刁瑞寧 楊莎 張佳蕾 王建國 彭振英 崔利 劉珂珂 李新國 萬書波

關(guān)鍵詞：花生；結(jié)瘤；固氮酶活性；轉(zhuǎn)錄組學(xué)；代謝組學(xué)

花生作為一種重要的油料作物，在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)廣泛種植。近年來，為了確保花生高產(chǎn)，農(nóng)民在生產(chǎn)過程中往往過量施用氮肥，導(dǎo)致氮肥供應(yīng)與作物需求嚴(yán)重不同步，不僅造成資源浪費(fèi)，而且污染環(huán)境，嚴(yán)重威脅我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。

氮素是作物生長發(fā)育必需的三大營養(yǎng)元素之一，與作物的產(chǎn)量和品質(zhì)密切相關(guān)。豆科作物通過與土壤根瘤菌相互作用形成一個(gè)特殊器官——根瘤，表現(xiàn)出較強(qiáng)的固氮能力，對(duì)其生長和產(chǎn)量形成至關(guān)重要，也是可持續(xù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的有效氮源。然而，豆科作物的生物固氮受土壤中氮素有效性的嚴(yán)格調(diào)控，當(dāng)?shù)剡^多時(shí)對(duì)結(jié)瘤和固氮具有強(qiáng)烈的抑制作用，形成“氮阻遏”效應(yīng)。

氮素對(duì)豆科作物結(jié)瘤固氮的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過程。結(jié)瘤是一個(gè)耗能的過程，過多的根瘤同樣不利于作物生長發(fā)育，因此豆科作物通過AON（autoregulation of nodulation）途徑負(fù)反饋調(diào)節(jié)根瘤數(shù)量，減少能量消耗，維持碳氮平衡，而氮素可以通過AON途徑抑制豆科作物結(jié)瘤。研究表明，氮素供給促進(jìn)了豆科作物根系生長及對(duì)氮的吸收和同化，增加了碳消耗，因此減少了光合同化產(chǎn)物向根瘤的分配，從而抑制了根瘤生長發(fā)育及固氮酶活性。根瘤的硝酸鹽代謝也是硝態(tài)氮抑制根瘤固氮的重要原因。研究表明，硝態(tài)氮能提高根瘤中硝酸還原酶和亞硝酸還原酶活性，硝酸還原酶能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽并在胞質(zhì)中積累，而亞硝酸鹽是類菌體固氮酶活性的抑制劑，因此積累的亞硝酸鹽會(huì)直接抑制固氮酶活性；Stephens等研究也認(rèn)為添加KNO3或KNO2明顯抑制根瘤的固氮酶活性。

目前在氮素調(diào)控豆科作物結(jié)瘤和固氮的分子機(jī)制方面已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但大多數(shù)研究是以大豆、百脈根、蒺藜、苜蓿等模式作物為試驗(yàn)材料，關(guān)于花生的研究較少，而且不同的豆科作物中調(diào)控結(jié)瘤固氮的分子機(jī)制存在差異，因此本試驗(yàn)開展關(guān)于氮素調(diào)控花生結(jié)瘤固氮機(jī)理的研究，以期為高效利用花生生物固氮體系提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

試驗(yàn)于2019-2020年在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飲馬泉試驗(yàn)基地進(jìn)行，供試花生品種為花育22號(hào)。采用盆栽試驗(yàn)，花盆規(guī)格為高30cm、直徑25cm，栽培基質(zhì)為石英砂與蛭石按3：1（體積比）比例混合。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)CK（不施氮）和N（施純氮90kg/hm2）兩個(gè)處理，每個(gè)處理30盆，隨機(jī)排列，重復(fù)3次?；ㄉ?月10日播種，播種前用活性良好的根瘤菌菌液拌種，每盆播3穴，每穴1粒，出苗后選留2株壯苗；施底肥，氮肥按試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每盆施尿素1.74g，其他肥料按Ca0 150kg/hm2、P 180 kg/hm2、K180kg/hm2施用，每盆分別施Ca0 1.33g、KH2P044.62g。所有盆栽均放在可移動(dòng)大棚下進(jìn)行避雨，定期定量澆水。

1.3測定指標(biāo)與方法

1.3.1根瘤數(shù)量統(tǒng)計(jì)出苗后35天取樣，每個(gè)處理隨機(jī)取樣5盆。將取樣植株根系清洗干凈，統(tǒng)計(jì)每株花生的根瘤數(shù)量。

1.3.2固氮酶活性測定出苗后35天取樣，每個(gè)處理隨機(jī)取3盆花生。將根瘤摘下洗干凈并擦干表面水分，裝入廣口瓶并蓋上帶孔的膠塞，連接好玻璃導(dǎo)管及橡膠導(dǎo)管，密封；用注射器從密閉的廣口瓶中抽出10mL空氣，然后注入10mL乙炔氣體，室溫放置2h;抽取混合氣體，用氣象色譜儀測定乙烯峰面積，固氮酶活性用每克根瘤每小時(shí)產(chǎn)生的乙烯量（nmol）表示。

1.3.3轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

出苗后35天取樣，每個(gè)處理隨機(jī)取樣3盆。取樣后將根系用蒸餾水沖洗干凈，擦干水分，剪碎混勻后用錫箔紙包好，迅速放人液氮。利用TRIzol法提取RNA，經(jīng)過質(zhì)量檢測后利用試劑盒（NEBNext⑧UltrarM RNA Li-brary Prep Kit for Illumina，NEB，美國）進(jìn)行文庫構(gòu)建，主要步驟參考說明書。建好的文庫應(yīng)用Il一lumina HiSeq平臺(tái)進(jìn)行測序，整個(gè)測序過程由武漢邁特維爾生物科技有限公司完成。

高通量測序后的原始序列經(jīng)過過濾、篩選，獲得可以用于后續(xù)分析的Clean Reads。利用HI-SAT2將Clean Reads與四倍體栽培花生參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，然后以log2FC≥1且FDR<0.05為條件對(duì)獲得的基因進(jìn)行篩選，得到差異表達(dá)基因。參照GO（Gene Ontology）數(shù)據(jù)庫將差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋分類，參考KEGG（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析差異表達(dá)基因參與的代謝途徑。

1.3.4代謝組學(xué)分析代謝組學(xué)分析材料同轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序材料，測序分析由武漢邁特維爾生物科技有限公司完成。將花育22號(hào)根系（含根瘤）粉碎并研磨至粉末狀，稱取100mg溶解于1.2mL70%甲醇提取液中，放人4℃冰箱過夜，離心（轉(zhuǎn)速12000r/min，10min）后取上清液，過0.22um微孔濾膜，用超高效液相色譜（UPLC）和串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）分析儀檢測代謝物，然后基于MWDB（Metware Database），根據(jù)二級(jí)譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性，并利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜的多反應(yīng)檢測（multi-ple reaction monitoring，MRM）模式進(jìn)行定量分析。利用軟件Analyst 1.6.3處理得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，用MultiaQuant軟件進(jìn)行色譜峰的積分和校正；然后進(jìn)行主成分分析和聚類分析，再以VIP≥1、log2FC≥1為條件篩選出差異代謝物，其中VIP為變量重要性投影（variable importance in projec-tion）。最終利用KEGG數(shù)據(jù)庫和GO數(shù)據(jù)庫對(duì)差異代謝物進(jìn)行注釋，獲得代謝物參與的代謝路徑。

1.3.5qRT-PCR驗(yàn)證取1.3.3中提取的RNA，利用試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行定量PCR試驗(yàn)。每個(gè)樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。所用引物如表1所示。PCR反應(yīng)體系：SYBR Green MasterMix10uL，引物F、R各0.5uL，cDNAluL，用RNase Free H20補(bǔ)至20uL。具體操作按照熒光定量PCR說明書進(jìn)行。以actin作為內(nèi)參基因，采用2-△△法對(duì)qRT-PCR結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，用t—test對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

1.3.6生長素類化合物含量測定出苗后35天取樣，每個(gè)處理隨機(jī)取樣3盆。取樣后將根系用蒸餾水沖洗干凈，擦干水分，剪碎混勻后用錫箔紙包好，迅速放人液氮速凍。由武漢邁特維爾生物科技有限公司（http：//www. metware. cn/）基于LC-MS/MS平臺(tái)對(duì)樣品進(jìn)行生長素類化合物含量的測定。

1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

基因相對(duì)表達(dá)量、根瘤數(shù)與固氮酶活性數(shù)據(jù)用SPSS22.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，用Microsoft Excel2016軟件制圖。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

經(jīng)分析（表2）發(fā)現(xiàn)，每個(gè)樣品產(chǎn)生44. 03～52.29M的Raw Reads，去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)后得到42.32～51.19M的Clean Reads，GC含量在43.87%～44.29%之間，沒有AT/GC分離現(xiàn)象，Q20和Q30的堿基比分別達(dá)到97%和93%以上，充分證明樣本測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量較好。將得到的Clean Reads進(jìn)一步與栽培花生基因組進(jìn)行比對(duì)，質(zhì)控后的測序數(shù)據(jù)中94%以上的序列可以比對(duì)到參考基因組中，79%以上的序列被定位到唯一的區(qū)域，由此說明，測序數(shù)據(jù)的比對(duì)效果較好，可以進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2樣本間基因表達(dá)差異分析

本試驗(yàn)中，以log2FC≥1且FDR<0.05為條件篩選對(duì)照（CK）和氮處理（N）中的基因，如圖1A所示。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，共獲得3123個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)的有1538個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有1585個(gè)（圖1B）。

經(jīng)具體分析，從中篩選出13個(gè)與氮調(diào)控花生結(jié)瘤固氮相關(guān)的基因（表3），包括編碼生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（生長素應(yīng)答因子）、鳥氨酸脫羧酶、天冬酰胺合成酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶以及蘋果酸脫氫酶等基因：施氮后，2個(gè)編碼生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因、2個(gè)鳥氨酸脫羧酶基因、2個(gè)天冬酰胺合成酶基因上調(diào)表達(dá)，其余7個(gè)基因均下調(diào)表達(dá)。

2.3轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組信息的可信度，隨機(jī)選取6個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果（圖2）顯示，N處理后LOC112715771上調(diào)表達(dá)，其余5個(gè)基因均下調(diào)表達(dá)，與RNA-seq分析結(jié)果一致，證明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠。

2.4差異表達(dá)基因GO功能注釋和KEGG富集分析

對(duì)得到的差異基因進(jìn)行GO功能注釋，可以闡明樣本差異在基因功能上的體現(xiàn)。本試驗(yàn)對(duì)CK與N處理中的差異基因進(jìn)行GO功能注釋，可以從宏觀上展示花生根部響應(yīng)氮素處理的基因的功能分布特征。基于前期篩選出來的差異基因，選取了富集分析結(jié)果中q value最低的50個(gè)GO-Term，繪制富集條目直方圖（圖3）。差異基因的功能注釋為3大類：生物過程（biologicalprocess）、細(xì)胞組成（cellular component）和分子功能（molecular function）。N處理中的差異基因主要參與的生物過程有：細(xì)胞過程（cellularprocess）、代謝過程（metabolic process）、對(duì)刺激的響應(yīng)（response to stimulus）、生物調(diào)節(jié)（biologicalregulation）等；在細(xì)胞組成中，差異基因主要富集在細(xì)胞組分（cell part）、細(xì)胞器（organelle）等；在分子功能中，催化活性（catalytic activity）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性（transcription regulator activity）等所占比例較高。

生物體內(nèi)的不同基因產(chǎn)物通過相互作用行使生物學(xué)功能，對(duì)差異表達(dá)基因的通路注釋分析有助于進(jìn)一步解讀基因的功能，因此，本研究對(duì)CK與N處理的差異基因進(jìn)行了KEGG通路富集分析。我們選取了差異表達(dá)基因富集的前20條KEGG通路進(jìn)行展示，從圖4可以看出，N處理中差異基因富集的主要通路有次生代謝物的生物合成（biosynthesis ofsecondary metabolites）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（plant hor-mone signal transduction）、苯丙素的生物合成（pheny-lpropanoid biosynthesis） .MAPK信號(hào)途徑（MAPK sig-naling pathway-plant）、甘油磷脂代謝（glycerophospho-lipid metabolism）、氮代謝（nitrogen metabolism）等。

2.5樣本中差異代謝物的篩選

本試驗(yàn)以log2FC≥1且VIP≥1為條件，對(duì)CK與N處理中檢測到的代謝物進(jìn)行篩選，得到201種差異代謝物，其中87種代謝物下調(diào)，114種代謝物上調(diào)。這些差異代謝物中有32種氨基酸及其衍生物（amino acids and derivatives）、24種酚酸（phenolic acids）、10種核苷酸及其衍生物（nu-cleotides

and

derivatives）、40種黃酮類（fla-vonoids）、2種醌類（quinones）、7種木脂素和香豆素（lignans

and coumarins）、27種其他類（others）、1種鞣質(zhì)（tannins）、14種生物堿（alkaloids）、4種萜類（terpenoids）、11種有機(jī)酸（organic acids）、29種脂質(zhì)（lipids），其中，黃酮類代謝物所占比重最高，約為19.9%，除2種代謝物下調(diào)外，38種黃酮類代謝物上調(diào)（圖5）。綜上所述，氮處理后，黃酮、氨基酸、酚酸、木脂素和香豆素等代謝物在花生根和根瘤中呈上調(diào)趨勢，而脂質(zhì)、核苷酸和有機(jī)酸等代謝物則呈下調(diào)趨勢。

2.6轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析

為了進(jìn)一步了解同一生物過程的代謝物與基因之間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)行代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)聯(lián)合分析，共得到60條顯著富集的KEGG通路（圖6）。差異基因主要富集的KEGG通路包括苯丙素生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（plant hormone signal transduction）、次生代謝物的生物合成（biosynthesis of secondary me-tabolites）、甘油磷脂代謝（glycerophospholipid me-tabolism）、氮代謝（nitrogen metabolism）等；差異代謝物主要富集的KEGG通路包括異黃酮生物合成（isoflavonoid biosynthesis），次生代謝物生物合成（biosynthesis of secondary metabolites），萜、哌啶和吡啶生物堿的生物合成（tropane，piperidine andpyridine alkaloid biosynthesis），精氨酸生物合成（arginine biosynthesis），氨基酸生物合成（biosyn-thesis of amino acids）等。

2.7氮處理對(duì)花生根系生長素類化合物含量的影響

前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)生長素及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與花生結(jié)瘤過程，因此對(duì)氮素處理后花生根部生長素類化合物及其含量進(jìn)行了測定，經(jīng)LC-MS/MS分析共篩選出11種生長素類化合物（表4），N處理后，TRA、ICA含量降低，但差異不顯著；IAA -Phe-Me和IAN含量增加，IAN增加顯著；其余7種化合物含量降低且差異顯著。

2.8氮處理對(duì)花生根瘤數(shù)和根瘤固氮酶活性的影響

與對(duì)照相比，氮處理?xiàng)l件下花育22號(hào)的根瘤數(shù)量顯著減少（圖7A），根瘤的固氮酶活性也顯著降低（圖7B），表明施氮會(huì)抑制花生結(jié)瘤和固氮

3討論

花生能通過根瘤與根瘤菌共生固氮，但施氮量過高時(shí)會(huì)抑制其固氮效應(yīng)。為研究氮素調(diào)控花生結(jié)瘤固氮機(jī)理，本研究對(duì)施氮和不施氮花生根系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定出3123個(gè)差異表達(dá)基因，富集在生物過程、細(xì)胞組成和分子功能三大類，其中與氮調(diào)控根瘤固氮有關(guān)的基因13個(gè)；經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析，鑒定出酚酸、黃酮、氨基酸等12大類201種差異代謝物，其中黃酮類代謝物占比最高，約占19.9%。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的聯(lián)合分析，進(jìn)一步探究了氮素調(diào)控花生結(jié)瘤固氮的主要途徑，具體結(jié)果如下。

3.1氮素對(duì)生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控

生長素在植物整個(gè)生命周期中發(fā)揮重要作用，能通過調(diào)控生長素響應(yīng)基因的表達(dá)參與根瘤的形成。在生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的早期階段Aux/IAA（auxin/indole-3-aceticacid）家方笑、ARF（auxin re-sponse factor）家族、SAUR（small auxin upregulatedRNA）家族和生長素響應(yīng)GH3（gretchenhagen 3）家族對(duì)生長素的刺激有響應(yīng)。本研究中發(fā)現(xiàn)，氮處理后編碼生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（生長素應(yīng)答蛋白IAA27）的基因表達(dá)量上調(diào)。因此，外源氮會(huì)使花生根中IAA基因表達(dá)量增加，抑制生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這一研究結(jié)果與在苜蓿中的研究結(jié)果相反，可能是因?yàn)檐俎Ｅc花生的根瘤類型不同。另外，外施氮肥后3個(gè)ARF基因表達(dá)下調(diào)，而ARF蛋白對(duì)根瘤菌侵染具有直接反應(yīng)，因此，ARF基因表達(dá)下調(diào)可能會(huì)影響根瘤菌侵染。綜上所述，外施氮肥會(huì)通過影響生長素響應(yīng)基因AuxIAA和ARF的表達(dá)來影響生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和根瘤菌侵染，進(jìn)而影響花生結(jié)瘤。

3.2氮素對(duì)根瘤固氮信號(hào)分子的調(diào)控

有報(bào)道稱，腐胺、天冬酰胺是調(diào)節(jié)根瘤固氮的信號(hào)分子。鷹嘴豆和黑豆根瘤中腐胺的濃度與固氮能力呈正相關(guān)，鳥氨酸脫羧酶（ODC）在植物中催化精氨酸合成腐胺。本研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)編碼鳥氨酸脫羧酶的基因在氮處理中表達(dá)量上升。因此，外源氮促進(jìn)花生根瘤中精氨酸向腐胺的轉(zhuǎn)化，降低了花生根瘤中固氮酶活性，這與鷹嘴豆、豌豆和黑豆的研究結(jié)果相反，但與大豆的研究結(jié)果相似，表明腐胺介導(dǎo)的固氮酶活性調(diào)節(jié)可能與作物種類有關(guān)。Bacanamwo和Har-per的研究表明大豆植株的固氮酶活性與天冬酰胺及其代謝物（天冬氨酸和谷氨酸）的含量有關(guān)，施用外源氮后，根瘤中谷氨酸和天冬氨酸的含量會(huì)增加。本研究中，外施氮肥后編碼天冬酰胺合成酶（AS）的基因表達(dá)上調(diào)，可能會(huì)使天冬酰胺含量增加，而天冬酰胺負(fù)調(diào)控固氮活性。綜上所述，外施氮肥促進(jìn)了根瘤中腐胺和天冬酰胺等信號(hào)分子的合成，這會(huì)在一定程度上抑制根瘤的固氮酶活性。

3.3氮素對(duì)根瘤固氮能量的調(diào)控

豆科作物與根瘤菌的交互需要根瘤菌與寄主植物之間的協(xié)調(diào)溝通，這種溝通使根瘤菌能夠被容納在根瘤中，在此處大氣中的N，被還原為氨，為植物提供了一種可以被同化的氮源：反過來，植物也向根瘤菌提供固定碳。在定型根瘤中，大部分固定的NH3通過類菌體和共生體擴(kuò)散到植物細(xì)胞質(zhì)中，通過谷氨酰胺合成酶／谷氨酸合成酶（GS/GOGAT）循環(huán)將其迅速同化為谷氨酰胺（Gln），然后谷氨酰胺被用作氮供體，在定型根瘤中用于嘌呤和脲類的生物合成。本試驗(yàn)中，氮處理后編碼GS和GOGAT的基因表達(dá)下調(diào)，這可能會(huì)直接降低根瘤的固氮作用。

根瘤的碳代謝是根瘤固氮的主要能量來源。蔗糖可通過淀粉合酶轉(zhuǎn)化為淀粉用于貯存，并通過蔗糖合酶催化為葡萄糖和果糖，進(jìn)一步參與糖酵解等代謝途徑。草酰乙酸可以通過蘋果酸脫氫酶轉(zhuǎn)化成蘋果酸，蘋果酸通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入共生體中，從而維持共生體正常的呼吸和共生固氮。Tesfaye等研究表明，苜蓿中蘋果酸脫氫酶過表達(dá)可導(dǎo)致苜蓿根瘤中蘋果酸濃度升高。本研究中，施氮花生根系中編碼蘋果酸脫氫酶和NAD依賴的蘋果酸酶基因表達(dá)量下調(diào)，這可能會(huì)使根瘤中蘋果酸濃度降低。因此，外源氮對(duì)花生根瘤固氮的抑制作用可能是由于蘋果酸濃度降低，根瘤菌固氮能量不足所致。

4結(jié)論

本研究基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)綜合分析了施氮對(duì)花生結(jié)瘤固氮的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)氮素通過調(diào)控生長素響應(yīng)基因的表達(dá)來影響生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而影響花生結(jié)瘤：花生根瘤中腐胺、天冬酰胺等物質(zhì)的合成可能與氮素抑制固氮酶活性有一定的相關(guān)性：而花生根瘤中蘋果酸濃度降低，根瘤固氮能量不足可能是氮素抑制固氮酶活性的另一原因。因此，花生種植過程中要合理施用氮肥，提高花生與根瘤菌的共生固氮效率。