王虎玄, 柯西娜, 王 聰, 朱亞南, 孫宏民

(陜西科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 西安 710021)

0 引言

自由基對(duì)人體健康具有較大負(fù)面影響.老年癡呆、動(dòng)脈硬化、心腦血管疾病、糖尿病等多種慢性疾病的發(fā)生和發(fā)展,以及人體衰老均與體內(nèi)自由基密切相關(guān)[1,2].大量自由基等氧化物負(fù)面影響蛋白質(zhì)、DNA等胞內(nèi)生物活性大分子的結(jié)構(gòu)和功能,從而引發(fā)人體機(jī)能紊亂,產(chǎn)生病變.研究表明經(jīng)常食用具有抗氧化功能的食品對(duì)預(yù)防和緩解由自由基引發(fā)的疾病具有良好的效果.因此,開(kāi)發(fā)具有良好抗氧化活性的功能食品已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)[3,4].

植物酵素是以水果、蔬菜、谷物等為原料,通過(guò)微生物(乳酸菌、酵母、霉菌)發(fā)酵制備的富含生物活性成分(酶、維生素、礦物質(zhì)以及次生代謝產(chǎn)物等)的新型功能性產(chǎn)品[5].植物酵素含有多種功能酶,如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、超氧化物歧化酶(SOD)等;含有多種抗氧化類物質(zhì),如多酚類化合物、氨基丁酸等;含有多種風(fēng)味物質(zhì),如芳香類化合物、多糖等;并含有其它活性物質(zhì),如功能多肽等[6].上述功能營(yíng)養(yǎng)成分在植物酵素維持和保護(hù)人體健康方面發(fā)揮了重要作用.研究發(fā)現(xiàn),植物酵素在抗氧化、清除自由基、活化細(xì)胞、平衡內(nèi)分泌、提高身體免疫、美容養(yǎng)顏等方面具有良好功效,能預(yù)防和緩解多種急慢性疾病的發(fā)生和發(fā)展[7,8].人體細(xì)胞雖可合成少量酵素,但仍需通過(guò)日常膳食吸收補(bǔ)充才能使體內(nèi)酵素實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)均衡.體內(nèi)酵素缺乏,可導(dǎo)致自由基氧化損傷、新陳代謝受阻等機(jī)體功能紊亂,從而產(chǎn)生急慢性病癥[9].因此,植物酵素食品已成為風(fēng)靡日本、歐洲等國(guó)家和地區(qū)的“明星”保健食品.我國(guó)也于2019年將食用酵素列為《產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整指導(dǎo)目錄》鼓勵(lì)類產(chǎn)業(yè).

蘋果屬薔薇科蘋果亞科,不僅富含多酚、類黃酮、膳食纖維、維生素等多種功能營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),而且具有抗氧化、抗癌、預(yù)防心血管及其它慢性疾病等作用.蘋果是我國(guó)種植面積較廣的農(nóng)業(yè)資源,尤其在秦嶺以北陜西寶雞、咸陽(yáng)、延安等地區(qū)分布廣泛,已經(jīng)作為支柱產(chǎn)業(yè)發(fā)展.總種植面積已超過(guò)1 000萬(wàn)畝,年產(chǎn)量在1 200萬(wàn)噸左右,資源十分豐富.目前,陜西蘋果產(chǎn)業(yè)規(guī)模和產(chǎn)量穩(wěn)居全國(guó)首位,已成為陜西農(nóng)業(yè)的特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè),也是鄉(xiāng)村振興的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè).雖然陜西蘋果資源非常豐富,但開(kāi)發(fā)利用狀況相對(duì)落后,加工種類單一(主要是蘋果濃縮汁),產(chǎn)值偏低,經(jīng)濟(jì)效益有限.蘋果精深加工技術(shù)的落后,直接制約著高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn).為了破除上述產(chǎn)業(yè)弊端,并契合“面向人民生命健康”的產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢(shì),以蘋果為原料進(jìn)行酵素生產(chǎn)具有良好的資源優(yōu)勢(shì)和開(kāi)發(fā)價(jià)值.目前關(guān)于蘋果酵素開(kāi)發(fā)的研究已有報(bào)道,但大多采用單一菌種進(jìn)行發(fā)酵[10,11].同時(shí)采用不同菌種組合發(fā)酵(如酵母菌+乳酸菌組合發(fā)酵)可以利用微生物之間互利共生關(guān)系而生成更豐富的代謝產(chǎn)物(如蘋果中糖類物質(zhì)作為碳源被酵母菌發(fā)酵利用,而其它組分可通過(guò)酵母菌代謝生成次生產(chǎn)物,如SOD前體物;進(jìn)一步通過(guò)乳酸菌發(fā)酵可促進(jìn)蘋果酚類化合物形態(tài)轉(zhuǎn)化等),克服單一菌種發(fā)酵不足的缺點(diǎn),從而制備出具有更好生理活性的酵素,但這方面的報(bào)道較少[12,13].

本文以陜西洛川富士蘋果為原料,以酵母菌和乳酸菌為發(fā)酵菌種,以SOD活力、總酸含量為主要指標(biāo),采用組合發(fā)酵方式,對(duì)影響酵母菌和乳酸菌發(fā)酵的工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,明確了蘋果酵素發(fā)酵的最佳工藝條件,并對(duì)蘋果酵素的抗氧化功能進(jìn)行了初步分析.研究結(jié)果可為基于組合發(fā)酵改善蘋果營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性提供理論支撐,也為高附加值蘋果精深加工產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支撐,經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用價(jià)值顯著.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要材料

洛川富士蘋果:選取大小均一、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷、成熟度相近、色澤一致的果實(shí),蘋果購(gòu)買于西安本地超市;釀酒酵母、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌:均為食品級(jí),由陜西科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供.

1.1.2 主要試劑

酵母浸粉、葡萄糖、蛋白胨、瓊脂、MRS肉湯培養(yǎng)基,購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司;纖維素酶、果膠酶,購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;NaOH、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、D-山梨醇、蔗糖、 濃鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、硫酸亞鐵、福林酚等,均為分析純,購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;SOD試劑盒,購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司.

1.2 主要儀器

SP-756P紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海光譜儀器有限公司;TDZ5-WS臺(tái)式離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;PXY-DHS-500BS恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;SW-CJ-1F超凈工作臺(tái),蘇凈集團(tuán)-蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;pHS-25pH計(jì),上海儀電科學(xué)儀器集團(tuán).

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘋果酵素制備工藝流程

新鮮蘋果→切塊勻漿→酶解→過(guò)濾→滅菌→調(diào)配→接種酵母菌→恒溫發(fā)酵→接種乳酸菌→恒溫發(fā)酵→4 ℃冷藏→蘋果酵素

1.3.2 操作要點(diǎn)

(1)原料預(yù)處理

清水洗凈蘋果后去核、切塊,打漿,然后添加復(fù)合酶制劑(果膠酶與纖維素酶比例3∶1)進(jìn)行酶解.復(fù)合酶制劑添加量為0.05% w/v,酶解溫度為55 ℃,酶解時(shí)間為2 h,潔凈紗布過(guò)濾,濾汁高溫滅菌處理[14].

(2)酵母菌活化

用適量無(wú)菌生理鹽水溶解釀酒酵母菌粉,然后將菌液涂布于YPD固體培養(yǎng)基,并將培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d.挑取單菌落再次接種于10 mL YPD液體培養(yǎng)基中,并將液體培養(yǎng)基置于搖床(28 ℃,200 r/min)中培養(yǎng)24 h.

(3)酵母菌接種

取適量酵母菌菌液離心去上清,加入等量無(wú)菌生理鹽水,然后接種至蘋果汁(接種量1% v/v)中,28 ℃發(fā)酵20 h,定期通風(fēng)以保證充分溶氧.

(4)乳酸菌活化

將鼠李糖乳桿菌與植物乳桿菌凍存液分別接種于適量MRS液體培養(yǎng)基中,并將液體培養(yǎng)基置于搖床(37 ℃,200 r/min)中培養(yǎng)12 h.吸取適量培養(yǎng)液再次接種于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h (接種量1% v/v).

(5)乳酸菌接種

取適量乳酸菌菌液離心去上清,加入等量無(wú)菌生理鹽水,然后接種至已被酵母菌發(fā)酵20 h的蘋果汁中(接種量1% v/v),37 ℃發(fā)酵20 h.

1.3.3 蘋果酵素酵母菌發(fā)酵工藝優(yōu)化

相對(duì)于酵母菌而言,乳酸菌更能快速有效地利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),因此在蘋果酵素制備過(guò)程中,首先采用酵母菌發(fā)酵,然后進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵[15].

(1)發(fā)酵溫度的考察

固定蘋果汁中蔗糖添加量為6% w/v,蘋果汁起始pH為4.0,酵母菌接種量為1% v/v,發(fā)酵時(shí)間為20 h,調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度分別為20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃進(jìn)行發(fā)酵.發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定蘋果發(fā)酵液SOD活性,以確定最適的酵母菌發(fā)酵溫度.

(2)發(fā)酵時(shí)間的考察

固定蘋果汁中蔗糖添加量為6% w/v,蘋果汁起始pH為4.0,發(fā)酵溫度為30 ℃,酵母菌接種量為1% v/v,調(diào)節(jié)發(fā)酵時(shí)間分別為10 h、15 h、20 h、25 h、30 h進(jìn)行發(fā)酵.發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定蘋果發(fā)酵液SOD活性,以確定最適的發(fā)酵時(shí)間.

(3)接種量的考察

固定蘋果汁中蔗糖添加量為6% w/v,蘋果汁起始pH為4.0,發(fā)酵溫度為30 ℃,發(fā)酵時(shí)間為20 h,調(diào)節(jié)酵母菌接種量分別為0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5% v/v進(jìn)行發(fā)酵.發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定蘋果發(fā)酵液SOD活性,以確定最適的酵母菌接種量.

(4)蔗糖添加量的考察

固定蘋果汁起始pH為4.0,發(fā)酵溫度為30 ℃,酵母菌接種量為1% v/v,發(fā)酵時(shí)間為20 h,調(diào)節(jié)蘋果汁中蔗糖添加量分別為4%、5%、6%、7%、8% w/v進(jìn)行發(fā)酵.發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定蘋果發(fā)酵液SOD活性,以確定最適的蔗糖添加量.

(5)蘋果汁起始pH的考察

固定蘋果汁中蔗糖添加量為6% w/v,發(fā)酵溫度為30 ℃,酵母菌接種量為1% v/v,發(fā)酵時(shí)間為20 h,調(diào)節(jié)蘋果汁起始pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0進(jìn)行發(fā)酵.發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定蘋果發(fā)酵液SOD活性,以確定最適的蘋果汁起始pH.

(6)蘋果酵素酵母菌發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、蘋果汁起始pH和蔗糖添加量四個(gè)因素,以SOD活力為響應(yīng)值,進(jìn)行四因素三水平的Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),研究蘋果酵素酵母菌發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù).

1.3.4 蘋果酵素乳酸菌發(fā)酵工藝優(yōu)化

在酵母菌發(fā)酵一定時(shí)間后,蘋果汁發(fā)酵液SOD活力達(dá)到最高時(shí),分別接種鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌,進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵.

(1)發(fā)酵溫度的考察

調(diào)節(jié)蘋果發(fā)酵液pH為5.0,固定乳酸菌接種量為1% v/v,發(fā)酵時(shí)間為20 h,調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度分別為28 ℃、33 ℃、37 ℃、41 ℃、46 ℃進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定蘋果發(fā)酵液中乳酸菌數(shù)量和總酸含量,以確定乳酸菌的最適發(fā)酵溫度.

(2)發(fā)酵時(shí)間的考察

調(diào)節(jié)蘋果發(fā)酵液pH為5.0,固定乳酸菌接種量為1% v/v,發(fā)酵溫度為37 ℃,調(diào)節(jié)發(fā)酵時(shí)間分別為10 h、15 h、20 h、25 h、30 h進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定蘋果發(fā)酵液中乳酸菌數(shù)量和總酸含量,以確定乳酸菌的最適發(fā)酵時(shí)間.

(3)接種量的考察

調(diào)節(jié)蘋果發(fā)酵液pH為5.0,固定發(fā)酵溫度為37 ℃,發(fā)酵時(shí)間為20 h,調(diào)節(jié)乳酸菌接種量分別為0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5% v/v進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定蘋果發(fā)酵液中乳酸菌數(shù)量和總酸含量,以確定乳酸菌的最適接種量.

(4)蘋果發(fā)酵液起始pH的考察

固定乳酸菌接種量為1% v/v,發(fā)酵溫度為37 ℃,發(fā)酵時(shí)間為20 h,調(diào)節(jié)蘋果發(fā)酵液起始pH分別為6.1、6.3、6.5、6.7、6.9進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定蘋果發(fā)酵液中乳酸菌數(shù)量和總酸含量,以確定蘋果發(fā)酵液的最適起始pH.

(5)蘋果酵素乳酸菌發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的乳酸菌進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì).選取發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、蘋果發(fā)酵汁起始pH三個(gè)因素,以發(fā)酵液總酸含量為響應(yīng)值,進(jìn)行三因素三水平的Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),研究蘋果酵素乳酸菌發(fā)酵的最優(yōu)工藝條件.

1.3.5 相關(guān)指標(biāo)測(cè)定方法

(1)SOD活力

參考GB/T 5009.171-2003[16],使用SOD活力試劑盒(NBT法)進(jìn)行檢測(cè).具體測(cè)定方法見(jiàn)試劑盒操作說(shuō)明書.

(2)總酸含量

參考GB/T 12293-2021[17]中的方法測(cè)定.

(3)酵母菌濃度

采用血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定.

(4)乳酸菌濃度

參考GB/T 4789.35-2016[18]采用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行平板接種計(jì)數(shù),計(jì)算乳酸菌濃度.

(5)抗氧化性指標(biāo)的測(cè)定

羥基自由基清除率、鐵離子還原力以及總酚含量參考相關(guān)文獻(xiàn)[19,20]中的方法進(jìn)行測(cè)定.

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù),試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.采用SPSS 12.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析+多重比較檢驗(yàn)(p<0.05,Duncan′s-multiple-range-test)或者t檢驗(yàn)(p<0.05).

2 結(jié)果與討論

2.1 蘋果酵素酵母菌發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度的考察

隨著菌種的不同,酵母菌最適生長(zhǎng)溫度一般介于20 ℃～30 ℃[21].從圖1(a)可以看出,發(fā)酵溫度為20 ℃時(shí),可能溫度過(guò)低導(dǎo)致本文所用的酵母菌株代謝速率減弱,因而發(fā)酵液SOD活力較低.隨著發(fā)酵溫度升高,酵母菌株代謝速率逐步加快,發(fā)酵液SOD活力隨之逐漸增加.發(fā)酵溫度達(dá)到30 ℃時(shí),發(fā)酵液SOD活力達(dá)到峰值(143.07±2.01 U/mL).隨著發(fā)酵溫度進(jìn)一步升高(達(dá)到35 ℃和40 ℃時(shí)),可能過(guò)高溫度對(duì)酵母菌株代謝活性產(chǎn)生抑制作用,導(dǎo)致發(fā)酵液SOD活力快速降低.因此蘋果酵素酵母菌發(fā)酵溫度控制在30 ℃左右進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn).

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間的考察

從圖1(b)可以看出,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),發(fā)酵液SOD活力呈現(xiàn)出先快速增加而后逐漸下降的趨勢(shì).發(fā)酵20～25 h后,酵母菌株可能已經(jīng)充分代謝蘋果汁中碳源物質(zhì)生成SOD,SOD生成量達(dá)到峰值,因而發(fā)酵液SOD活力達(dá)到峰值(134.21±3.53 U/mL).隨著發(fā)酵時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)(達(dá)到30 h時(shí)),發(fā)酵液SOD活力逐漸下降.這可能是由于SOD作為一類金屬酶(含有Cu、Zn、Fe或Mn金屬離子等作為輔基),酵母長(zhǎng)時(shí)間代謝產(chǎn)生的過(guò)量Mn、Fe等金屬離子對(duì)SOD活性產(chǎn)生抑制作用[22].因此蘋果酵素酵母菌發(fā)酵時(shí)間控制在20 h左右進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn).

2.1.3 酵母菌接種量的考察

從圖1(c)可以看出,隨著酵母菌接種量的增加,發(fā)酵液SOD活力呈現(xiàn)出先快速增加而后緩慢下降的趨勢(shì).接種量介于0.5%～1.0% v/v時(shí),隨著接種量的增加,酵母菌代謝速率快速加大,因而發(fā)酵液SOD活力隨之快速增加.接種量達(dá)到1.0% v/v時(shí),發(fā)酵液SOD活力達(dá)到峰值(128.53±3.28 U/mL).接種量超過(guò)1.0% v/v后,發(fā)酵液SOD活力緩慢下降.這可能是由于接種量過(guò)高導(dǎo)致發(fā)酵液中酵母菌濃度大幅增加,蘋果汁中有限含量的碳源等營(yíng)養(yǎng)成分無(wú)法支撐酵母菌充分代謝,引發(fā)酵母菌株間對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的爭(zhēng)奪,酵母菌代謝活性受到抑制[23].此外,過(guò)高接種量可能引發(fā)酵母菌出現(xiàn)菌體自溶,活菌濃度降低導(dǎo)致代謝能力減弱,從而導(dǎo)致SOD活力降低[24].因此蘋果酵素酵母菌發(fā)酵接種量控制在1.0% v/v為宜.

2.1.4 蔗糖添加量的考察

酵母菌的發(fā)酵特性與底物濃度、溫度、pH等密切相關(guān).由于鮮榨蘋果汁糖含量(底物濃度)較低,影響酵母菌發(fā)酵性能.因此進(jìn)行適當(dāng)濃度外源糖分添加在促進(jìn)酵母菌充分快速發(fā)酵,確保發(fā)酵終產(chǎn)品良好風(fēng)味、口感、香氣等品質(zhì)形成方面具有重要作用.

為了確保酵母菌的充分發(fā)酵,本文采用蔗糖為酵母菌提供額外碳源成分.從圖1(d)可以看出,隨著蔗糖添加量的增加,發(fā)酵液SOD活力呈現(xiàn)出先快速升高而后快速下降的趨勢(shì).蔗糖添加量小于6.0% w/v時(shí),隨著蔗糖添加量增加,酵母菌代謝速率加快,發(fā)酵液SOD活力快速升高.蔗糖添加量達(dá)到6.0% w/v時(shí),發(fā)酵液SOD活力達(dá)到峰值(123.69±2.93 U/mL).蔗糖添加量超過(guò)6.0% w/v后,發(fā)酵液SOD活力快速下降.分析認(rèn)為蔗糖添加量過(guò)高會(huì)降低蘋果汁水活度,抑制酵母菌代謝活性,從而導(dǎo)致SOD活性降低[25].

此外,本文雖未對(duì)發(fā)酵過(guò)程中外加糖分(蔗糖)的含量變化進(jìn)行檢測(cè),但研究發(fā)現(xiàn)蔗糖添加量對(duì)發(fā)酵液SOD活力具有顯著影響(如圖1(d)所示),結(jié)合前人有關(guān)鮮食葡萄汁加糖發(fā)酵過(guò)程中外加糖分含量持續(xù)降低的結(jié)果,作者推測(cè)本文中蘋果糖類物質(zhì)以及外加糖分(蔗糖)均為酵母菌發(fā)酵的碳源.酵母菌先快速代謝蘋果中主要單糖(果糖和葡萄糖),然后利用蘋果中雙糖及外加蔗糖持續(xù)發(fā)酵[26].綜上,蘋果酵素酵母菌發(fā)酵蔗糖添加量控制在6.0% w/v左右進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn).

2.1.5 蘋果汁初始pH的考察

從圖1(e)可以看出,蘋果汁初始pH低于4.0時(shí),發(fā)酵液SOD活力隨著pH的增加而逐漸升高.蘋果汁初始pH為4.0時(shí),發(fā)酵液SOD活力達(dá)到峰值(122.53±1.42 U/mL).蘋果汁初始pH超過(guò)4.0之后,發(fā)酵液SOD活力逐漸降低.培養(yǎng)基pH是影響微生物發(fā)酵的重要參數(shù)之一,對(duì)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)穩(wěn)定性、菌體生物酶活性維持、菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等至關(guān)重要[27].研究表明,微酸性環(huán)境有利于酵母菌的生長(zhǎng)代謝[28],推測(cè)pH 4.0(微酸性)是本文所用的釀酒酵母菌的適宜生長(zhǎng)pH.因此蘋果酵素酵母菌發(fā)酵蘋果汁初始pH控制在4.0左右進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn).

圖1 蘋果酵素酵母菌發(fā)酵單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.6 蘋果酵素酵母菌發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

SOD酶活力(U/mL)=161.32+6.24a+1.01b-

2.00c-0.67d-6.50ab-0.29ac+2.31ad+

0.56bc-0.27bd-1.06cd-4.35a2-15.70b2-

19.54c2-23.37d2

(1)

式(1)中:a-發(fā)酵時(shí)間(h);b-發(fā)酵溫度( ℃);c-蔗糖添加量(w/v);d-蘋果汁起始pH.

基于上述回歸方程,得到蘋果酵素酵母菌發(fā)酵的理論最優(yōu)工藝關(guān)鍵參數(shù)為:發(fā)酵溫度28.87 ℃、發(fā)酵時(shí)間19.71 h、蔗糖添加量5.54% w/v、蘋果汁初始pH 4.45,在此條件下模型預(yù)測(cè)的SOD活力為151.51 U/mL.考慮到實(shí)際操作,將上述工藝參數(shù)修改為發(fā)酵溫度29 ℃、發(fā)酵時(shí)間20 h、蔗糖添加量5.5% w/v、蘋果汁初始pH 4.5、酵母菌接種量1% v/v,此條件下3次重復(fù)試驗(yàn)的SOD活力為149.32±2.58 U/mL,與模型擬合理論值相近,說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化回歸模型參數(shù)真實(shí)可靠.

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

表2 響應(yīng)面模型的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

2.2 蘋果酵素乳酸菌發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵溫度的考察

從圖2(a)可以看出,隨著發(fā)酵溫度的逐步升高,兩株乳酸菌(植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌)代謝活性可能逐步加強(qiáng),發(fā)酵液中乳酸菌濃度及總酸含量均逐步增加.發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí),發(fā)酵液中乳酸菌濃度(鼠李糖乳桿菌:6.19±0.23 lg CFU/mL;植物乳桿菌:5.71±0.04 lg CFU/mL)及總酸含量(鼠李糖乳桿菌:3.65±0.47 g/L;植物乳桿菌:3.31±0.37 g/L)均達(dá)到峰值.進(jìn)一步提高發(fā)酵溫度,乳酸菌濃度及總酸含量均逐步降低.兩株乳酸菌對(duì)比來(lái)看,在相同發(fā)酵溫度下,鼠李糖乳桿菌各項(xiàng)指標(biāo)值均優(yōu)于植物乳桿菌,這可能與乳酸菌的發(fā)酵特性具有種屬間差異相關(guān)[29].因此蘋果酵素乳酸菌發(fā)酵溫度控制在37 ℃左右進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn).

2.2.2 發(fā)酵時(shí)間的考察

從圖2(b)可以看出,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),兩株乳酸菌持續(xù)代謝酵母菌發(fā)酵后蘋果汁中營(yíng)養(yǎng)成分產(chǎn)生大量有機(jī)酸,導(dǎo)致發(fā)酵液總酸含量持續(xù)增加.發(fā)酵20 h后,乳酸菌濃度與總酸含量的增加逐漸趨于平緩(鼠李糖乳桿菌濃度:6.10±0.18 lg CFU/mL;植物乳桿菌濃度:5.88±0.15 lg CFU/mL;總酸/鼠李糖乳桿菌:4.07±0.36 g/L;總酸/植物乳桿菌:3.95±0.26 g/L).在相同發(fā)酵時(shí)間下,鼠李糖乳桿菌各項(xiàng)指標(biāo)值均優(yōu)于植物乳桿菌.考慮到實(shí)際生產(chǎn)成本,蘋果酵素乳酸菌發(fā)酵時(shí)間控制在20 h左右進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn).

2.2.3 接種量的考察

由圖2(c)可以看出,隨著兩株乳酸菌接種量的增加,發(fā)酵液乳酸菌濃度和總酸含量均呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì).接種量達(dá)到1% v/v后,乳酸菌濃度及總酸含量的增加趨于平緩(鼠李糖乳桿菌濃度:5.96±0.21 lg CFU/mL;植物乳桿菌濃度:5.78±0.14 lg CFU/mL;總酸/鼠李糖乳桿菌:3.94±0.29 g/L;總酸/植物乳桿菌:3.70±0.08 g/L).在相同接種量下,鼠李糖乳桿菌各項(xiàng)指標(biāo)值均優(yōu)于植物乳桿菌.考慮到實(shí)際生產(chǎn)成本,蘋果酵素乳酸菌發(fā)酵接種量控制在1% v/v為宜.

2.2.4 發(fā)酵液初始pH的考察

由圖2(d)可以看出,植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌發(fā)酵的最適pH介于6.3～6.7之間,在此pH范圍內(nèi),發(fā)酵液乳酸菌濃度(鼠李糖乳桿菌:6.32±0.28 lg CFU/mL;植物乳桿菌:6.10±0.11 lg CFU/mL)和總酸含量(鼠李糖乳桿菌:4.16±0.36 g/L;植物乳桿菌:4.04±0.18 g/L)均達(dá)到峰值.發(fā)酵液初始pH低于或高于此范圍,乳酸菌濃度和總酸含量均呈現(xiàn)出下降趨勢(shì).在發(fā)酵液初始pH相同條件下,鼠李糖乳桿菌各項(xiàng)指標(biāo)值均優(yōu)于植物乳桿菌.考慮到蘋果汁中酵母菌發(fā)酵的可持續(xù)性,蘋果酵素乳酸菌發(fā)酵發(fā)酵液初始pH控制在6.3左右進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn).

圖2 蘋果酵素乳酸菌發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.5 蘋果酵素乳酸菌發(fā)酵響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 響應(yīng)面模型的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

通過(guò)Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到二次多項(xiàng)回歸方程如下:

總酸含量(g/L)=1.44-0.014a-0.013b+0.085c-0.013ab+0.007 2ac-0.002 7bc-0.14a2-0.17b2-0.17c2

(2)

式(2)中:a-發(fā)酵溫度( ℃);b-發(fā)酵液初始pH;c-發(fā)酵時(shí)間(h).

基于上述回歸方程,得到蘋果酵素乳酸菌發(fā)酵的理論最優(yōu)工藝參數(shù)為:發(fā)酵溫度37.18 ℃、發(fā)酵時(shí)間23.12 h、發(fā)酵液初始pH 6.24,在此條件下模型預(yù)測(cè)的總酸含量為4.25 g/L.考慮到實(shí)際操作,將上述工藝參數(shù)修改為發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間23 h、發(fā)酵液初始pH 6.2、乳酸菌接種量1% v/v,此條件下3次重復(fù)試驗(yàn)的總酸含量為3.98±0.34 g/L,與模型擬合理論值相近,說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化回歸模型參數(shù)真實(shí)可靠.

2.3 蘋果酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果

基于上述蘋果酵素酵母菌和乳酸菌發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果,得到蘋果酵素發(fā)酵工藝關(guān)鍵參數(shù)如下:蘋果汁中添加5.5% w/v蔗糖并調(diào)節(jié)蘋果汁pH 至4.5,接種釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵溫度29 ℃,接種量1% v/v,發(fā)酵20 h后蘋果汁發(fā)酵液SOD活力達(dá)到峰值(149.32±2.58 U/mL);而后調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至6.2、接種鼠李糖乳桿菌繼續(xù)發(fā)酵,發(fā)酵溫度37 ℃,接種量1% v/v,發(fā)酵時(shí)間23 h.制備的蘋果酵素SOD活力為158.54±1.32 U/mL,釀酒酵母濃度為7.66±0.20 lg CFU/mL,鼠李糖乳桿菌濃度為6.47±0.14 lg CFU/mL,總酸含量為3.98±0.34 g/L.

2.4 蘋果酵素抗氧化性結(jié)果

對(duì)最優(yōu)工藝條件下制備的蘋果酵素的抗氧化性進(jìn)行了初步檢測(cè).由表5可以看出,蘋果酵素羥基自由基清除率、鐵離子還原力以及總酚含量相比于對(duì)照組(未發(fā)酵蘋果汁)分別提高了90.70%、77.78%和93.23%, 說(shuō)明酵母菌+乳酸菌分段發(fā)酵可大幅提高蘋果汁抗氧化性.Karaman等[30]研究指出酚類物質(zhì)能很容易地給出H+,并通過(guò)共振雜化而穩(wěn)定,從而表現(xiàn)出較高自由基清除率.因此,酵素羥基自由基清除率的增強(qiáng)與酵素總酚含量的增加具有一定相關(guān)性[31].自由基清除率也與有機(jī)酸的羥基取代基、分子數(shù)量以及芳香環(huán)數(shù)量等密切相關(guān)[32].

本文雖然未對(duì)酵素總酸的具體成分進(jìn)行檢測(cè),但查閱相關(guān)報(bào)道可知水果酵素中有機(jī)酸主要為乳酸、蘋果酸、酒石酸、草酸、琥珀酸等,多種有機(jī)酸的綜合作用可顯著提高自有基清除力[33].此外,酵素中釀酒酵母細(xì)胞壁上的多糖也具有一定的自由基清除力[34].因此,蘋果酵素表現(xiàn)出良好抗氧化性.與食品天然抗氧化劑(Vc和水溶性維生素E)以及合成抗氧化劑(BHA、BHT)相比,單菌(乳酸菌)發(fā)酵蘋果汁的DPPH自由基清除率和羥基自由基清除率顯著增強(qiáng),但鐵離子還原能力不及Vc[35,36].本文所采用的混菌發(fā)酵可以利用微生物之間互利共生關(guān)系進(jìn)一步豐富蘋果汁中微生物代謝產(chǎn)物,因此作者推測(cè)混菌(酵母菌+乳酸菌)發(fā)酵蘋果酵素的抗氧化性強(qiáng)于Vc、BHT、BHA等食品抗氧化劑,但還需后期通過(guò)體外及體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行充分驗(yàn)證.

表5 蘋果酵素抗氧化功能結(jié)果

3 結(jié)論

本研究結(jié)合陜西地區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)特色,對(duì)陜西大宗水果資源-蘋果酵素的發(fā)酵工藝進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化,并初步檢測(cè)了酵素的抗氧化功能.通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn),明確了蘋果酵素酵母菌發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)為:發(fā)酵溫度29 ℃、接種量1% v/v、蔗糖添加量5.5% w/v、蘋果汁初始pH 4.5,發(fā)酵20 h后蘋果汁發(fā)酵液SOD活力達(dá)到峰值(149.32±2.58 U/mL);而后接種鼠李糖乳桿菌繼續(xù)發(fā)酵,最優(yōu)工藝參數(shù)為:發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵液初始pH 6.2、接種量1% v/v、發(fā)酵時(shí)間23 h.此條件下制備的蘋果酵素SOD 活力為 158.54±1.32 U/mL,釀酒酵母濃度為 7.66±0.20 lg CFU/mL,鼠李糖乳桿菌濃度為 6.47±0.14 lg CFU/mL,總酸含量為3.98±0.24 g/L.制備的蘋果酵素羥基自由基清除率、還原力以及總酚含量相比于對(duì)照組(未發(fā)酵蘋果汁)分別提高了90.70%、77.78%和93.23%,表現(xiàn)出良好的抗氧化性.研究結(jié)果為促進(jìn)陜西大宗水果資源-蘋果精深加工產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展提供技術(shù)支撐.