郭利培 劉潔 張文青 史紅健 范婧瑩 王賢文 何迎春

〔摘要〕 目的 研究吳茱萸堿對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信號(hào)通路的影響。方法 （1）將5-8F細(xì)胞分為溶劑對(duì)照組、不同濃度吳茱萸堿組（0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L-1）、順鉑組（cisplatin，4.0 μg·mL-1）；（2）將5-8F細(xì)胞設(shè)為5組：溶劑對(duì)照組、SC79 2.5 μmol·L-1組、SC79+吳茱萸堿 2.0 μmol·L-1組 、吳茱萸堿 2.0 μmol·L-1組、LY294002 50 μmol·L-1組。采用實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀（real time cellular analysis technology， RTCA）監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖的情況；Annexin V-FITC/PI雙熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Hoechest 33342染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)；Western blot法檢測(cè)磷酸肌醇3-激酶蛋白（phosphatidylinositol 3-kiases， PI3K）、磷酸化蛋白質(zhì)激酶蛋白B（phosphorylated protein kinase B， p-AKT）、增殖細(xì)胞核抗原蛋白（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）、X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis， XIAP）、存活蛋白（Survivin）的表達(dá)水平。結(jié)果 與溶劑對(duì)照組相比，不同濃度吳茱萸堿組（0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L-1）顯著抑制5-8F細(xì)胞增殖（P＜0.05或P<0.01）；吳茱萸堿組（1.0、2.0 μmol·L-1）的細(xì)胞核熒光染色增強(qiáng)，凋亡率明顯升高（P<0.01）；PI3K、p-AKT、PCNA、XIAP、Survivin蛋白表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。與吳茱萸堿2.0 μmol·L-1組比較，SC79+吳茱萸堿2.0 μmol·L-1組的PI3K、p-AKT、PCNA、XIAP、Survivin蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05或P＜0.01），且吳茱萸堿抑制5-8F細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論 吳茱萸堿可能通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路活性，下調(diào)增殖及凋亡相關(guān)蛋白PCNA、XIAP、Survivin的表達(dá)水平，最終抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡。

〔關(guān)鍵詞〕 鼻咽癌細(xì)胞；吳茱萸堿；增殖；凋亡；PI3K/AKT信號(hào)通路

〔中圖分類號(hào)〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.04.006

Regulation of evodiamine on PI3K/AKT signaling pathway to inhibit proliferation and

induce apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cells

GUO Lipei1， LIU Jie1， ZHANG Wenqing1， SHI Hongjian1，2，3， FAN Jingying1，2，3， WANG Xianwen2，3，4*， HE Yingchun1，2，3*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Provincial Key Laboratory for the Prevention and Treatment of Ophthalmology and Otolaryngology Diseases with Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Hunan Provincial Ophthalmology and Otolaryngology Diseases Prevention and Treatment with Chinese Medicine and Visual Function Protection Engineering and Technological Research Center， Changsha， Hunan 410208， China; 4. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of evodiamine on proliferation and apoptosis of 5-8F cells in nasopharyngeal carcinoma cells and the role of PI3K/AKT signaling pathway. Methods The 5-8F cells were divided into solvent control group， evodiamine （0.5， 1.0， 2.0， 4.0 μmol·L-1） groups and cisplatin （4.0 μgmol·L-1） group; in addition， the 5-8F cells were divided into 5 groups： solvent control group， SC79 （2.5 μmol ·L-1） group， SC79+evodiamine （2.0 μmol·L-1） group， evodiamine （2.0 μmol·L-1） group， and LY294002 （50 μmol·L-1） group. The cell proliferation was monitored by real time cellular analysis technology （RTCA）， the apoptosis rate was detected by annexin V-FITC/PI double fluorescence staining， and the apoptosis morphology was observed by Hoechest 33342 staining. The expression levels of phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）， phosphorylated protein kinase B （p-AKT）， proliferating cell nuclear antigen （PCNA）， X-linked inhibitor of apoptosis （XIAP） and Survivin were detected by Western blot. Results Compared with the solvent control group， different concentrations of evodiamine （0.5， 1.0， 2.0， 4.0 μmol·L-1） significantly inhibited the proliferation of 5-8F cells （P<0.05 or P<0.01）， and the nuclear fluorescence staining and apoptosis rate of cells in evodiamine group （1.0， 2.0 μmol·L-1） increased significantly （P<0.01）. The protein expression of PI3K， p-AKT， PCNA， XIAP and Survivin decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with evodiamine （2.0 μmol·L-1） group， the protein expression levels of PI3K， p-AKT， PCNA， XIAP and Survivin in SC79+evodiamine （2.0 μmol·L-1） group were elevated （P<0.05 or P<0.01）， and the effects of evodiamine on inhibiting proliferation and inducing apoptosis of 5-8F cells decreased （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion Evodiamine may inhibit proliferation and induce apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cells by inhibiting the activity of PI3K/AKT signaling pathway and down-regulating the expression of proliferation and apoptosis-related proteins PCNA， XIAP and Survivin.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 nasopharyngeal carcinoma cell; evodiamine; proliferation; apoptosis; PI3K/AKT signaling pathway

鼻咽癌是由鼻咽部鱗狀上皮黏膜病變引起的頭頸部惡性腫瘤之一，其發(fā)病具有明顯的地域傾向和性別差異，中國(guó)鼻咽癌的發(fā)病率約占全球的50%[1]。由于頭頸部器官結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且鼻咽癌的好發(fā)部位咽隱窩位置隱匿，發(fā)病初期無(wú)特異性表現(xiàn)，因此，鼻咽癌的早期發(fā)現(xiàn)和傳統(tǒng)手術(shù)治療成為了醫(yī)學(xué)上的難點(diǎn)。近年來(lái)，調(diào)強(qiáng)放療使鼻咽癌治愈率顯著提高，但很多患者出現(xiàn)術(shù)后不耐受，生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響[2]。因此，尋找安全有效的抗鼻咽癌藥物仍然是當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的難題。

中藥因其治療作用廣泛并且毒副作用小，在腫瘤的治療中取得良好效果，中藥單體為中藥的有效提取物，其抗腫瘤活性成分的基礎(chǔ)研究也成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[3]。吳茱萸堿（evodiamine）是從蕓香科植物吳茱萸中提取出的一種吲哚喹唑啉生物堿。研究表明，吳茱萸堿對(duì)人甲狀腺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、胃癌等多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用[4-6]。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinases， PI3K）/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（serine threonine protein kinase， AKT）信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的生存信號(hào)通路之一，已有研究報(bào)道，PI3K/AKT信號(hào)通路在多數(shù)腫瘤中存在異常激活，并且吳茱萸堿能夠通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡[7-12]。在鼻咽癌中，尚無(wú)吳茱萸堿對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路影響的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)研究吳茱萸堿對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討PI3K/AKT信號(hào)通路在吳茱萸堿抗鼻咽癌中的作用，初步闡明吳茱萸堿抗鼻咽癌的部分分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 ?細(xì)胞株

人高轉(zhuǎn)移鼻咽癌5-8F細(xì)胞株（批號(hào)：BNCC341932）購(gòu)自商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司，由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

1.2 ?主要試劑與藥物

RPMI-1640培養(yǎng)基（批號(hào)：WH0022X041）、青霉素-鏈霉素混合液（批號(hào)：WH0621K6）、胰蛋白酶-EDTA消化液（批號(hào)：20220115，北京索萊寶公司）均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；胎牛血清（批號(hào)：2204031，美國(guó)Gibco公司）；BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)：A11244，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；Hoechst 33342染色液（批號(hào)：20210818，北京索萊寶公司）；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（annexin V-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：70-AP101-100，美國(guó)BD公司）；順鉑（cisplatin，批號(hào)：MKCM2435，美國(guó)Sigma公司）；對(duì)照品吳茱萸堿（批號(hào)：23743，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.86%）、SC79（批號(hào)：#17945）、LY294002（批號(hào)：#51598）均購(gòu)自MCE公司；PI3K抗體（批號(hào)：10）、p-AKT抗體（批號(hào)：25）、增殖細(xì)胞核抗原蛋白PCNA抗體（批號(hào)：7）、Survivin抗體（批號(hào)：15）、XIAP抗體（批號(hào)：5）、GAPDH抗體（批號(hào)：8）均購(gòu)自CST公司；山羊抗兔熒光二抗（批號(hào)：C70426-05）、山羊抗小鼠熒光二抗（批號(hào)：D00115-03）購(gòu)自LICOR公司。

1.3 ?主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)：HERAcell150i，賽默飛世爾公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（型號(hào)：ELX800，BioTek公司）；實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析儀（real time cellular analysis technology， RTCA，型號(hào)：xCELLigence RTCA DPlus， 艾森生物科技公司）；雙熒光細(xì)胞分析儀（型號(hào)：Cellometer K2， Nexcelom Bioscience公司）；細(xì)胞成像多功能檢測(cè)系統(tǒng)（型號(hào)：CytationTM 5，BioTek公司）；雙紅外熒光成像系統(tǒng)（型號(hào)：Odyssey CLX，LICOR公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)：Microfuge 20R，Beckman Coulter公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 ?細(xì)胞培養(yǎng)及藥物配制

將鼻咽癌5-8F細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2、濕度飽和的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞密度達(dá)到80%以上，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。吳茱萸堿粉末用DMSO溶解，配制成200 mmol·L-1的儲(chǔ)備液，避光保存于-80 ℃冰箱，使用時(shí)用含10%胎牛血清、90% RPMI-1640培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)基稀釋。

2.2 ?實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析儀監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖

參考胡晶等人[13]的方法，將5×103個(gè)/100 μL的細(xì)胞懸液接種于RTCA專用板，在細(xì)胞生長(zhǎng)曲線進(jìn)入平臺(tái)期之前加入不同濃度吳茱萸堿（0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L-1），繼續(xù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖。機(jī)制部分以SC79為PI3K/AKT信號(hào)通路激活劑，LY294002作為信號(hào)通路抑制劑，分組設(shè)置為溶劑對(duì)照組、SC79 2.5 μmol·L-1組、SC79+吳茱萸堿2.0 μmol·L-1組、吳茱萸堿 2.0 μmol·L-1組、LY294002 50 μmol·L-1組。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2.3 ?Annexin V-FITC/PI雙熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

根據(jù)RTCA監(jiān)測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿1.0、2.0 μmol·L-1的濃度抑制細(xì)胞增殖效果較好，因此設(shè)置分組為溶劑對(duì)照組、吳茱萸堿1.0 μmol·L-1、吳茱萸堿2.0 μmol·L-1組、順鉑組 4.0 μg·mL-1，檢測(cè)凋亡率；機(jī)制部分分組同“2.2”項(xiàng)。

干預(yù)細(xì)胞24 h后收集上清液于EP管，用不含EDTA的胰酶消化貼壁細(xì)胞，加入2 mL全培終止消化，將細(xì)胞懸液收集到含有上清液的EP管，離心棄去上清液，用PBS重懸轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管，繼續(xù)離心去上清，加入100 μL 1×Binding Buffer輕輕吹打重懸，分別加入annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL染色液避光染色15 min，再加入100 μL 1×Binding Buffer終止染色。使用雙熒光細(xì)胞分析儀檢測(cè)凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 ?Hoechst 33342染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)

常規(guī)消化細(xì)胞后接種于6孔板，細(xì)胞貼壁后棄除上清液加入不同濃度吳茱萸堿1.0、2.0 μmol·L-1。培養(yǎng)24 h，棄上清，用PBS清洗2次，于每孔加入1 mL 10 mg·L-1的Hoechst 33342染色工作液，避光孵育20 min，PBS洗滌2次。CytationTM 5觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)并拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 ?Western blot檢測(cè)PI3K、p-AKT、PCNA、XIAP、Survivin表達(dá)水平

藥物分組同“2.3”項(xiàng)，干預(yù)細(xì)胞24 h后，提取總蛋白定量，配制蛋白樣品、凝膠分離體系，將蛋白樣品加入泳道，在濃縮膠中采用40 V電壓濃縮，進(jìn)入分離膠后加壓至80 V分離，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜2.5 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗置于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，二抗室溫避光孵育1.5 h。雙色紅外熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃膜，并用Image Studio分析條帶信號(hào)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 26.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用“ｘ±s”表示，多組間比較服從正態(tài)分布，采用單因素方差分析，組間方差齊時(shí)用LSD檢驗(yàn)，方差不齊，選擇Games-Howell（A）檢驗(yàn)；不服從正態(tài)分布資料，采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?吳茱萸堿對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞增殖的影響

與溶劑對(duì)照組相比，不同濃度（0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L-1）吳茱萸堿組的細(xì)胞增殖曲線降低，且細(xì)胞相對(duì)增殖率顯著低于溶劑對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01），表明吳茱萸堿能夠抑制5-8F細(xì)胞增殖。詳見圖1。

3.2 ?吳茱萸堿對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞凋亡率的影響

與溶劑對(duì)照組比較，吳茱萸堿組細(xì)胞凋亡率明顯提高（P＜0.01）（見表1和圖2）。Hoechst 33342染色結(jié)果顯示，吳茱萸堿組細(xì)胞核亮藍(lán)色熒光增強(qiáng)，細(xì)胞核邊緣不清晰，核內(nèi)出現(xiàn)點(diǎn)狀式破碎等凋亡特征（見圖3）。

3.3 ?吳茱萸堿對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路和增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

與溶劑對(duì)照組比較，吳茱萸堿1.0 μmol·L-1組p-AKT、Survivin蛋白表達(dá)下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），PI3K、XIAP、PCNA明顯降低（P＜0.01）；吳茱萸堿2.0 μmol·L-1組PI3K、p-AKT、PCNA、XIAP、Survivin蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01）。詳見圖4。

3.4 ?吳茱萸堿通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖凋亡的影響

與溶劑對(duì)照組相比，PI3K/AKT信號(hào)通路激活劑（SC79）能夠提高PI3K、p-AKT、PCNA、XIAP、Survivin的表達(dá)水平（P＜0.01或P＜0.05），而PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑（LY294002）能夠降低PI3K、p-AKT、PCNA、XIAP、Survivin的表達(dá)水平（P＜0.01）。與吳茱萸堿2.0 μmol·L-1組比，激活劑聯(lián)合藥物（SC79+吳茱萸堿2.0 μmol·L-1）組的PI3K、p-AKT、PCNA、XIAP、Survivin表達(dá)水平升高（P＜0.01或P＜0.05）（見圖5）。使用PI3K/AKT信號(hào)通路激活劑后，與吳茱萸堿2.0 μmol·L-1組相比，SC79+吳茱萸堿2.0 μmol·L-1組細(xì)胞的增殖曲線升高，且細(xì)胞增殖率增加（P＜0.01或P＜0.05），凋亡率降低（P＜0.01）（見表2、圖6-7）。

4 討論

鼻咽癌發(fā)生位置隱蔽，前期癥狀不典型，如何實(shí)現(xiàn)鼻咽癌的精準(zhǔn)診治，制訂“高效低毒”的治療方案，仍是亟待解決的問(wèn)題。中藥單體對(duì)抑制鼻咽癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為具有一定的抑制作用，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷能夠促進(jìn)自噬[14]；劉潔等[15]發(fā)現(xiàn)黃芩苷能夠通過(guò)調(diào)控TGF-β1/ERK1/2信號(hào)通路抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖；周芳亮等[16]證實(shí)小檗堿聯(lián)合人參皂苷可協(xié)同抑制鼻咽癌細(xì)胞遷移。

X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein， XIAP）在鼻咽癌中呈高表達(dá)，抑制XIAP蛋白的表達(dá)能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡[17]，存活蛋白Survivin具有抗凋亡及促進(jìn)增殖作用，研究表明，抑制Survivin的表達(dá)能夠減緩鼻咽癌細(xì)胞增殖活性，并加快腫瘤細(xì)胞的凋亡進(jìn)度[18]。增殖細(xì)胞核抗原蛋白（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）可促進(jìn)DNA復(fù)制與修復(fù)，促使腫瘤細(xì)胞增殖，在腫瘤中能夠反映腫瘤細(xì)胞增殖活性[19]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RTCA證實(shí)了不同濃度吳茱萸堿能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，在吳茱萸堿作用下，細(xì)胞核亮藍(lán)熒光染色增強(qiáng)，胞核邊界模糊，細(xì)胞凋亡率升高，并且吳茱萸堿下調(diào)了鼻咽癌5-8F細(xì)胞中XIAP、Survivin、PCNA的表達(dá)水平，提示吳茱萸堿抑制鼻咽癌增殖和誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)可能與抑制XIAP、Survivin、PCNA蛋白的表達(dá)相關(guān)。PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路之一，人體內(nèi)多數(shù)腫瘤蛋白和腫瘤抑制因子在PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中以一種平衡的方式會(huì)聚參與細(xì)胞代謝和信號(hào)調(diào)節(jié)，但在腫瘤發(fā)展中，這種平衡可通過(guò)激活和失活機(jī)制打破。在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，吳茱萸堿能夠調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[20-22]，在鼻咽癌中尚無(wú)報(bào)道。本研究證實(shí)吳茱萸堿能夠抑制PI3K/AKT信號(hào)通路活性，且使用PI3K/AKT信號(hào)通路激活劑后，吳茱萸堿抑制PI3K、p-AKT、PCNA、XIAP、Survivin蛋白表達(dá)的能力被減弱，同時(shí)吳茱萸堿抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)受到了抑制。而LY294002組的蛋白表達(dá)水平和增殖活性均降低，凋亡率升高，與吳茱萸堿組對(duì)細(xì)胞的作用趨勢(shì)一致，提示吳茱萸堿抑制鼻咽癌5-8F細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的部分機(jī)制是通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究證實(shí)吳茱萸堿能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，并初步驗(yàn)證了其抗鼻咽癌作用與抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而降低增殖和凋亡相關(guān)蛋白PCNA、XIAP、Survivin的表達(dá)水平有關(guān)。

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〔收稿日期〕2022-11-07

〔基金項(xiàng)目〕國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81973914，81874408）；湖南省教育廳項(xiàng)目（21B0358，21C0241）；湖南省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（D2022105）；2021年度湖南中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)科研基金項(xiàng)目（2021XJJJ014，2021XJJJ008）；湖南省衛(wèi)生健康委員會(huì)項(xiàng)目（D202307017740）。

〔第一作者〕郭利培，女，碩士研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治耳鼻喉疾病。

〔通信作者〕*何迎春，女，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：heyingchun@hnucm.edu.cn；王賢文，男，博士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：zhuangzhilinyun@163.com。