，碩士，副主任藥師，主要從事抗生素類藥品質量研究，E-mail： yangqian0111@163.com

通訊作者，E-mail： tsf 90@163.com