姜冉冉 江潤海 朱城強(qiáng) 侯秀麗

關(guān)鍵詞：狗牙根；乙二胺四乙酸（EDTA）；抗氧化酶系統(tǒng)；植物鉛富集；土壤磷、鉛形態(tài)

隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，土壤重金屬污染已成為全球關(guān)注的生態(tài)環(huán)境問題之一，在工業(yè)密集區(qū)域、重金屬礦開采區(qū)域重金屬污染加重。因重金屬在土壤中具有不易降解和持久性的特點(diǎn)，會對生物圈構(gòu)成前所未有的威脅。其中鉛（Pb）是一種有毒重金屬，對動物、植物和微生物的危害較大。目前重金屬污染土壤的植物修復(fù)技術(shù)主要分為植物提取、植物固定、植物揮發(fā)和根際過濾。植物修復(fù)技術(shù)具有成本低、綠色安全、對原生環(huán)境破壞小且兼具環(huán)境美學(xué)等特點(diǎn)。近年來，草坪草在土壤重金屬修復(fù)工作中發(fā)揮了重要的成效，從國內(nèi)外研究現(xiàn)狀來看，草坪植物的修復(fù)作用越發(fā)引人關(guān)注。如國內(nèi)外廣泛栽培的多花黑麥草對鋅、鎘和鉛都有明顯的富集效果，馬蹄金和白三葉在草坪綠化中運(yùn)用較多，不僅抗病、抗污染能力較強(qiáng)，同時(shí)對土壤重金屬鉛具有一定的富集能力。陳明君等認(rèn)為狗牙根能夠明顯降低江水中的銅、鉛和鋅含量。但植物修復(fù)技術(shù)因受到多重環(huán)境污染和植物特性不同的影響，在具體實(shí)踐中具有一定的局限性。因此可利用螯合劑一植物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)，螯合劑能促進(jìn)土壤中重金屬的溶解，改變重金屬在土壤中的存在形態(tài)，形成水溶性螯合物，提高重金屬的生物有效性，增加重金屬在植物地上部的積累，螯合劑一植物修復(fù)作為一種經(jīng)濟(jì)環(huán)保的修復(fù)技術(shù)，具有良好的應(yīng)用前景。

乙二胺四乙酸（EDTA）螯合劑因去除重金屬效率較高而被廣泛應(yīng)用于土壤重金屬污染修復(fù)。有研究表明EDTA能增強(qiáng)植物對鉛的吸收，可誘導(dǎo)重金屬從礦物質(zhì)中解吸，并促進(jìn)土壤中重金屬鉛從根向地上部的轉(zhuǎn)移。在印度芥菜中發(fā)現(xiàn)螯合物輔助莖的鉛積累量增加100～200倍，而在豌豆和玉米中重金屬積累有多倍的增加。Kirkham指出當(dāng)向日葵生長在受污水污泥污染的土壤中時(shí)，地上部鉛含量顯著增加。螯合劑不僅促進(jìn)鉛的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，而且保護(hù)植物免受重金屬暴露產(chǎn)生的氧化應(yīng)激。而施加EDTA是否能提高狗牙根對重金屬耐性的機(jī)制研究目前尚未見報(bào)道。因此本試驗(yàn)探究了重金屬鉛脅迫下施加不同濃度EDTA對狗牙根生理特性、鉛的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)及根際土壤磷、鉛形態(tài)的變化機(jī)制，以期為重金屬鉛污染土壤的修復(fù)以及植被恢復(fù)或綠地規(guī)劃提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料及設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2021年8月在昆明學(xué)院溫室大棚進(jìn)行。采用盆栽試驗(yàn)，設(shè)置0（CK）、2.5、5、7.5、10mmol/L共5個(gè)EDTA濃度處理，每處理重復(fù)3次。

根據(jù)云南省蘭坪縣鉛鋅礦區(qū)土地利用類型中的開采礦區(qū)鉛含量范圍106.4～738.74mg/kg，設(shè)置土壤鉛污染濃度。供試土壤為云南省昆明市紅土與腐殖土，1：1混合備用稱為原土：原土添加重金屬鉛（PbC03）500mg/kg充分混勻，螯合2個(gè)月，模擬鉛污染土壤稱為鉛螯合土壤。原土與鉛螯合土壤基本理化性質(zhì)如表1所示。塑料盆規(guī)格為25cm（直徑）×17cm（高），裝土2.5kg（干重），盆下帶托盤。供試植物為多年生狗牙根（Cynodon dactylon L），每盆100粒（以保證發(fā)芽后每盆大于70株）。溫室晝／夜溫度為25/15℃，每兩天澆一次水，以保持土壤含水率為最大持水量的70%，水不滲出托盤。播種后第30天和第45天直接以溶液形式分別向土壤中施加不同濃度的EDTA，每次施加量為50mL，第60天收獲狗牙根。

1.2測定指標(biāo)及方法

1.2.1植物樣品采集及測定于收獲期采集狗牙根樣品，去除根部大塊土壤，置于冰上運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，用去離子水沖洗，吸水紙吸干表面水分。一部分狗牙根樣品用于生理指標(biāo)的測定，狗牙根葉片、根系的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）含量測定均參照南京建成生物工程研究所提供試劑盒進(jìn)行。另一部分狗牙根樣品于70℃條件下殺青，置于烘箱內(nèi)烘至恒重，取出后將狗牙根地上部和根系樣品粉碎，采用混合酸（硝酸：過氧化氫=4：1）消解，過濾定容，用于測定地上部及根系鉛含量。

狗牙根對重金屬鉛的轉(zhuǎn)移能力用轉(zhuǎn)移系數(shù)（TF）表示，計(jì)算方法為狗牙根地上部鉛含量與根部鉛含量比值。

1.2.2土壤樣品采集及測定取出狗牙根后晃動根部，去除松散的土壤后，使用無菌刷從根部收集殘留在其上的土壤。土壤樣品經(jīng)自然風(fēng)干，去除石礫、有機(jī)殘?bào)w、植物根系等，過0.149mm篩后分別用于測定不同形態(tài)磷、鉛含量。不同形態(tài)磷測定采用張守敬提出的連續(xù)提取法，分為Al-P（鋁結(jié)合態(tài)磷酸鹽）、Fe-P（鐵結(jié)合態(tài)磷酸鹽）、0-P（閉蓄態(tài)磷酸鹽）、Ca-P（鈣結(jié)合態(tài)磷酸鹽），利用不同化學(xué)浸提劑的特性，將土壤中各種形態(tài)的無機(jī)磷酸鹽逐級分離，再利用鉬銻抗比色法測定。土壤各形態(tài)鉛含量測定采用中國地質(zhì)局提出的七步提取法，采用ICP-MS，根據(jù)在土壤各相中的分布及其結(jié)合特點(diǎn)，一般可將土壤中的鉛分為水溶態(tài)、離子交換態(tài)、碳酸鹽結(jié)合態(tài)、腐殖酸結(jié)合態(tài)、鐵錳氧化態(tài)、強(qiáng)有機(jī)結(jié)合態(tài)以及殘?jiān)鼞B(tài)。前3種鉛形態(tài)穩(wěn)定性差，但僅占土壤中鉛總量的少部分，后4種鉛形態(tài)穩(wěn)定性強(qiáng)占大部分。土壤重金屬鉛污染主要來源于前3種不穩(wěn)定形態(tài)鉛，該形態(tài)鉛易被植物吸收，歸為有效態(tài)。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，SPSS 22.0進(jìn)行單因素分析（ANOVA-Test）及差異顯著性檢驗(yàn)，Origin 2018制圖。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度EDTA對重金屬鉛脅迫下狗牙根抗氧化酶系統(tǒng)指標(biāo)的影響

不同濃度EDTA對重金屬鉛脅迫下狗牙根葉片、根系SOD活性的影響如圖1A所示。隨著EDTA濃度的增加狗牙根葉片、根系SOD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且葉片>根系，說明葉片受到脅迫后產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)高于根系。ED-TA施用濃度為5mmol/L時(shí)，狗牙根葉片、根系SOD活性最高，分別為173.77、158.65U/mg prot；EDTA濃度為10mmol/L時(shí)，狗牙根葉片、根系SOD活性最低，顯著低于對照組，分別為116.80、99.94U/mg prot，這可能是由于高濃度EDTA與重金屬鉛形成的螯合物具有低毒性，降低了狗牙根的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

由圖IB看出，不同濃度EDTA處理的狗牙根葉片POD活性均明顯高于根系。與對照相比，各濃度處理葉片POD活性無顯著差異：而2.5mmol/L低濃度EDTA處理顯著高于10mmol/L高濃度處理。不同濃度EDTA處理的狗牙根根系POD活性均顯著高于對照，且以10mmol/L處理最高，為194.33U/g，是對照的1.63倍，表明狗牙根根部受到脅迫時(shí)，啟動POD清除H207，降低鉛誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，保護(hù)膜系統(tǒng)，增強(qiáng)狗牙根對鉛的耐受力。

由圖1C看出，隨EDTA濃度的增加狗牙根CAT活性整體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，EDTA濃度為7.5mmol/L時(shí)，狗牙根葉片、根系CAT活性最低，分別為65.25、36.79U/mg prot．分別比對照顯著降低49.53%、49.99%，10mmol/L處理下CAT活性又顯著升高。不同濃度EDTA處理的狗牙根葉片CAT活性均明顯高于根系，可能是由于葉片是光合作用的主要器官，酶活性變化比較敏感。

由圖1D看出，重金屬鉛脅迫下狗牙根葉片與根MDA含量隨EDTA濃度的增加先升高后降低，且不同濃度處理均高于對照。2.5mmol/L EDTA處理的葉片MDA含量最高，為68.68 nmol/mg prot，顯著高出對照1.28倍，且明顯高于根部：EDTA濃度>2.5mmol/L時(shí)，各處理狗牙根葉片MDA含量均低于根部。5mmol/L EDTA處理下根部MDA含量最高，為56.07 nmol/mg prot，較對照顯著提高1.61倍；其次為10mmol/L處理，是對照的1.95倍。

2.2不同濃度EDTA對重金屬鉛脅迫下狗牙根根際與非根際土壤磷形態(tài)的影響

施加不同濃度EDTA后狗牙根根際及非根際土壤中4種形態(tài)無機(jī)磷含量的變化如圖2所示?？梢钥闯?，根際與非根際土壤閉蓄態(tài)磷酸鹽（0-P）含量最高，磷酸鋁（A1-P）含量最低，且根際土壤各形態(tài)無機(jī)磷含量均高于非根際土壤。施加不同濃度EDTA后，狗牙根根際土壤0-P含量顯著低于對照，其中2.5mmol/L處理最低，為441.67mg/kg，較對照降低81.07%：在非根際土壤中，添加EDTA后（除5mmol/L）土壤O-P含量較對照有不同程度的增加，其中2.5mmol/L處理的最高，為600mg/kg，顯著高于對照。10mmol/L EDTA處理的狗牙根根際、非根際土壤磷酸鈣（Ca-P）含量較對照分別顯著降低39.42%、51.24%，但根際土壤中磷酸鐵（Fe-P）含量較高，為158.36mg/kg，顯著高于對照，是對照的1.92倍，說明添加EDTA有利于重金屬鉛脅迫下狗牙根根際土壤Fe-P含量的增加。

2.3不同濃度EDTA對狗牙根鉛含量、轉(zhuǎn)移系數(shù)及根際土壤鉛形態(tài)的影響

由表2看出，與對照相比，施加EDTA后狗牙根地上部、根部對鉛的富集明顯增加，并且隨ED-TA濃度的增加鉛富集量明顯升高。施加10mmol/L EDTA后狗牙根地上部和根部鉛含量分別達(dá)到19.36mg/kg和17.75mg/kg，分別為對照的8.84倍和1.91倍。EDTA的添加提高了狗牙根對鉛的轉(zhuǎn)移系數(shù)，且隨濃度的增加而升高，其中以10mmol/L處理的轉(zhuǎn)移系數(shù)最大，為1.19，是對照的4.96倍，這說明高濃度EDTA促進(jìn)了重金屬鉛由根部向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)。

不同濃度EDTA處理后狗牙根根際土壤中不同形態(tài)鉛含量的變化如圖3所示。可以看出，狗牙根根際土壤中鐵錳氧化態(tài)鉛含量最高，其次為殘?jiān)鼞B(tài)鉛、腐殖酸結(jié)合態(tài)鉛和強(qiáng)有機(jī)結(jié)合態(tài)鉛，有效態(tài)鉛含量最低。隨EDTA濃度的增加，狗牙根根際土壤有效態(tài)鉛含量也增加，并以10mmol/L處理的有效態(tài)鉛含量最高，為92.83mg/kg，與對照差異顯著，為對照的1.84倍；根際土壤中鐵錳氧化態(tài)鉛含量隨EDTA濃度的增加顯著下降，且以7.5mmol/L處理最低，為183.88mg/kg；10mmol/L處理的殘?jiān)鼞B(tài)鉛、腐殖酸結(jié)合態(tài)鉛、強(qiáng)有機(jī)結(jié)合態(tài)鉛含量分別為45.26、65.27、13.67mg/kg，均顯著低于對照。說明施用EDTA能夠有效促進(jìn)土壤鐵錳氧化態(tài)鉛、殘?jiān)鼞B(tài)鉛、腐殖酸結(jié)合態(tài)鉛和強(qiáng)有機(jī)結(jié)合態(tài)鉛向有效態(tài)鉛轉(zhuǎn)化，增加了土壤中有效態(tài)鉛含量，進(jìn)而提高土壤中可供植物吸收的重金屬鉛含量。

3討論

3.1重金屬Pb脅迫下施加EDTA對狗牙根抗氧化酶系統(tǒng)的影響

抗氧化酶系統(tǒng)及MDA在植物適應(yīng)逆境過程中發(fā)揮重要作用。重金屬鉛脅迫下，狗牙根葉片SOD、POD、CAT活性及MDA含量總體上高于根系，可能是葉片是光合作用的主要器官，酶活性變化比較敏感。SOD在消除超氧化物自由基、減輕脂質(zhì)過氧化作用和膜傷害方面發(fā)揮重要作用。在鉛污染土壤中施加不同濃度EDTA，狗牙根SOD活性先升高后下降，說明適宜濃度的EDTA對鉛脅迫下的狗牙根傷害起到緩解作用，使狗牙根適應(yīng)脅迫環(huán)境的能力得到提高。一般認(rèn)為，逆境脅迫下SOD活性會有所增加。也有研究表明SOD作為一種誘導(dǎo)酶，在重金屬鉛脅迫下植物體內(nèi)02含量的增加能誘導(dǎo)其活性上升，SOD活性提高是02含量增加的應(yīng)急解毒措施，是植物細(xì)胞免受毒害的調(diào)節(jié)反應(yīng)。但高濃度EDTA處理下SOD活性下降，可能是由于EDTA與重金屬鉛螯合后，降低了細(xì)胞內(nèi)的重金屬濃度或使其處于非活性狀態(tài)。POD廣泛存在于植物體各組織器官中，對過氧化物起清除作用，抑制其對膜脂的過氧化作用，避免膜損傷和破壞。本研究中，施加EDTA對狗牙根葉片POD活性影響不明顯，而顯著提高根部POD活性，且以10mmol/L處理最高，為194.33U/g。表明根部受到鉛與EDTA脅迫后優(yōu)先啟動POD清除H，02，這與Habiba等的研究結(jié)論類似。過氧化氫酶（CAT）是一種包含血紅素的四聚體酶，可與SOD協(xié)同消除H202，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。EDTA濃度為7.5mmol/L時(shí)，狗牙根葉片、根系CAT活性最低，分別為65.25、36.79U/mg prot。植物細(xì)胞壁是重金屬離子進(jìn)入細(xì)胞的第一道屏障，狗牙根作為耐性植物，其耐重金屬的原因可能是細(xì)胞壁對重金屬有沉淀作用，因而降低了重金屬進(jìn)入細(xì)胞的濃度，進(jìn)而減輕對根細(xì)胞結(jié)構(gòu)、葉片及其生理功能的傷害。10mmol/L EDTA處理的CAT活性升高，表明施加高濃度EDTA提高了狗牙根的氧化應(yīng)激。MDA是植物細(xì)胞膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物，對細(xì)胞膜具有毒害作用。本研究中，隨ED-TA濃度的增加MDA含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，高濃度EDTA處理下MDA含量降低，這是因?yàn)镋DTA與重金屬鉛螯合形成螯合物，膜脂過氧化程度減輕。一般認(rèn)為，MDA在植物體內(nèi)增加的原因有兩點(diǎn)：一是與自由基有關(guān)，02傷害植物的機(jī)理之一在于參與啟動膜脂過氧化或膜脂脫脂作用．在H202作用下，通過Habe-weiss生化反應(yīng)產(chǎn)生攻擊力更強(qiáng)的羥基，并啟動膜脂過氧化，造成MDA含量增加：二是與活性氧有關(guān)，活性氧對許多生物功能分子有破壞作用，如氨基酸、蛋白質(zhì)、糖類等，最終引起膜脂過氧化作用，導(dǎo)致MDA含量增加。

3.2重金屬Pb脅迫下施加EDTA對土壤無機(jī)磷的影響

EDTA具有較強(qiáng)螯合作用，施人土壤后對磷素有解吸作用，可降低土壤膠體對磷的固定，同時(shí)與磷爭奪鈣、鎂、鐵、鋁等陽離子和土壤吸附位點(diǎn)，促進(jìn)難溶性磷的釋放與轉(zhuǎn)化從而增加其有效態(tài)含量。王曉純研究指出未起到增加效果的處理可能是土壤中易轉(zhuǎn)化態(tài)的養(yǎng)分含量過低，導(dǎo)致EDTA對養(yǎng)分的螯合作用較弱。EDTA施入后促使根際微生物分泌更多的有機(jī)酸、磷酸酶及質(zhì)子等，促進(jìn)難溶性磷的活化，提高作物的磷素吸收。許多研究表明，向土壤中施入腐殖酸和EDTA可提升土壤磷素的有效性。本試驗(yàn)中，施加EDTA后狗牙根根際、非根際土壤中O-P含量均高于其它形態(tài)磷，且根際土壤各形態(tài)無機(jī)磷含量總體高于非根際土壤。10mmol/L EDTA處理后狗牙根根際、非根際土壤Ca-P含量均最低，而根際土壤中Fe-P較高。這可能是由于EDTA通過螯合作用與磷酸根競爭土壤中的吸附位點(diǎn)以降低磷的吸附，促進(jìn)磷素釋放，同時(shí)促進(jìn)根際土壤Fe-P、O-P等無機(jī)磷的活化，進(jìn)而利于狗牙根對磷的吸收。有研究發(fā)現(xiàn)，添加EDTA和低分子量有機(jī)酸會增加土壤中的無機(jī)磷，這主要來自Ca-P、Al-P、Fe-P等的累積，而對O-P含量影響不大。本研究結(jié)果與前人的結(jié)論相似，添加螯合劑EDTA總體上增加了根際土壤的無機(jī)磷總量，并改變土壤各形態(tài)無機(jī)磷占無機(jī)磷總量的比例。

3.3重金屬Pb脅迫下施加EDTA對狗牙根鉛含量、轉(zhuǎn)移系數(shù)及根際土壤鉛形態(tài)的影響

施加EDTA后土壤重金屬主要以螯合物的形式存在，而在金屬螯合物作用下植物根部內(nèi)皮層的凱氏帶易被破壞，原因可能是EDTA具有破壞細(xì)胞膜通透性的能力，導(dǎo)致金屬螯合物進(jìn)入根部組織。因此，EDTA的施加可以增加重金屬從根到地上部的轉(zhuǎn)移。本試驗(yàn)中EDTA的施加促進(jìn)了狗牙根根部對重金屬鉛的吸收及地上部對鉛的積累，且隨EDTA濃度的增加而升高。螯合劑通過與土壤重金屬螯合，提高重金屬在土壤溶液中的溶解度，但螯合后的重金屬能否被植物吸收一直是個(gè)有爭議的問題。有研究認(rèn)為植物的根不能吸收螯合劑及其金屬螯合物。而Vassil等通過水培試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鉛和EDTA處理的印度芥菜，其地上部能同時(shí)積累EDTA和鉛，且以Pb-EDTA的形式向上運(yùn)輸，植物體內(nèi)EDTA與鉛的比例為1：0.67，該研究認(rèn)為Pb-EDTA能夠被植物所吸收。本研究中，隨EDTA濃度升高，狗牙根地上部和根系對重金屬鉛的吸收增加。當(dāng)EDTA施加濃度為10mmol/L時(shí)，狗牙根鉛含量最高，轉(zhuǎn)移系數(shù)最大，為1.19，說明高濃度EDTA促進(jìn)重金屬鉛由地下部向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)。

土壤重金屬鉛以鐵猛氧化態(tài)為主，而這種形態(tài)鉛較難被植物吸收利用。螯合劑EDTA能活化土壤中的鉛，使其更易被植物吸收或吸附去除，從而降低土壤鉛含量。本試驗(yàn)中，有效態(tài)鉛含量隨EDTA濃度的增加總體呈升高趨勢，而鐵錳氧化態(tài)鉛呈現(xiàn)下降趨勢。強(qiáng)有機(jī)結(jié)合態(tài)鉛在有機(jī)質(zhì)分解時(shí)被逐漸釋放，因此狗牙根對土壤重金屬鉛的吸收與其形態(tài)分布密切相關(guān)。當(dāng)EDTA濃度為10mmol/L時(shí)，根際土壤有效態(tài)鉛含量高于其它形態(tài)鉛含量（除鐵錳氧化態(tài)外），說明施用EDTA能夠有效促進(jìn)鉛形態(tài)的轉(zhuǎn)化，增加植物對鉛的吸收利用，這可能是由于施人EDTA后導(dǎo)致土壤溶液中的自由離子減少，打破沉淀溶解平衡，促進(jìn)其它形態(tài)鉛向有效態(tài)轉(zhuǎn)變，從而形成新的沉淀溶解平衡：也有研究認(rèn)為EDTA與Pb形成的螯合物亦屬于有效態(tài)，其原因在于EDTA本身帶有6個(gè)電子基團(tuán)，分布在氮原子及羧基上，可以與土壤中重金屬離子反應(yīng)，通過釋放土壤顆粒上吸附的重金屬離子進(jìn)而增加土壤中有效態(tài)重金屬含量。綜上所述，狗牙根修復(fù)鉛污染土壤過程中，EDTA的施用濃度以10mmol/L為宜，促進(jìn)狗牙根根際土壤鉛形態(tài)轉(zhuǎn)化的效果較好。

4結(jié)論

重金屬鉛脅迫下施加EDTA可提高狗牙根的氧化應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)狗牙根在高濃度鉛脅迫下的耐受能力。10mmol/L EDTA處理顯著降低重金屬鉛脅迫下狗牙根根際與非根際土壤難溶Ca-P含量，提高根際土壤Fe-P含量：促進(jìn)根際土壤中鐵錳氧化態(tài)鉛、腐殖酸結(jié)合態(tài)鉛、殘?jiān)鼞B(tài)鉛、強(qiáng)有機(jī)結(jié)合態(tài)鉛向有效態(tài)鉛的轉(zhuǎn)化，提高狗牙根地上部、根部對鉛的富集吸收。因此EDTA作為修復(fù)重金屬鉛污染土壤的有效螯合劑．可明顯提高狗牙根對鉛污染土壤的修復(fù)作用。