何翔 張慶 李楚 番華彩 李銘剛 徐勝濤 陳齊斌 楊明英 楊佩文

摘要 絕大多數病原菌可分泌鐵載體，利用螯合性鐵載體及病原菌對Fe3+的競爭可實現(xiàn)病害的有效防控。從植物病原菌中篩選高產鐵載體的優(yōu)勢菌株，并基于EDTA對鐵離子的強螯合性，可為病害防控提供新的方法。本研究采用CAS檢測法和光吸收法對42株供試植物病原菌株進行定性、定量篩選及鐵載體類型的初步鑒定，依據菌株形態(tài)電鏡觀察和分子生物學技術對優(yōu)勢菌株進行分類鑒定，并基于微量稀釋法測定EDTA對優(yōu)勢菌株的最低抑菌濃度。經定性、定量篩選，確定7株供試細菌為高產鐵載體優(yōu)勢菌株，分泌鐵載體類型為兒茶酚型和異羥肟酸型;根據形態(tài)特征觀察和分子生物學鑒定，菌株TZT-057和TZT-058與惡臭假單胞菌Pseudomonas putida的一致性最高，TZT-059、TZT-063和TZT-064與肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae的一致性最高，TZT-062、TZT-073分別與魯氏不動桿菌Acinetobacter lwoffii、迪克氏菌Dickeya zeae的一致性最高。根據微量稀釋法抑菌活性測定結果可知，EDTA對菌株TZT-058、TZT-073的抑菌效果較好，抑菌率分別為85.16%、80.08%，表明強螯合劑EDTA能有效干預病原細菌對鐵元素的攝取過程，進而影響其生長繁殖。

關鍵詞 植物病原菌; 鐵載體; 篩選鑒定; 乙二胺四乙酸

中圖分類號： S 476

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019131

Abstract

Most pathogenic microorganisms have the function of secreting siderophore， and the competition between sorghum siderophore and pathogens against Fe3+ can be used to effectively prevent and control diseases. The dominant strains producing high-yield siderophore were screened from plant pathogens， and based on the strong chelating property of EDTA to iron， it could provide a new method for the control of plant diseases. In this study， we qualitatively and quantitatively screen the pathogenic strains of different host plants and preliminarily identified the siderophore types by using the CAS method and light absorption method. Meanwhile， the biological identification of the dominant strains was performed by using the electron microscopy and 16S rDNA sequence. The minimum inhibitory concentration of EDTA against dominant strains was determined based on the microdilution method. The results showed that there were 7 strains that were identified as high siderophore-producing dominant strains from the test bacteria through qualitative and quantitative screening， and the types of secretory siderophore were catecholates and hydroxamates. Base on the morphological characteristics and molecular identification， the strains TZT-057 and TZT-058 shared similarity with Pseudomonas putida; the strains TZT-059， TZT-063 and TZT-064 were very similar to Klebsiella pneumoniae; the strain TZT-062 was analogous to Acinetobacter lwoffii， and strain TZT-073 resembled Dickeya zeae. According to the microbial dilution assay， EDTA had better antibacterial activity against strains TZT-058 and TZT-073， and the inhibition rates were 85.16% and 80.08%， respectively. The results suggested that EDTA could effectively affect the uptake process of iron by pathogenic bacteria， and affect its growth and reproduction.

Key words

plant pathogen; siderophore; screening and identification; EDTA

鐵在地殼和土壤中的含量十分豐富，同時鐵作為地球上幾乎所有生物體必需的營養(yǎng)元素之一，在各項機能代謝活動和酶促反應中發(fā)揮著重要作用;但在自然界中性或堿性有氧條件下，鐵主要以難溶的Fe3+化合物形式存在，可溶性Fe2+含量較匱乏，生物可利用率極低[13]。農業(yè)生產中植株缺鐵現(xiàn)象較為普遍，給農林作物生物量的生產和植株系統(tǒng)抗性造成極大的影響。為適應高氧低鐵的脅迫環(huán)境，許多微生物自身誘導合成分泌一類與Fe3+具高親和性且能與其特異性螯合的小分子次級代謝產物—鐵載體，用以螯合宿主體內或周圍環(huán)境中大量難溶性的鐵，并通過氧化還原反應將其轉化為可溶性的鐵，為生物體提供充足的鐵元素，同時也能有效減少環(huán)境中病原菌可利用鐵的含量而降低其致病力，增強植株抗性[45]。

關于鐵載體的研究早在1950年前后就有報道，根據鐵載體官能團和中心結構的多樣性，可分為兒茶酚型（catecholates）、異羥肟酸型（hydroxamates）和羧酸鹽型（carboxylates）[67]。相較于其他微生物次級代謝產物，關于植物病原菌分泌鐵載體的研究還較少[89]。目前，有關植物根際促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria， PGPR）、植物內生菌（endophyte）等微生物分泌鐵載體的研究較多，且主要為鐵載體產生菌初步分離篩選的研究[1012]。而有關植物病原菌分泌鐵載體的研究，目前國內外的報道還較少。乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid， EDTA）是一種重要的強螯合劑，能與環(huán)境中的堿金屬、稀土元素和過渡金屬等形成穩(wěn)定且水溶性較好的螯合物。微生物純培養(yǎng)環(huán)境中，EDTA的外源添加能介導微生物對必需金屬元素的吸收利用，進而影響其生長繁殖。因此對鐵載體產生菌進行相關研究，充分利用具分泌鐵載體功能的植物病原菌菌種資源，并測定抑菌藥物對其的最低抑菌濃度（MIC），探索分泌型鐵載體在植物病害防治中的作用機制具有重要的研究前景和補充意義。

為挖掘更多的微生物資源，本研究采用CAS檢測法和光吸收法，從不同宿主植物病原細菌中篩選高產鐵載體的優(yōu)勢菌株，并基于微量稀釋法測定EDTA對其最低抑菌濃度（MIC），以期為具分泌鐵載體能力的植物病原菌菌種資源的研究、開發(fā)和應用提供一定的理論依據和數據支撐。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

42株供試植物病原細菌均為云南省農業(yè)科學院農業(yè)環(huán)境資源研究所保藏菌種（表1）。

1.2 供試溶液及培養(yǎng)基的制備

CAS檢測液：稱取0.060 5 g鉻天青S（chromeazurol S， CAS）溶于50 mL去離子水中，并加入10 mL FeCl3溶液（1 mmol/L FeCl3·6H2O+10 mmol/L HCl）攪拌混勻，標記為“A液”;再稱取0.072 9 g十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide， HDTMA）溶于40 mL去離子水，標記為“B液”;最后將A液緩慢倒入B液中，并攪拌均勻。

TTC顯色劑的制備：稱取1.0 g氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride， TTC）溶于10 mL去離子水中，用0.22 μm無菌濾膜過濾后轉入無菌EP管中保存?zhèn)溆?，得?.1 g/mL 的無菌TTC溶液。

EDTA藥液的制備：稱取40 mg EDTA溶于2 mL去離子水中，并用0.22 μm無菌濾膜過濾后轉入無菌EP管中保存?zhèn)溆茫玫?0 mg/mL的無菌測試母液。

醋酸鹽緩沖液的配制：將847 mL 0.1 μmol/L的H3COOH溶液加入到容量瓶內，并加0.1 μmol/L的CH3COONa溶液，定容至1 000 mL，蓋緊瓶塞振蕩混勻。

供試菌株菌懸液的制備：無菌條件下，在供試菌株斜面內加入2 mL無菌去離子水并刮取菌苔，轉入無菌EP管中保存?zhèn)溆?吸取一定量的菌液于無菌試管內，加入無菌去離子水稀釋，采用麥氏比濁法測定待測液的OD625，使稀釋后的待測液OD625介于0.098 0～0.220 9之間。

無鐵查氏液體培養(yǎng)基：葡萄糖30.0 g/L、硝酸鈉2.0 g/L、三水合磷酸鉀1.0 g/L、氯化鉀0.5 g/L、七水合硫酸鎂0.5 g/L、8-羥基喹啉0.75 g/L、去離子水1.0 L。

LB去鐵液體培養(yǎng)基：酵母提取物5.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、8-羥基喹啉0.75 g/L、去離子水1.0 L，pH自然（固體斜面培養(yǎng)基添加瓊脂，15～20 g/L）。

TTC-LB液體培養(yǎng)基：40 mL常規(guī)無菌LB液體培養(yǎng)基中加入2.0 mL 0.1g/mL TTC溶液，混勻后密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分泌型鐵載體產生菌定性初篩和定量復篩

從LB固體斜面培養(yǎng)基上活化的細菌中挑取單菌落接種至LB去鐵液體培養(yǎng)基內，每株菌株3個重復，置于28℃微生物培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2～3 d，當液體培養(yǎng)基表面出現(xiàn)渾濁時，吸取50 μL發(fā)酵培養(yǎng)液于96孔板內，加入等體積CAS檢測液充分混勻，以飽和的EDTA溶液（與CAS檢測液反應呈紅色）為陽性對照，未接種的培養(yǎng)液與CAS檢測液等體積混合作為陰性對照，觀察并記錄顏色變?yōu)榧t色、橙紅色的培養(yǎng)液，并將相應菌株作為復篩菌株。

初篩入選的菌株用無鐵查氏液體培養(yǎng)基于28℃ 150 r/min的恒溫搖床（型號：HS-200B）上培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結束后吸取2～5 mL培養(yǎng)液用0.22 μm無菌濾膜過濾后加入等體積的CAS檢測液，靜置1 h后用全波長酶標儀（型號：Multiska GO）測定其OD630（記作“As”），用相同方法測定未接菌的液體培養(yǎng)基的OD630作為參比值（記作“Ar”）。鐵載體的濃度用鐵載體活性單位（siderophore unit， SU）表示，SU=[（Ar-As）/Ar]×100%，測定重復3次，取平均值進行比較分析。

1.4 復篩菌株鐵載體的化學結構初步鑒定

1.4.1 異羥肟酸型鐵載體

采用氯化鐵檢測法（FeCl3 test）鑒定：1 mL培養(yǎng)濾液中加入1 mL 2% FeCl3溶液，出現(xiàn)紅色或紫色表明測試樣品中含有鐵載體物質。用紫外分光光度計檢測，在420～450 nm 之間出現(xiàn)吸收峰則說明螯合物為異羥肟酸型鐵載體。

1.4.2 兒茶酚型鐵載體

采用氯化鐵檢測法鑒定：1 mL培養(yǎng)濾液中加入1 mL 2% FeCl3溶液，用紫外分光光度計檢測，如果在495 nm附近出現(xiàn)吸收峰則說明螯合物為兒茶酚型鐵載體。

1.4.3 羧酸型鐵載體

采用分光光度法鑒定：1 mL培養(yǎng)濾液中加入1 mL 0.25 μmol/L CuSO4溶液和2 mL pH4.0的醋酸鹽緩沖液，用紫外分光光度計檢測，在190～280 nm之間出現(xiàn)吸收峰則說明螯合物為羧酸型鐵載體。

1.5 菌株16S rDNA擴增測序、序列分析及菌落形態(tài)電鏡觀察

分泌型鐵載體產生菌菌株的16S rDNA擴增測序參照王麗麗等[13]的方法。測序結果經BLAST 搜索（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）后與 GenBank數據庫中相關種屬的基因序列進行比較分析，選用同源性較高的模式菌株序列作為參比對象，用Clustal X 1.8軟件進行多序列比對，計算供試菌株與參比菌株序列的相似性。系統(tǒng)發(fā)育分析時排除堿基缺失位點，采用鄰接法（neighbor-joining analysis）用MEGA 7構建供試菌株與參比菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育樹。其中，Bootstrap值設定為1 000，其余均為默認值。分泌型鐵載體產生菌菌落形態(tài)掃描電鏡觀察參照侯旭等[14]的方法。

1.6 EDTA對分泌型鐵載體產生菌生長的影響

1.6.1 定性檢測

采用微量稀釋法進行定性檢測，每菌株各3個重復。分別在96孔板內添加100 μL無菌TTC-LB液體培養(yǎng)基;A1～A12設置為陰性對照，只添加100 μL無菌TTC-LB液體培養(yǎng)基，不添加菌懸液，B1～B12設置為生長對照，添加100 μL無菌TTC-LB液體培養(yǎng)基和100 μL菌懸液;在C1、D1、E1孔內加入100 μL 20 mg/mL的無菌EDTA藥液，并采用倍半稀釋的方法對EDTA藥液進行稀釋，直至最后一孔，此時該三列孔內EDTA的濃度從左往右依次為：10、5、2.5……0.156 25 mg/mL，而后每孔再加入100 μL稀釋好的菌懸液，此時每孔的藥液濃度從左到右依次為：5、2.5、1.25……0.078 1 mg/mL;將96孔板放入30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h，定期觀察并記錄孔板的顏色變化。

1.6.2 定量測定

采用微量稀釋法進行定量測定，每菌株各3重復。分別在96孔板內添加100 μL無菌LB液體培養(yǎng)基;A1～A12設置為陰性對照，只添加100 μL無菌LB液體培養(yǎng)基，不添加菌懸液，B1～B12設置為生長對照，添加100 μL無菌LB液體培養(yǎng)基和100 μL菌懸液;在C1、D1、E1孔內加入100 μL 20 mg/mL的無菌EDTA藥液，并對EDTA藥物進行倍半稀釋直至最后一孔，此時該三列孔內濃度從左往右依次為：10、5、2.5……0.156 25 mg/mL，而后再加入100 μL稀釋好的菌懸液，此時每孔的藥液濃度從左到右依次為：5、2.5、1.25……0.078 1 mg/mL;將96孔板放入30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h，測定每塊板的OD630，并根據公式計算EDTA對供試菌株的抑菌率。測定過程中，藥品組吸光度值與生長對照組區(qū)別不大的孔樣可忽略不計，僅明顯低于對照組的樣品的吸光度值才進行抑制率計算。計算公式如下：

抑制率=（生長對照組吸光度—藥品組吸光度）/生長對照組吸光度×100%。

2 結果與分析

2.1 分泌型鐵載體產生菌的定性初篩和定量復篩

根據CAS檢測液特有的顯色反應，從42株供試細菌中初步篩選出18株有顏色變化的細菌，其中有13株為紅色或橙紅色，5株為紫色（表2），因而可將這18株細菌作為復篩目標菌株。根據18株復篩菌株培養(yǎng)液和CAS檢測液混合后顏色變化的深淺可知，菌株TZT-057、TZT-058、TZT-059、TZT-062、TZT-063、TZT-064和TZT-073與CAS檢測液顯色反應過程較迅速，反應后呈鮮紅色，表明分泌鐵載體的活性最強。因而這7株復篩菌株作為后續(xù)研究對象。

如表3所示，復篩選出的7株優(yōu)勢菌株其As/Ar均小于0.5，且鐵載體活性單位（SU）均大于50.0%，表明所選的7株優(yōu)勢菌株均為高產鐵載體菌株。

2.2 復篩菌株鐵載體類型的鑒定

如表4所示，菌株TZT-059、TZT-062、TZT-063、TZT-064能合成分泌兒茶酚型鐵載體和異羥肟酸型鐵載體，菌株TZT-057、TZT-058和TZT-073只能合成分泌兒茶酚型鐵載體。

2.3 分泌型鐵載體產生菌的分子生物學鑒定

2.3.1 菌株16S rDNA序列分析結果及系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構建

在初步形態(tài)鑒定的基礎上，利用16S rDNA序列PCR擴增通用引物進一步對篩選到的7株高產鐵載體優(yōu)勢菌株進行目標序列的PCR擴增、測序。測序結果在GenBank數據庫中進行相似性搜索，并與同源性較高的典型標準菌株序列進行同源對比，明確菌株的生物學分類地位。

研究結果表明：菌株TZT-059（登錄號：MH922846）、TZT-063（登錄號：MH930397）和TZT-064（登錄號：MH930398）的16S rDNA基因片段分別為1 439、1 441、1 445 bp。其中，菌株TZT-059和肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae（登錄號：MF767577）的相似性達99.73%，TZT-063和肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae（登錄號：KJ803926）的相似性達99.86%，TZT-064和肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae（登錄號：KU937377）的相似性達99.85%，菌株間均具有極高同源性。

如圖1所示，菌株TZT-057（登錄號：MH922842）、TZT-058（登錄號：MH922845）、TZT-062（登錄號：MH930396）和TZT-073（登錄號：MH820116）的16S rDNA基因片段分別為1 397、1 398、1 401 bp和1 351 bp。采用BLAST搜索與GenBank 數據庫中收錄序列比對，選擇有詳細信息的18株標準菌株（type culture strain）作為參比菌株，進行Clustal W多重比對，并構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。菌株TZT-057、TZT-058和P.putida（登錄號：NR114479）間具有極高同源性，初步鑒定為普羅特斯門，γ普羅特斯綱，假單胞菌目，假單胞菌科，假單胞菌屬，惡臭假單胞P.putida。菌株TZT-062和A.lwoffii（登錄號：NR026209）的相似性達99.76%，菌株間具有極高同源性，初步鑒定為變形菌門，γ-變形菌綱，假單胞菌目，莫拉氏菌科，不動桿菌屬，魯氏不動桿菌A.lwoffii。菌株TZT-073和D.zeae（登錄號：NR041923）的相似性達99.81%，菌株間具有極高同源性，初步鑒定為變形菌門，γ-變形菌綱，腸桿菌目，果膠桿菌科，歐文氏菌屬，迪克氏菌Dickeya zeae。

2.3.2 分泌型鐵載體產生菌菌落形態(tài)電鏡觀察

4株產鐵載體優(yōu)勢菌株經掃描電鏡放大21 000倍后其形態(tài)結果如圖2所示。菌株TZT-057為橢圓狀單球菌，直徑0.63～0.75 μm，菌株表面附著一層細且短的菌毛，頂端著生粗且長的絲狀單生鞭毛;菌株TZT-058為長桿狀菌，長2.26 μm，寬0.71 μm，菌株表面附著少量細短的菌毛，頂端著生粗且長的絲狀單生鞭毛;菌株TZT-062呈圓球狀，為雙球菌，直徑0.86～0.88 μm，菌株表面無菌毛，頂端著生略短的單生鞭毛;菌株TZT-073為長桿狀菌，長2.14 μm，寬0.84 μm，菌株表面附著一層細短的菌毛，頂端著生粗且長的絲狀鞭毛。

2.4 EDTA對分泌型鐵載體產生菌生長的影響

根據微量稀釋法對7株優(yōu)勢菌株定性、定量抑菌活性測定結果及判定標準可知，EDTA對菌株TZT-058（Accession no.MH922845）、TZT-073（Accession no.MH820116）有較好的抑菌活性。菌株TZT-058生長對照組吸光度值為0.505 1，藥品組平均吸光度值為0.074 9，根據計算公式，EDTA對菌株TZT-058的抑菌率為85.16%，對應的最低抑菌濃度為0.019 5 mg/mL;菌株TZT-073生長對照組吸光度值為0.296 4，藥品組平均吸光度值為0.059 1，根據計算公式，EDTA對菌株TZT-058的抑菌率為80.08%，對應的最低抑菌濃度為0.312 5 mg/mL。結果表明，當培養(yǎng)環(huán)境中存在強螯合劑EDTA時，其能更有效地干預病原細菌對鐵元素的攝取過程，影響自身的各項機能代謝活動，抑制生長繁殖。

3 討論

EDTA能與鐵離子特異性螯合，且可溶性的鐵離子又在微生物各項機能代謝過程中發(fā)揮著重要作用。前期研究表明，當植物病原菌培養(yǎng)環(huán)境中存在EDTA溶液時，EDTA能利用其較強的螯合能力更有效的競爭環(huán)境中的鐵離子，使病原物處于缺鐵脅迫條件，延緩鐵蛋白復合物的形成，直接影響病原物對鐵離子的吸收利用機制，進而抑制其生長繁殖，起到防控病害的作用。本研究首次以植物病原細菌為篩選靶標，采用CAS檢測法和光吸收法對42株不同宿主植物病原細菌進行產鐵載體活性篩選，并確定7株高產鐵載體的優(yōu)勢菌株。經鐵載體化學結構的初步鑒定，所產鐵載體類型為異羥肟酸型和兒茶酚型。有研究指出，細菌主要合成分泌異羥肟酸型和兒茶酚型鐵載體[15]，本研究結果與之相吻合。此外，比較分析本研究兩種類型鐵載體的鐵螯合能力，兒茶酚型>異羥肟酸型，與Wang等[16]的研究結果一致;此外，本研究篩選到的7株植物病原菌均能分泌兒茶酚型鐵載體，且SU均大于50%。本研究還開展了抑菌藥物EDTA對優(yōu)勢菌株的抑菌活性研究，結果表明EDTA對P.putida和D.zeae均具有較好的抑菌活性。

經分子生物學鑒定，本研究篩選到7株產鐵載體優(yōu)勢菌株均為革蘭氏陰性菌，K.pneumoniae 3株、P.putida 2株、A.lwoffii和D.zeae各1株。目前尚未有關于A.lwoffii和D.zeae分泌鐵載體的研究報道，因而本研究篩選出的這兩株菌株可作為后續(xù)鐵載體相關研究工作的優(yōu)選材料。目前，已有大量關于克雷伯氏菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬和歐文氏菌屬微生物分泌鐵載體的研究報道。肺炎克雷伯氏菌為常見的高產鐵載體微生物，目前國內外學者對其研究較為全面[1012]。假單孢菌屬也是常見的高產鐵載體優(yōu)勢屬，研究者們先后從不同寄主植株或根際土壤中發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌[17]、熒光假單胞菌[18]、惡臭假單胞菌[1921]、棲稻黃色假單胞菌[22]、沼澤紅假單胞菌[23]、草假單胞菌[24]、摩氏假單胞菌[25]、地中海假單胞菌[26]等不同種的微生物均能分泌鐵載體，且主要為兒茶酚型鐵載體。此外，研究者們還從醋酸鈣不動桿菌[27]、鮑曼不動桿菌[28]、溶血不動桿菌[29]、約氏不動桿菌[30]、嗜油不動桿菌[31]和皮氏不動桿菌[32]等不動桿菌屬微生物中篩選到分泌型鐵載體產生菌，并對所產鐵載體的化學結構和形式作了詳細的解析。目前，有關歐文氏菌屬分泌鐵載體的研究還較少，僅發(fā)現(xiàn)胡蘿卜軟腐歐文氏菌[33]、解淀粉歐文氏菌[34]、菊歐文氏菌[35]和草生歐文氏菌[36] 4個種的微生物能分泌合成鐵載體。

本研究從植物病原菌中篩選高產鐵載體的優(yōu)勢菌株，以期解析分泌型鐵載體在植物體內或根際土壤中的響應機制，以及分泌型鐵載體介導的寄主與病原互作機制，為植物病害防治提供新的作用靶點，同時也在生防菌的開發(fā)應用等方面具有重要的實踐意義。

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（責任編輯：田 喆）

收稿日期： 20190317?? 修訂日期： 20190512

基金項目：國家自然科學基金（31600349，31660600，31760019）;國家公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（201503119-03-02）

致? 謝： 參加本試驗部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀燁斌等同學，特此一并致謝。

通信作者?E-mail：398036877@qq.com

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