羅歡 王煒捷 李瑋瑋 郭銀莉 劉偉佳 盧嶸 薛云新 王岱 趙西林

摘要：細菌生物膜（biofilm）是一種被自身細胞外基質(zhì)包裹在內(nèi)的細菌群落。生物膜可增加細菌對傳統(tǒng)消毒劑的抗性，是導(dǎo)致院內(nèi)患者反復(fù)感染、威脅食品工業(yè)安全的主要原因之一，對公共衛(wèi)生健康造成了嚴(yán)重影響。盡管現(xiàn)有研究對細菌生物膜介導(dǎo)的消毒劑抗性進行了大量報道，但研究的系統(tǒng)性和深度仍有待加強。為此，本文將細菌生物膜通過限制消毒劑擴散、細菌適應(yīng)性調(diào)節(jié)、群體感應(yīng)等方式對消毒劑產(chǎn)生抗性的機制進行綜述，并總結(jié)概括了目前較有應(yīng)用前景的生物膜消除策略，以期為后續(xù)深入研究及策略設(shè)計提供思路。

關(guān)鍵詞：細菌生物膜；消毒劑；抗性

中圖分類號：R978.1文獻標(biāo)志碼：A

Research progress on the resistance of bacterial biofilms to disinfectants

Luo Huan， Wang Wei-jie， Li Wei-wei， Guo Yin-li， Liu Wei-jia， Lu Rong， Xue Yun-xin， Wang Dai， and Zhao Xi-lin

（State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics， School of Public Health， Xiamen University， Xiamen 361102）

Abstract Bacterial biofilm is a micro-community of bacteria surrounded by their own extracellular polymeric substrates （EPS）. Biofilm can increase the resistance/tolerance of bacteria to traditional disinfectants， and is one of the main reasons that cause recurring infections of hospital patients and threaten the safety of the food industry， thus causing serious impacts on public health. Although existing studies have reported a large number of bacterial biofilm-mediated resistance/tolerance to disinfectants， the scope and the depth of research still need to be strengthened. To this end， this article reviews the mechanisms by which bacterial biofilms resist/tolerate disinfectants by restricting the diffusion of disinfectants， adaptive adjustment of bacteria， quorum sensing， etc.， and summarizes some promising strategies currently under exploration for biofilm elimination， with the hope to provide guidance for follow-up， in-depth research and strategic designs.

Key words Bacterial biofilm; Disinfectant; Resistance

消毒是限制和減少細菌傳播、控制病原微生物感染的主要策略之一，在醫(yī)療、食品、工業(yè)生產(chǎn)、生活環(huán)境等方面都起到了重要作用。消毒劑產(chǎn)品一直是醫(yī)療衛(wèi)生、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和日常生活的必需品，目前由于新型冠狀病毒（COVID-19）在全球范圍內(nèi)肆虐，其需求量加大[1-2]，這必然會造成消毒劑大量使用甚至濫用，促使消毒劑抗性細菌的產(chǎn)生及傳播，反而對公共醫(yī)療衛(wèi)生產(chǎn)生一定威脅[3]。消毒劑使用過程中，細菌可通過一系列機制抵抗應(yīng)對消毒劑的作用，包括形成生物膜、改變膜表面滲透性、多藥外排泵的主動外排、酶失活、靶基因修飾或產(chǎn)物過度表達、獲得新的代謝途徑、質(zhì)粒介導(dǎo)等[4]。細菌因生物膜形成而導(dǎo)致的消毒劑抗性已造成多方面的經(jīng)濟損失和環(huán)境影響，食品工業(yè)和醫(yī)療環(huán)境中的生物膜控制對于公共衛(wèi)生是一項艱巨任務(wù)[5]，尤其是可產(chǎn)生生物膜的病原菌被認(rèn)為是慢性和急性感染發(fā)生的主要原因[6]。研究表明，細菌生物膜（簡稱生物膜）可通過多種機制抵御消毒劑的殺傷作用，本文將對目前生物膜產(chǎn)生消毒劑抗性的機制進行綜述，并概括較有應(yīng)用前景的抗生物膜策略，為尋找合理有效的生物膜預(yù)防和臨床治療方法提供思路。

1 生物膜的形成及其影響因素

細菌生物膜的形成是自然界普遍存在的一種現(xiàn)象，據(jù)估計超過90%的細菌存在于生物膜中[7]。生物膜泛指微生物附著于接觸表面，通過分泌多糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、多肽和胞外DNA等組成細胞外聚合物基質(zhì)（Extracellular polymeric substrates， EPS），并將自身包裹在其中的一種群落聚集體[5]。生物膜的形成周期涉及3個主要階段：①游離細菌的初始附著；②生物膜形成并進入成熟階段，開始產(chǎn)生EPS，促進多層細胞簇形成；③細菌從生物膜分散、進入游離狀態(tài)，在別處啟動新的一輪生物膜生成循環(huán)[8]。一方面，生物膜形成過程受pH、溫度、濕度、營養(yǎng)條件、氧化壓力和NaCl濃度等多種環(huán)境因素的調(diào)節(jié)；另一方面，生物膜固有的生活方式及結(jié)構(gòu)形態(tài)可為細菌提供多種生長優(yōu)勢，如幫助自身平衡溫度、pH和滲透壓，減弱紫外線照射，增加養(yǎng)分可用性，增強代謝和促進基因轉(zhuǎn)移等。因此，與游離狀態(tài)相比，細菌形成生物膜后能更好適應(yīng)環(huán)境[9]。

2 生物膜對消毒劑的抵抗機制

目前常用于清除生物膜的消毒劑包括應(yīng)用最廣的季銨鹽類，以及鹵素類、過氧化物類、醛類、酚類和醇類[10]。與具有特定靶標(biāo)的抗生素不同，消毒劑往往可針對多種細胞組分同時發(fā)生作用，根據(jù)消毒劑各自特性，包括破壞細胞壁和細胞膜、蛋白質(zhì)變性與酶失活、干擾代謝和電荷相互作用等（表1）[11-12]。一般認(rèn)為，生物膜內(nèi)細菌對消毒劑的抵御能力由多種因素造成，但抗性（resistance）和耐受（tolerance）機制會因消毒劑類別、細菌種類、生物膜厚度、生長階段及環(huán)境的不同而變化[13-14]。另一方面，細菌對消毒劑和抗生素的耐受往往具有共性，即當(dāng)對消毒劑產(chǎn)生耐受時也能對抗生素耐受，這將促進多重耐藥菌的產(chǎn)生，進一步增加了清除生物膜的難度[15-16]。

關(guān)于細菌對消毒劑抗性的概念目前有很多描述，通常是指出現(xiàn)了某些對常用濃度不再敏感，處理后仍能存活或繁殖的菌株，但尚未形成統(tǒng)一和明確的定義。就已有的研究報道，細菌生物膜對消毒劑的抗性不僅指細菌發(fā)生了遺傳性變化，而且對外界刺激也表現(xiàn)出一定的耐受性，因此，生物膜抗性是一種細菌在特定環(huán)境下繁殖時暫時或永久獲得的能力[5，17]。生物膜對消毒劑的抗性機制目前有如下解釋。

2.1 消毒劑在生物膜中的擴散限制

2.1.1 物理條件

初始表面附著是細菌從游離態(tài)過渡到生物膜的轉(zhuǎn)折點，分可逆和不可逆兩個階段；在可逆附著中，生物膜細胞通過靜電、范德華力和氫鍵力與固體表面的內(nèi)聚力和黏附力進行單極松散連接，并且很容易分離并返回到游離狀態(tài)[5，7]，此時陽離子消毒劑對帶負(fù)電荷的生物膜有較好的親和力，由于電荷相互作用，消毒劑僅聚集于生物膜外層，不能完全進入整個生物膜到達靶標(biāo)部位發(fā)揮有效作用[18]。生物膜的厚度也是限制消毒劑分子擴散的一種因素，這主要是因為生物膜形成的三維結(jié)構(gòu)促使細菌直徑厚度增大，導(dǎo)致消毒劑分子滲透生物膜的時間加長或無法進一步滲透而使得消毒劑功效受限[19]。由阻礙滲透引起的耐受性可能只是暫時的，但是它可能讓細菌有足夠的時間適應(yīng)更耐受的狀態(tài)。在不可逆黏附階段，細菌逐步進入成熟和脫離狀態(tài)，附著的細菌開始分泌細胞外基質(zhì)與黏附載體共價結(jié)合，逐漸形成牢固的附著。此外，細菌其他特殊結(jié)構(gòu)如肽聚糖、蛋白質(zhì)、菌毛和莢膜等也可能限制消毒劑的膜內(nèi)擴散，構(gòu)成了影響消毒劑進入生物膜的第一道關(guān)卡[20]。

2.1.2 細胞外基質(zhì)

成熟生物膜的形成和維持與過程中產(chǎn)生的EPS密切相關(guān)，EPS一般包含胞外多糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、磷壁酸和胞外DNA等成分，且會隨著菌株類型和環(huán)境條件而不同[21]。EPS具有多種生物學(xué)功能，可幫助生物膜抵抗多種外界不利環(huán)境以及消毒劑等抗菌劑，例如可減輕宿主細胞內(nèi)對細菌有毒物質(zhì)的作用（膽汁鹽、水解酶、溶菌酶、胃酶/胰酶、金屬離子、抗菌劑等）和環(huán)境壓力（溫度、pH、滲透壓變化等），也有助于細菌逃避免疫反應(yīng)和噬菌體攻擊等[22]。

EPS參與生物膜抵抗性的具體機制包括：①生物膜的多層細胞和EPS可構(gòu)成一個復(fù)雜而緊湊的結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中，EPS進一步阻礙消毒劑滲透到達內(nèi)層，從而削弱其功效[14，17]；②EPS中的糖被是一種陰離子聚合物，其作用類似于離子交換樹脂，厚度在0.2到1.0 μm不等[22]。糖被中的糖蛋白及多糖的多種結(jié)構(gòu)、特性和作用對于生物膜的形成有許多益處，包括幫助細菌黏附、提供養(yǎng)分、保護生物膜結(jié)構(gòu)進而抵抗各種消毒劑壓力[23]；③EPS中酶催化機制，如過氧化氫酶和超氧化物歧化酶，這些酶通常可針對某種或某類消毒劑起作用，尤其是氧化劑類、醛類和重金屬類的消毒劑[24-26]。這種酶促機制，在消毒劑發(fā)揮作用之前將其分解，從而降低抗菌劑的活性。因此，阻斷這種酶促過程可能會抑制生物膜的產(chǎn)生，使生物膜細胞重新對消毒劑敏感[27]。

EPS的基質(zhì)成分還可能通過對細菌表面進行修飾、阻礙細菌初始附著，或充當(dāng)信號分子調(diào)控參與生物膜形成的基因表達來干擾生物膜活性[28-29]，并且在混合物種產(chǎn)生的生物膜中，EPS成分不僅可以增強自身的消毒劑抗性，還可為它們的伴生共存菌株提供保護。因此，EPS成分的存在極大地助力了生物膜對消毒劑抗性的產(chǎn)生。

2.1.3 多物種混合生物膜

生物膜存在的外界環(huán)境往往很復(fù)雜，自然環(huán)境中不同種群細胞間的相互作用很可能會影響生物膜群落各成員的生長、存活，以及它們潛在的毒力，進而影響這些結(jié)構(gòu)的整體致病性[30]。多物種生物膜通常對消毒劑具有同等或更高的抵抗力，例如在慢性感染相關(guān)疾病中，囊性纖維化患者的肺、慢性傷口或泌尿道等天然組織中多種病原菌的定植，經(jīng)常會引起更嚴(yán)重和頑固的感染[31]；銅綠假單胞菌或白念珠菌的存在會誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌毒力因子的上調(diào)[32-33]。但并非所有物種間的組合都是有利的，如Maricarmen等[34]發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的存在會促使沙門菌生物膜的形成，但采用常用的過氧乙酸、次氯酸鈉等處理時，雙物種形成的生物膜反而對消毒劑更敏感。

整體而言，消毒劑對生物膜的效率會因消毒劑特性、生物膜形成表面的性質(zhì)、微生物類型以及其他因素（如溫度和暴露時間）而有很大差異。具體到多物種生物膜較單一物種生物膜對消毒劑的抗性優(yōu)勢[35-36]原因包括以下3點：一是因為多種菌群共存時物種的差異性可能會改變EPS基質(zhì)的組成和黏度，有利于EPS形成更加致密的結(jié)構(gòu)，使消毒劑擴散反應(yīng)進一步受限，更難透過復(fù)雜的EPS基質(zhì)進入生物膜的最深層[14，37]，比如產(chǎn)志賀毒素的大腸埃希菌和鼠傷寒沙門菌混合形成的生物膜增強了對季銨化合物或氯消毒劑的抵抗力[38-39]；二是與某一物種產(chǎn)生有益于整個種群的特定成分有關(guān)[40]，例如銅綠假單胞菌分泌的特定水解酶賦予混合群落對SDS（一種陰離子表面活性劑）的耐受性[41]；三是物種之間存在代謝交叉供給，可以促進生物膜細胞的生長并提高它們的存活率，推動生物膜的生態(tài)優(yōu)勢[42]。例如好氧硝化菌和厭氧反硝化菌的空間組織和分層幫助它們共同代謝和降解有毒化合物[43]。

此外，多物種病原菌間的相互作用會促進基因水平轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致新的基因組合并促進抗性基因的傳播。解決多物種形成的混合生物膜已成為疾病治療及食品安全的挑戰(zhàn)性難題[30]。

2.2 生物膜內(nèi)細菌的適應(yīng)性機制

生物膜內(nèi)的細菌采用一系列利己生存機制來抵抗消毒劑的致死作用，包括遺傳性和非遺傳性（適應(yīng)性）耐藥/耐受機制，其中“緩慢”增殖導(dǎo)致的持留現(xiàn)象[44]、亞抑制濃度藥物引發(fā)的表型適應(yīng)性，以及在DNA損傷修復(fù)過程中阻止細胞分裂的SOS反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等均是生物膜細菌常見的適應(yīng)性機制。這些機制單獨或協(xié)同作用，導(dǎo)致生物膜細胞對消毒劑的反應(yīng)方式與游離菌截然不同，保護細菌免受各種不同的外界壓力[45]。

2.2.1 亞致死濃度藥物下的表型適應(yīng)性

亞致死濃度下的消毒劑不能有效去除生物膜，甚至生物膜內(nèi)細菌在長期低濃度消毒劑的刺激下會產(chǎn)生適應(yīng)性[46]，如亞抑制濃度的苯扎氯銨可刺激金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和單核細胞增生李斯特菌的抗性，提高生物膜的形成能力[47-48]。這些表型適應(yīng)可能源于特定基因?qū)ζ渌幬h(huán)境的直接反應(yīng)，導(dǎo)致在持續(xù)暴露后，生物膜細菌對消毒劑的適應(yīng)性比游離菌更好，在這種情況下，脂肪酸組成發(fā)生變化，參與能量代謝、蛋白質(zhì)生物合成、適應(yīng)和解毒的特定蛋白質(zhì)會上調(diào)[45，49]。盡管已有大量研究表明亞致死濃度的抗生素或消毒劑會促使細菌耐藥性及生物膜的產(chǎn)生，但在過去的幾年里，研究更多地集中在抗菌劑的殺菌活性及產(chǎn)生耐藥性的機制方面，而對于亞抑制狀態(tài)下的生物膜耐受機制研究相對較少。

2.2.2 生物膜內(nèi)細菌的持留現(xiàn)象

細菌對消毒劑的敏感性還取決于所處的生理狀態(tài)。持留菌是常規(guī)細菌細胞的休眠變體，該細胞亞群表現(xiàn)出短暫的可逆表型，可在持久性狀態(tài)和易感狀態(tài)相互轉(zhuǎn)換，在消毒劑處理下既不生長也不死亡，而最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）保持不變[45]。持久性機制受多種環(huán)境條件的影響，例如營養(yǎng)缺乏、高溫、極端pH值和群體感應(yīng)信號誘導(dǎo)等[50]。因此生物膜內(nèi)很可能同時包含處于多種狀態(tài)的細胞（例如生長期、靜止期、滯后期、應(yīng)激適應(yīng)、休眠期）。

細菌對消毒劑的敏感性取決于所處的生理狀態(tài)，持留現(xiàn)象與生物膜內(nèi)抵抗力的增加相關(guān)，是導(dǎo)致醫(yī)療環(huán)境中嚴(yán)重慢性、復(fù)發(fā)性疾病的重要原因。Soares等[51]研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌的耐受性是由處于持留狀態(tài)的耐受細胞亞群介導(dǎo)，而不是抗性突變體。研究表明，這種生物膜細胞的代謝狀態(tài)和增長率的異質(zhì)性是生物膜對消毒劑耐受性的重要因素，與生物體中特定基因組的差異表達有關(guān)[52]。并且細菌的生長速度和代謝活動受到生物膜內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣可用性差異的影響，一般消毒劑會優(yōu)先殺死代謝活躍的細菌。而在生物膜內(nèi)部，細菌生長速度緩慢或處于休眠狀態(tài)，其細胞酶合成受阻，導(dǎo)致細菌對消毒劑不太敏感，進而保護它們免受消毒劑的殺滅作用，當(dāng)生物膜中的敏感細菌被殺死時，部分休眠體持續(xù)存在，這些持留菌在恢復(fù)生長后將再次形成生物膜[45]。

2.2.3 應(yīng)激反應(yīng)

應(yīng)激反應(yīng)是細菌的另一種適應(yīng)性策略，使細菌能夠快速應(yīng)對不斷變化的環(huán)境條件并確保其生存。其主要方式包括：細胞中的結(jié)構(gòu)修飾，遺傳調(diào)節(jié)機制介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)交換和基因變異、多藥外排、啟動穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)、誘導(dǎo)損傷修復(fù)蛋白的合成、激活特定應(yīng)激酶系統(tǒng)，以及改變胞膜通透性和促進生物膜的形成等[53]。營養(yǎng)缺乏、高低溫、厭氧環(huán)境、較高的滲透壓和酸性環(huán)境及活性氧的產(chǎn)生都會誘導(dǎo)細菌應(yīng)激反應(yīng)，影響細菌的代謝活動。應(yīng)激條件下氧化應(yīng)激反應(yīng)蛋白水平升高，可能導(dǎo)致生物膜對消毒劑作用的抵抗力增加[5，54]，表明生物膜可能是一個比外界游離菌更耐受氧化應(yīng)激的環(huán)境，這在單核李斯特菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌等的生物膜抗性研究中均得到證實[17，53，55]。

細菌調(diào)節(jié)基因表達并介導(dǎo)生物膜形成也是生物膜內(nèi)在抗性的標(biāo)志機制之一，同時在生物膜生長的過程中，生物膜也為遺傳物質(zhì)交換提供了最佳環(huán)境。研究表明，生物膜環(huán)境中的高密度細胞、EPS成分、大量DNA的釋放或膜內(nèi)的營養(yǎng)條件會促進基因表達或基因突變[56]，如Pang等[57]研究發(fā)現(xiàn)，在季銨類消毒劑的壓力作用下，沙門菌生物膜細胞發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致EPS成分多糖產(chǎn)量增加，調(diào)控纖維素的基因（csgD、adrA和bcsA）表達量上調(diào)，以此形成更加致密結(jié)實的生物膜。應(yīng)激反應(yīng)也是增強特定毒力因子表達的一個重要因素，參與調(diào)節(jié)某些食源性病原體的致病性狀[58]。全局應(yīng)激調(diào)節(jié)子RpoS可調(diào)節(jié)菌毛操縱子CsgD在生物膜形成中的表達，這些是影響生物膜形成和表面黏附、毒力的重要因素，并進一步影響生物膜對消毒劑的抗性[59-60]。另外，不同的應(yīng)激環(huán)境促使的遺傳突變會誘導(dǎo)生成更具抗性的亞群，這將增強整個種群在壓力條件下的適應(yīng)性。Veen等[61]研究發(fā)現(xiàn)主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子sigB突變后細菌對消毒劑苯扎氯銨和過氧乙酸具有明顯抵抗力，Luján等[62]研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌錯配修復(fù)系統(tǒng)缺陷后，其生物膜的形態(tài)變異介導(dǎo)對消毒劑更高的耐受性，且這種由基因變異引起的生物膜表型差異在各類菌株中普遍存在。此外，對于具有特定作用靶標(biāo)的消毒劑，應(yīng)激環(huán)境下靶基因的突變也會改變菌群的敏感性，使得大多數(shù)消毒劑對其功能失效，如三氯生靶向FabI酶，fabI基因突變導(dǎo)致其編碼蛋白不能與三氯生有效結(jié)合介導(dǎo)了突變株對三氯生的高水平抗性[63]。

多藥外排作為細菌應(yīng)激的一般作用方式，是細菌最普遍的內(nèi)在耐藥機制之一。通常，外排泵通過從細胞中排出藥物，將細胞內(nèi)藥物濃度降低到亞抑制濃度，使細菌可在常規(guī)治療劑量下生長[64]。外排泵底物多樣，包括抗生素、消毒劑、染料、毒素和有害產(chǎn)物等，外排泵的正常表達有利于維持生物膜的形成[65]。據(jù)目前研究，外排泵在生物膜形成中至少發(fā)揮四種不同的作用：促進EPS形成和調(diào)節(jié)群體感應(yīng)；間接調(diào)控參與生物膜形成的基因；控制有害物質(zhì)的流出，如抗菌劑和代謝產(chǎn)物；并通過促進或阻止自身細胞或其他細胞與接觸表面的黏附來影響胞膜聚集[66]。有研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌多耐藥轉(zhuǎn)運蛋白（multidrug resistance transporters）外排基因acrA、acrB和tolC缺失時，EPS生成量降低，生物膜的形成能力明顯減弱，而acrD、acrE、emrA等基因缺失時其生物膜生長和抗菌素耐藥性能力增強[67]，耐苯扎氯銨的鼠傷寒沙門菌耐受突變體中檢測到外排蛋白AcrAB或AcrEF的過表達[68]。但并不是所有情況下外排泵的缺失或過表達均會對生物膜形成有利，這取決于外排泵基因在生物膜的形成過程中是否起關(guān)鍵作用。部分外排泵基因的缺失、突變或過表達會減弱生物膜的形成能力，如銅綠假單胞菌MexEF-OprN外排泵的過表達可能會降低細胞中群體感應(yīng)信號的胞內(nèi)濃度，從而降低其群體反應(yīng)，導(dǎo)致生物膜形成能力減弱[67]。這些研究表明，一些外排泵可能通過調(diào)控參與生物膜形成的外排基因的表達來影響生物膜的形成[69]。

整體而言，外排泵對生物膜介導(dǎo)的抵抗力是通過多種因素實現(xiàn)的，生物膜的形成過程中需要不同的外排系統(tǒng)參與調(diào)控，因為抑制了一種外排泵會導(dǎo)致其他外排泵的補償性表達。外排泵是否是細胞初始附著、生物膜成熟或生物膜維持所必需的，仍存在爭議，有待進一步研究[66]。

2.3 群體感應(yīng)

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）信號，又稱為自誘導(dǎo)劑（autoinducer），是細菌調(diào)節(jié)行為和細胞間通訊的一種信號方式。通常發(fā)生在細菌物種內(nèi)部以及細菌和其他微生物之間，對于細菌在各種環(huán)境中的生存至關(guān)重要[5，14，70-71]，也是調(diào)節(jié)生物膜生成的重要因素。革蘭陰性菌和革蘭陽性菌具有一系列不同的QS系統(tǒng)，革蘭陰性菌通常使用?；呓z氨酸內(nèi)酯（acyl homoserine lactone，AHL）或其他衍生自S-腺苷甲硫氨酸的分子作為群體感應(yīng)信號[72]。革蘭陽性細菌通常使用分泌的寡肽，統(tǒng)稱為自誘導(dǎo)肽（autoinducing peptides），作為QS的信號分子[66]。

這些QS信號通過控制與生物膜形成、黏附、代謝和毒力相關(guān)的基因表達來調(diào)節(jié)生物膜的抵抗抗菌劑能力[70-71]。在生物膜形成過程中，其第二信使腺苷-3'，5'-環(huán)化一磷酸（cAMP）和雙-（3'-5'）-環(huán)狀二聚鳥苷單磷酸（c-di-GMP）是將環(huán)境因素與基因調(diào)控聯(lián)系起來的關(guān)鍵信號因素，各種環(huán)境因素和QS交流機制會促使細胞中c-di-GMP水平升高[73]，產(chǎn)生黏附素并降低生物膜擴散，有助于EPS的分泌，增加生物膜的產(chǎn)生，從而對消毒劑產(chǎn)生高抗性[74]。

在生物膜成熟和毒力因子方面，抗菌劑會影響QS基因的表達水平[75]。有研究發(fā)現(xiàn)QS基因缺陷菌株可能會增強生物膜以及毒力的表達，不僅能夠加強感染力，且對抗菌劑變得不太敏感[76]。QS系統(tǒng)還介導(dǎo)降解酶的合成，如在銅綠假單胞菌細胞間信號傳導(dǎo)機制中，控制超氧化物歧化酶和過氧化氫酶基因的表達，介導(dǎo)對過氧化氫的抗性[77]。此外，在合適的營養(yǎng)供應(yīng)和環(huán)境中，群體感應(yīng)介導(dǎo)的基因表達在細胞遷移中至關(guān)重要，并且還可以保護細菌細胞免受有害環(huán)境的影響，這些研究表明，群體感應(yīng)系統(tǒng)對生物膜抵抗消毒劑有著直接或間接作用[5]。

3 消除生物膜的新策略

綜上所述，導(dǎo)致生物膜對消毒劑產(chǎn)生抗性的原因復(fù)雜多樣，傳統(tǒng)的消毒劑存在細菌泛耐藥、清除生物膜不徹底、穩(wěn)定性差、嚴(yán)重污染環(huán)境等缺點，在臨床及生活環(huán)境應(yīng)用中極其受限。一方面需要合理規(guī)范使用消毒劑，另一方面為了應(yīng)對多種生物膜感染并提高消毒劑的效率，研究者們也提出了新的方法來控制和根除生物膜[78]。目前有前景的提高消毒劑抗生物膜效率的方法主要是給消毒劑添加輔助劑或聯(lián)合用藥，以彌補當(dāng)前單一消毒劑的用藥缺陷[79]，包括有消毒劑與酶[80]、天然植物分子[81-82]、納米材料[83-84]及與其他消毒劑[85-86]的聯(lián)合應(yīng)用。

其中消毒劑與一些天然植物化學(xué)物質(zhì)結(jié)合，開發(fā)設(shè)計群體感應(yīng)抑制劑（quorum sensing inhibitors， QSIs）被認(rèn)為是開發(fā)新型抗生物膜藥物的突破口。當(dāng)前天然植物化學(xué)物質(zhì)（如酚類、精油、萜類、凝集素、生物堿、多肽和黃酮類等）已成為干擾群體感應(yīng)系統(tǒng)的新治療靶點[87-89]。研究表明阻斷群體感應(yīng)系統(tǒng)，通過抑制群體感應(yīng)基因表達，阻斷EPS的形成或擴散、減少毒力因子的產(chǎn)生，這將阻礙生物膜結(jié)構(gòu)的早期黏附和后期的成熟脫落，從而阻斷生物膜的發(fā)展[90-91]，并提高消毒劑的作用效果，如桉油與氯己定、次氯酸鈉與鼠尾草等植物精油結(jié)合對殺菌及清除生物膜具有協(xié)同作用[92-93]。天然藥物成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有多組分和多靶點的特性，有助于恢復(fù)傳統(tǒng)消毒劑的殺菌作用以及降低生物膜形成能力。將天然藥物與常規(guī)消毒劑聯(lián)合使用，可以發(fā)揮互補和替代作用，是一種很有價值的生物膜感染治療策略。

納米材料與消毒劑結(jié)合，開發(fā)外排泵抑制劑（efflux pump inhibitor，EPI），是另一種很有前景的抗生物膜策略。金屬納米顆粒具有尺寸小、比表面積大，毒性低、生物穩(wěn)定性高且有抗菌活性等優(yōu)點，非常適合成為外排泵結(jié)合位點的競爭性抑制劑[94-95]。研究表明外排泵的遺傳失活和化學(xué)抑制都會導(dǎo)致生物膜EPS的轉(zhuǎn)錄受控和生物膜形成條件的缺乏。如Ahmed等[83]用金納米顆粒包覆的氯己定完全抑制了細菌黏附、定植和釋放EPS，抑制了生物膜形成，Vieira等[84]采用納米-殼聚糖-氯己定的組合方式能夠減少或抑制單一或混合生物膜的形成。

而單獨的QSIs或EPI不足以徹底消除生物膜的形成，因此需要努力研究QSIs與外EPI聯(lián)合治療的療效或使用抑制劑破壞生物膜形成，然后使用消毒劑根除游離細菌。目前大多數(shù)聯(lián)合用藥的研究是在體外進行的，因此迫切需要進行體內(nèi)實驗以確定聯(lián)合用藥的可靠性。

4 展望

嚴(yán)重生物膜感染問題的出現(xiàn)及其對消毒劑的耐藥性或表觀抗性，給醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域帶來了巨大挑戰(zhàn)。迄今為止，研究者針對細菌生物膜對消毒劑處理產(chǎn)生抗性的現(xiàn)象進行了大量報道和探究。本文綜述了影響生物膜對消毒劑敏感性的主要因素，包括物理條件、細胞外基質(zhì)、混合生物膜、適應(yīng)性機制、群體感應(yīng)等（圖1），但造成生物膜消毒劑抗性的因素交叉混合、錯綜復(fù)雜，其中涉及的很多機制仍需進一步的探究。如目前生物膜中持留菌介導(dǎo)的消毒劑抗性確切分子機制仍不全面，仍需要進一步探究；細菌的應(yīng)激反應(yīng)是促使生物膜抗性生成的一種重要的適應(yīng)性機制，深入探究這種生物體內(nèi)代謝途徑的變化也可能成為藥物研發(fā)的新思路。

除了合理應(yīng)用消毒劑外，尋找可有效清除或降低生物膜產(chǎn)生的新策略也對解決生物膜抗性至關(guān)重要。目前改善消毒劑抗性缺陷的方法主要是采用聯(lián)合用藥的方式，其中發(fā)現(xiàn)合適的QSIs和EPI是針對兩種靶點的有效前景策略，尤其是在納米材料及天然植物抑制劑方面，需加強機制及臨床試驗方面的研究，以期盡早投入實際應(yīng)用。

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收稿日期：2021-02-14

基金項目：國家自然科學(xué)基金（No. 81971905和No. 82172316）

作者簡介：羅歡，女，生于1996年，在讀碩士研究生，研究方向為抗生素聯(lián)合用藥對金黃色葡萄球菌的殺菌作用。

E-mail： 1374570956@qq.com

通訊作者，E-mail： zhaox5@xmu.edu.cn