齊玉璽 張琇 楊國平 季鴻飛 沈婷婷 吳凱華

關(guān)鍵詞：人參地微桿菌；菌株鑒定；耐鹽堿；促生作用；水稻

土壤鹽漬化是一個(gè)全球性問題，由于受到人類活動(dòng)與自然環(huán)境破壞的影響，鹽堿地面積仍有增大趨勢(shì)。土壤鹽漬化抑制植物的光合作用、影響相關(guān)酶活性及代謝途徑使作物減產(chǎn)。雖然現(xiàn)有鹽堿地改良措施如水利、物理、化學(xué)等方法發(fā)揮了較好的作用，但因改良成本高、易反復(fù)等問題使得鹽堿地利用率不高。許多研究表明，植物根際促生菌（plant growth promoting thizobacte-ria， PGPR）可依靠解磷、解鉀、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA等促生功能，提高植物在逆境脅迫下的生存能力；PGPR還可通過提高清除活性氧（ROS）相關(guān)酶活性，減少有害物質(zhì)積累，促進(jìn)植物在逆境條件下的生長。PGPR已成為用于改良鹽堿地方法的研究熱點(diǎn)之一，因此探索微生物提高作物抗鹽堿能力，對(duì)于促進(jìn)鹽堿地的開發(fā)利用具有重要意義。

水稻（Oryza sativa L．）作為世界一半人口的主食，同時(shí)也是重要的工業(yè)原料，稻殼、稻稈等部分還可作為飼料。隨著土壤鹽漬化愈加嚴(yán)重，土地資源緊缺，越來越多的水稻開始種植于鹽堿地，但是產(chǎn)量和品質(zhì)明顯降低。王華笑等研究發(fā)現(xiàn)接種解淀粉芽孢桿菌YM6菌株（Bacillus arnyloliquefaciens YM6）可以提高鹽脅迫下玉米抗氧化酶活性及脯氨酸（Pro）含量，降低氧化物質(zhì)量分?jǐn)?shù)：李麗艷等研究發(fā)現(xiàn)彎曲芽孢桿菌（BacilLus flexus）可以提高鹽脅迫下燕麥抗氧化酶活性及Pro含量，降低氧化物質(zhì)量分?jǐn)?shù)。目前關(guān)于促生菌促進(jìn)鹽堿條件下水稻生長的報(bào)道相對(duì)較少。

本研究以課題組前期篩選得到的能促進(jìn)鹽堿脅迫下水稻生長的S4菌為研究對(duì)象，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，探究S4菌對(duì)鹽堿脅迫下水稻生理指標(biāo)及根和葉的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、可溶性糖（SS）和可溶性蛋白（SP）等抗逆相關(guān)酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響，以期為促生菌促進(jìn)鹽堿地水稻生長的機(jī)理提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1生物材料

試驗(yàn)于2022年2-6月于北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。S4菌保藏在寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。水稻品種為寧粳51號(hào)。

1.1.2培養(yǎng)基及植物營養(yǎng)液TSA培養(yǎng)基、無機(jī)磷培養(yǎng)基、有機(jī)磷培養(yǎng)基、CAS培養(yǎng)基、R2A培養(yǎng)基、硅酸鹽培養(yǎng)基、Ashby培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

淀粉水解培養(yǎng)基：可溶性淀粉2g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L和瓊脂16g/L。

甲基紅培養(yǎng)基：蛋白胨5g/L、葡萄糖5g/L和氯化鈉5g/L。

水瓊脂培養(yǎng)基：8g/L瓊脂。

1.1.3植物營養(yǎng)液配置

母液A：六水合氯化鈷0.004g、硼酸2.86g、四水合氯化錳1.81g、七水合硫酸鋅0.22g、五水合硫酸銅0.102g、二水合鉬酸納0.122g溶于1L蒸餾水；母液B：七水合硫酸鎂49.296g溶于IL蒸餾水；母液C：磷酸氫二鉀174.18g、磷酸二氫鉀136.886g溶于1L蒸餾水；母液D：二水合氯化鈣110.99g溶于1L蒸餾水；母液E：三水合檸檬酸鐵5g溶于1L蒸餾水。1L蒸餾水中加入上述5種母液各1mL、硫酸銨0.66g，可得常規(guī)植物營養(yǎng)液。鹽堿脅迫植物營養(yǎng)液在常規(guī)植物營養(yǎng)液基礎(chǔ)上加入氯化鈉11.7g，并用16g/L碳酸鈉溶液調(diào)至pH=8.5。

1.1.4試驗(yàn)儀器LHS-130L-3三溫區(qū)恒溫恒濕箱；TGL-20M高速冷凍離心機(jī)；UV-1000天美紫外可見分光光度計(jì)；JLRX-800B-FB植物培養(yǎng)箱。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1S4菌分離純化與形態(tài)特征觀察將用25%甘油保存在超低溫冰箱的S4菌接種于TSA培養(yǎng)基，28℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)2d，觀察菌落形狀、顏色、大小、質(zhì)地、邊緣結(jié)構(gòu)、隆起程度等特性。對(duì)S4菌進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡油鏡下（放大倍數(shù)10x100）對(duì)S4菌顏色及形狀、大小進(jìn)行觀察。

1.2.2S4菌生理生化與促生性能測定共9項(xiàng)：

（1）生理生化指標(biāo)測定：用青島海博生物技術(shù)有限公司的細(xì)菌微量鑒定管進(jìn)行相關(guān)鑒定。

（2）解鉀能力測定：將S4菌接種于硅酸鹽培養(yǎng)基中，28℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)12～36h，觀察菌落形狀，呈現(xiàn)油滴狀則具有解鉀能力，否則不具備解鉀能力。

（3）解有機(jī)磷能力測定：將S4菌接種到有機(jī)磷培養(yǎng)基中．37℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)2d，觀察有機(jī)磷培養(yǎng)基變化。如菌落周圍變?yōu)橥该?，則說明有解有機(jī)磷能力，否則無此能力。

（4）解無機(jī)磷能力測定：將S4菌接種到無機(jī)磷培養(yǎng)基中，37℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)2d，觀察培養(yǎng)基變化。菌落周圍變透明，說明有溶無機(jī)磷能力，否則無溶無機(jī)磷能力。

（5）解淀粉能力測定：將S4菌接種到淀粉水解培養(yǎng)基上，38℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)1d。在S4菌附近加入碘液，觀察菌落附近是否變透明，透明則說明S4菌有解淀粉能力，否則無此能力。

（6）甲基紅試驗(yàn)：將S4菌接種到甲基紅培養(yǎng)基中，36℃、200r/min振蕩培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后，添加甲基紅試劑。培養(yǎng)基變紅為陽性，變黃為陰性。

（7）分泌IAA能力測定：將S4菌接種到R，A培養(yǎng)基（添加L-色氨酸）中，280C、150 r/min振蕩培養(yǎng)48h。吸取100L菌液到白瓷板，以100LIAA標(biāo)準(zhǔn)液（50mg/L）作空白對(duì)照，加入等量Salkowski比色液，隨后將白瓷板放人25℃無光培養(yǎng)箱30min，取出后對(duì)顏色進(jìn)行判別，如果為紅色說明S4菌可以產(chǎn)IAA，否則無此能力。

（8）分泌鐵載體能力測定：將S4菌接種于CAS培養(yǎng)基中，37℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)72h后觀察培養(yǎng)基變化。如果S4菌附近為黃色，說明可以分泌鐵載體，否則無此能力。

（9）固氮能力測定：將S4菌接種于Ashby培養(yǎng)基中，37℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)72h后觀察是否出現(xiàn)菌落，有菌落出現(xiàn)則具有固氮能力，否則無此能力。

1.2.3S4菌16S rRNA測序S4菌16SrRNA序列測定由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成，將測序序列通過NCBI網(wǎng)站完成BLAST分析，并利用MEGA6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.4S4菌抗鹽堿能力測定將S4菌分別接種于不同NaCl濃度梯度（0、1%、2%、3%、4%．5%、6%、7%、8%）的TSA培養(yǎng)基中與用HCI、NaOH調(diào)節(jié)為不同pH梯度（4、5、6、7、8、9、10、11）的TSA培養(yǎng)基中．37℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)48h后觀察S4菌生長狀況，測定其耐鹽與耐堿能力。

1.2.5水稻水培試驗(yàn)及其抗逆指標(biāo)測定試驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)處理?？瞻讓?duì)照組（CKO）：無S4菌浸種，常規(guī)植物營養(yǎng)液；鹽堿對(duì)照組（CK1）：無S4菌浸種，鹽堿脅迫植物營養(yǎng)液；CKO+S4菌組：S4菌浸種，常規(guī)植物營養(yǎng)液；CKl+S4菌組：S4菌浸種，鹽堿脅迫植物營養(yǎng)液（S4菌浸種方法為lx108cfu/mL菌懸液浸種）。將水稻種子在55℃水浴鍋中浸種15min，用酒精去除表面張力10s，0.1%升汞表面消毒30s，無菌水清洗6次，消毒完成后對(duì)種子進(jìn)行不同處理。將不同處理種子擺放于水瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行暗處理，待其發(fā)芽后移到滅菌的480mL塑料瓶（塑料瓶中有300g石子、60mL不同處理的植物營養(yǎng)液）中，放人植物光照培養(yǎng)箱（濕度35%，設(shè)置6個(gè)時(shí)段，即時(shí)段1：時(shí)間4h、溫度25℃、光照10000lx;時(shí)段2：時(shí)間3h、溫度20℃、光照5000lx;時(shí)段3：時(shí)間8h、溫度18℃．光照01x;時(shí)段4：時(shí)間2h、溫度20℃、光照50001x;時(shí)段5：時(shí)間3h、溫度25℃、光照9000lx;時(shí)段6：時(shí)間4h、溫度28℃、光照13000lx）培養(yǎng)14d后用尺子測量不同處理下水稻根長、株高。將樣品液氮保存后存放于-80℃超低溫冰箱，根和葉的抗逆指標(biāo)使用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的試劑盒進(jìn)行測定。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

使用Microsoft Excel 2019和SPSS 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和顯著性差異分析，使用GraphPadPrism 8做圖。

2結(jié)果與分析

2.1S4菌菌落形態(tài)特征

S4菌在TSA培養(yǎng)基上的菌落呈乳白色，切面隆起，表面光滑，邊緣完整或波紋狀，不透明，粘稠度較高，易挑起（圖1A）。顯微鏡油鏡下（放大倍數(shù)10x100）觀測到染色結(jié)果為紫色，形狀為桿狀，判定為桿狀的革蘭氏陽性菌（圖IB）。

2.2S4菌生理生化特性與促生能力

S4菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表1。葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖、棉子糖、半乳糖、山梨醇、衛(wèi)矛醇半固體、水楊苷在糖醇類發(fā)酵試驗(yàn)中測定結(jié)果為陽性（顏色變?yōu)辄S色）；蔗糖、麥芽糖、鼠李糖、D-纖維二糖測定結(jié)果為陰性（顏色未變?yōu)辄S色）。硫化氫生化管無黑色生成，ONPG為無色，VP試驗(yàn)為黃色，鳥氨酸、賴氨酸脫羧酶測定結(jié)果為陰性（黃色），色氨酸也為陰性（無色）。

促生能力測定結(jié)果表明，淀粉水解能力的測定結(jié)果呈陰性，培養(yǎng)基未變透明：解鉀能力測定結(jié)果呈陽性：S4菌產(chǎn)IAA，加入比色液避光處理后呈現(xiàn)紅色；有機(jī)磷、無機(jī)磷培養(yǎng)基上S4菌周圍出現(xiàn)透明，呈陽性：CAS培養(yǎng)基上，S4菌周圍有黃褐色產(chǎn)生，呈陽性，有產(chǎn)鐵載體能力；Ashby培養(yǎng)基上無菌落出現(xiàn)，不具有固氮能力：甲基紅試驗(yàn)結(jié)果為亮黃色，呈陰性。綜上，S4菌具備解磷、解鉀、產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體能力，屬于典型的PGPR，有助于植物生長，改變周圍土壤環(huán)境。

2.3S4菌的分子生物學(xué)鑒定

將序列信息輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析，選取6株與S4菌相似程度超過98%的模式菌株，用MEGA 6完成S4菌的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。由圖2可知，S4菌與人參地微桿菌（Microbacteri-um gznsengiterrae）聚為一支，結(jié)合形態(tài)特征，確定S4菌為M. ginsengiterrae。

2.4S4菌抗鹽堿能力

S4菌在0～7% NaCl濃度的TSA平板上可以生長，NaCl濃度超過50%時(shí)長勢(shì)減弱，濃度為7%時(shí)菌落生長狀況較差，需借助光源觀察菌落，濃度超過7%時(shí)不能生長（圖3）；S4菌在pH為4—10的平板上可以生長，但在pH=10的平板上長勢(shì)較弱，pH=11時(shí)S4菌不能生長（圖4）。

2.5S4茵對(duì)水稻耐鹽堿的促生作用

14 d時(shí)水稻生長情況見圖5。與CKO相比，CKO+S4組根長提高1.1%，無顯著性差異（P>0.05）；CKI+S4組根長較CKI顯著提高163.0%（P<0.05），說明在鹽堿脅迫下S4菌浸種對(duì)根長有顯著促進(jìn)作用。與CKO相比，CKO+S4組株高提高10.8%，無顯著性差異（P>0.05）；CK1+S4組株高較CK1顯著提高66.1%（ P<0.05），說明在鹽堿脅迫下S4菌浸種對(duì)水稻株高有顯著促進(jìn)作用。

SOD、POD、CAT都是重要的抗氧化酶，可以使H202分解，降低ROS對(duì)植物的毒害作用。由圖6可知，與CKO相比，CK1、CK1+S4水稻地上部分與地下部分的抗氧化酶活性均顯著升高（P<0.05）；CKO+S4相較于CKO的水稻抗氧化酶活性除SOD在地下部分有顯著提升外（P<0.05），其余抗氧化酶活性無論是地上部分還是地下部分均無顯著變化（P>0.05）；與CK1相比，CK1+S4地下部分的SOD、CAT、POD分別顯著提高23.1%、16.9%、15.6%，地上部分分別顯著提高36.7%、8.1%、13.6%。

通過脯氨酸（Pro）含量可以判斷鹽堿脅迫對(duì)水稻的傷害程度以及對(duì)鹽堿脅迫的抵抗能力，可溶性糖（SS）和可溶性蛋白（SP）均起著穩(wěn)定植物細(xì)胞滲透壓的作用，反映植物受到鹽堿脅迫的程度。本試驗(yàn)SP含量以Cpr（樣本蛋白濃度）表現(xiàn)，S4菌對(duì)水稻Pro、SS、SP的影響結(jié)果如圖7所示。與CKO相比，CK1地下、地上部分Pro、SS、SP含量均顯著提高（P<0.05）；CKO+S4相較于CKO，水稻地上部分Pro含量顯著升高（P<0.05），地下部分SS含量顯著下降（P<0.05），其余含量均無明顯變化（P>0.05）；CK1+S4相較于CK1，水稻地下、地上部分Pro含量顯著升高33.3%、36.5%，地下部分SS、SP含量顯著降低55.9%、19.2%，地上部分SS、SP含量顯著降低22.9%、18.5%。

MDA作為最終過氧化產(chǎn)物之一，它的積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷、植物衰老，是反映植物抗逆能力的重要指標(biāo)。CK1相較于CKO，地下、地上部分的MDA含量顯著增加（P<0.05）；CKO與CKO+S4的MDA含量無顯著差異（P>0.05）；CK1+S4相較于CK1，水稻地下、地上部分MDA含量顯著降低55.5%、46.2%（P<0.05）.

3討論與結(jié)論

本試驗(yàn)將水稻耐鹽堿促生菌S4鑒定為人參地微桿菌，并對(duì)S4菌生理生化特性、促生能力及在鹽堿下的水稻生長狀況進(jìn)行測定。結(jié)果表明，S4菌擁有解有機(jī)磷、解無機(jī)磷、解鉀、分泌鐵載體和IAA的促生性能，并可在重度鹽堿環(huán)境下生長，是擁有多種促生功能的耐鹽堿PGPR菌株。大部分促生菌促生功能較為單一并且在鹽堿條件下停止生長，目前對(duì)人參地微桿菌可以同時(shí)提高植物耐鹽與耐堿能力菌株的研究鮮有報(bào)道，大部分菌株只具有提高植物耐鹽能力。

鹽堿脅迫造成植物體內(nèi)活性氧過量與MDA積累，為了減少這些傷害，植物會(huì)產(chǎn)生SOD、CAT、POD等抗氧化酶來清除過量的活性氧，積累SS、SP和Pro等有關(guān)調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)維持細(xì)胞水勢(shì)正常。大量研究發(fā)現(xiàn)，接種PGPR可以減少鹽脅迫對(duì)植物的危害，促進(jìn)植物生長發(fā)育。本試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽堿脅迫下接種S4菌的水稻相較于未接菌的水稻，地上、地下部分的SOD、POD、CAT活性及Pro含量顯著提高，MDA含量顯著降低，可溶性糖和可溶性蛋白含量與無鹽堿脅迫時(shí)的水平相近，說明S4菌浸種后提高了植株的抗鹽堿能力，降低了鹽堿脅迫對(duì)水稻產(chǎn)生的危害。這與劉鵬等的研究結(jié)果（NaCl脅迫下添加耐鹽菌株可提高水稻幼苗根長、株高以及SOD、POD、CAT活性，降低MDA含量）和袁東關(guān)于植物促生菌對(duì)鹽脅迫下水稻生長影響的研究結(jié)果一致。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，人參地微桿菌S4是可以在重度鹽堿環(huán)境下（NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%、pH=10）生長繁殖，是具有解有機(jī)磷、解無機(jī)磷、解鉀、分泌鐵載體、產(chǎn)IAA的PGPR。S4菌可以促進(jìn)鹽堿脅迫下水稻的生長，提高水稻根長、株高以及地上部分和地下部分的抗氧化酶活性以及Pro含量，降低MDA含量，減少鹽堿脅迫下對(duì)水稻帶來的危害，使SS、SP含量向無鹽堿脅迫時(shí)的水平趨近，提高水稻耐鹽堿能力。本研究初步揭示了S4菌株促生機(jī)理，可為采用微生物方法提高鹽堿地作物產(chǎn)量提供理論依據(jù)。