徐俊峰,徐婉君,董艷蓉,鄧祖躍,蔣 霞,袁 穎,方建紅,萬(wàn) 悅,任艷云

(1.浙江省立同德醫(yī)院口腔科,杭州 310012; 2.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院,杭州 310052; 3.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第903醫(yī)院口腔科,杭州 310013)

牙周炎是一種由口腔局部因素引起牙周支持組織的慢性炎癥,主要表現(xiàn)為牙齦紅腫出血和牙槽骨吸收,嚴(yán)重時(shí)致使牙齒松動(dòng)、脫落,影響口腔機(jī)能[1]。有研究[2]表明,Toll樣受體4(TLR4)參與牙周炎的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程,口腔內(nèi)微生物可激活TLR信號(hào)通路,強(qiáng)化炎癥反應(yīng)。TLR4不僅存在于樹(shù)突細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面,上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等非免疫細(xì)胞也表達(dá)TLR4[2]。TLR4的N端結(jié)構(gòu)識(shí)別脂多糖(LPS)等病原相關(guān)模式分子(PAMP)后,其構(gòu)象發(fā)生變化,進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)下游信號(hào)通路,最終主要作用是核因子-κB(NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活化[3]。NF-κB能調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)等炎癥因子的表達(dá)[4]。因?yàn)镹F-κB通路與炎癥反應(yīng)和破骨過(guò)程的聯(lián)系十分緊密,阻斷NF-κB通路可能有助于牙周炎的防止,而抑制TLR4的表達(dá)更能有效抑制TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子的上調(diào)[5-6]。

三黃漱口液主要成分為黃連、黃芩、黃柏、甘草、金銀花、茜草、烏梅、麥冬和菊花。君藥三黃,即黃芩、黃連和黃柏經(jīng)常聯(lián)用,黃芩偏重于上焦?jié)駸?黃連偏重于心火、胃火等中焦,黃柏偏重于下焦?jié)駸?三藥連用可瀉火解毒[7]。臣藥茜草可滋陰涼血;金銀花、菊花清熱解毒;烏梅、麥冬生津;甘草調(diào)和諸藥。上藥配合,共成清熱解毒、涼血化瘀止血,生津之劑,對(duì)牙周炎的臨床治療效果顯著,能有效減輕疼痛和牙周出血,同時(shí)也能達(dá)到局部殺菌消炎,清潔口腔的目的,具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本研究旨在探究三黃漱口液治療牙周炎的功效是否與TLR4-NF-κB通路有關(guān),分析該藥的藥理作用機(jī)制,為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

主要試劑:大鼠白介素-8(IL-8)ELISA試劑盒(ELS-2803-2)和大鼠白介素-10(IL-10)ELISA試劑盒(ELS-2871-2)購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司; NF-κB抗體(sc-8008)和TLR4抗體(sc-293072)購(gòu)自美國(guó)Santa Curz公司;GAPDH抗體(AF1186)和Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0006)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) HRP(BS13278,購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司);制備三黃漱口液所需的中藥飲片由浙江省立同德醫(yī)院藥劑科提供。

三黃漱口液的制備:取中藥飲片黃連2 g、黃柏5 g、金銀花5 g、茜草5 g、烏梅5 g、黃芩5 g、菊花5 g、麥冬8 g、甘草3 g,第一道加入1000 mL水,浸泡30 min后,煮沸30 min,第二道加入200 mL水,煮沸30 min,合并2道湯劑,過(guò)濾后濃縮至生藥濃度為1.12 g·mL-1的藥液備用。

主要儀器:Spectra Max190酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司);AI6000化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)GE公司);RM2400型切片機(jī)和生物顯微鏡(德國(guó)Leica公司);ViiA 7實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠,體重180～200 g,清潔級(jí),購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。飼養(yǎng)條件:光照12 h·d-1(時(shí)間為8∶00～20∶00),自由飲食飲水,溫度20～22 ℃,相對(duì)濕度為75%。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,進(jìn)行為期1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)。

1.3 大鼠牙周炎模型的建立

在已有的牙周炎模型建立方法[8]基礎(chǔ)上進(jìn)行改良。先用2%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠(腹腔注射,0.3 mL·100 g-1),固定好大鼠頭部和軀干后,在上頜左第二和第三磨牙之間插入1個(gè)3-0的絲線結(jié)扎,結(jié)扎第二磨牙,兩端打結(jié)固定,同時(shí)將大鼠飲用水更換為10%蔗糖水溶液。每天檢查結(jié)扎物,以確保它們?cè)趯?shí)驗(yàn)期間保持在適當(dāng)?shù)奈恢?如有脫落及時(shí)進(jìn)行重新結(jié)扎。4周后,可見(jiàn)模型大鼠出現(xiàn)牙齦紅腫出血、牙槽骨吸收及牙齒松動(dòng)現(xiàn)象。

1.4 動(dòng)物分組與給藥

將60只大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組、三黃漱口液低劑量組、三黃漱口液中劑量組、三黃漱口液高劑量組和甲硝唑組,每組10只。除了對(duì)照組,其余5組同時(shí)進(jìn)行牙周炎模型建立,模型建立成功后開(kāi)始給藥。每天2次口腔黏膜涂布給藥,三黃漱口液低劑量、中劑量和高劑量組每天使用的三黃漱口液生藥量分別為4.48、8.96和13.44 g·kg-1,甲硝唑組每天使用0.02 g·kg-1甲硝唑,對(duì)照組和模型組使用0.9% NaCl溶液,連續(xù)給藥1個(gè)月后處死動(dòng)物,取上頜組織備用。

1.5 HE染色

大鼠上頜骨標(biāo)本用冰浴的PBS緩沖液漂洗干凈后,置于10%中性甲醛中固定48 h,用乙二酸四乙酸二鈉溶液脫鈣處理1個(gè)月,再進(jìn)行石蠟切片,切片厚度為5 μm。進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及牙槽骨吸收等牙周組織的病理學(xué)形態(tài)學(xué)變化。

1.6 ELISA檢測(cè)

切取大鼠牙周炎模型的牙周組織,稱(chēng)重后加入相應(yīng)體積的PBS緩沖液,使用勻漿儀充分勻漿,離心后收集上清液。按照ELISA試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn),檢測(cè)各組大鼠牙周組織中促炎因子IL-8和抗炎因子IL-10的水平。

1.7 Western blot檢測(cè)

切取大鼠牙周炎模型的牙周組織,稱(chēng)重后按10 μL·mg-1加入RIPA裂解液,使用勻漿儀充分勻漿,離心后收集上清,用Bradford蛋白濃度試劑盒測(cè)定其蛋白濃度。按體積比4：1加入蛋白上樣緩沖液,沸水浴10 min使蛋白變性,制膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂奶粉對(duì)聚偏二氟乙烯(PDVF)膜進(jìn)行封閉處理1 h,4 ℃下進(jìn)行一抗孵育過(guò)夜。用TBST緩沖液洗膜3次后,進(jìn)行二抗孵育1 h。TBST緩沖液洗膜2次,TBS緩沖液洗膜1次后,進(jìn)行顯色處理。以GAPDH為內(nèi)參,用Image J軟件進(jìn)行圖片分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠牙周炎模型

牙周炎模型建立4周后,對(duì)照組和其余5組的牙周組織形態(tài)明顯不同:對(duì)照組大鼠牙周組織呈粉紅色,質(zhì)地堅(jiān)韌,無(wú)探診出血,牙槽骨無(wú)吸收(圖1A);模型組大鼠牙齦組織呈暗紅色,有明顯的牙槽骨吸收、牙根分叉、探診出血和牙周組織松軟現(xiàn)象,提示炎癥改變( 圖1B)。

A:對(duì)照組;B:模型組。黑色箭頭所示為牙周炎組織。圖1 大鼠牙周炎模型

2.2 三黃漱口液改善牙周炎組織病理形態(tài)

HE染色結(jié)果顯示:對(duì)照組牙周組織正常,沒(méi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2A);模型組牙周組織內(nèi)有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn),牙槽骨吸收明顯(圖2B);與模型組比較,三黃漱口液各劑量組和甲硝唑組的牙周組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少,成纖維細(xì)胞增生增加,低劑量組改變程度不明顯(圖2C),中劑量組有明顯改變(圖2D),高劑量組和甲硝唑組改變最為明顯(圖2E—F)。

A:對(duì)照組;B:模型組;C:三黃漱口液低劑量組;D:三黃漱口液中劑量組;E:三黃漱口液高劑量組;F:甲硝唑組。紅色箭頭所示為牙周組織中浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞。

2.3 三黃漱口液降低牙周炎性反應(yīng)

ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,模型組牙周組織中促炎因子IL-8的水平明顯升高,抗炎癥因子IL-10水平顯著下降(P<0.01)。三黃漱口液各劑量組IL-8水平隨用藥劑量增加逐漸降低,IL-10水平隨用藥劑量增加逐漸升高,三黃漱口液高劑量組的IL-8、IL-10水平與甲硝唑組相近。與模型組相比,三黃漱口液中、高劑量組和甲硝唑組的IL-8水平顯著降低,IL-10水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 三黃漱口液影響牙周IL-8和IL-10水平

2.4 三黃漱口液影響TLR4-NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)

與對(duì)照組相比,模型組的TLR4和NF-κB的表達(dá)明顯升高(P<0.01);與模型組比較,三黃漱口液各劑量組的TLR4和NF-κB的表達(dá)均降低(P<0.05或P<0.01);與三黃漱口液低劑量組比較,三黃漱口液中劑量組和三黃漱口液高劑量組TLR4和NF-κB的表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

*與對(duì)照組比較P<0.01;#與模型組比較P<0.05;##與模型組比較P<0.01;△P<0.01與三黃漱口液低劑量組比較。

3 討論

牙周炎是一種世界性常見(jiàn)疾病,其全球年齡標(biāo)準(zhǔn)化患病率為11.2%[8]。同時(shí),口腔病灶中的微生物及其代謝產(chǎn)物可進(jìn)入身體其他組織器官,誘發(fā)多種疾病,如糖尿病、早產(chǎn)及低體重兒、心血管疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[9]。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,給予三黃漱口液的牙周炎大鼠牙周組織與模型組相比,形態(tài)學(xué)發(fā)生了明顯改變,主要表現(xiàn)為牙周組織的炎性浸潤(rùn)明顯減少,成纖維細(xì)胞增生活躍,初步驗(yàn)證了三黃漱口液對(duì)牙周炎的治療作用。文獻(xiàn)[6]提到,牙周炎是一種由福賽擬桿菌、伴放線聚集桿菌和牙齦卟啉單胞菌等革蘭氏陰性厭氧菌感染引起的慢性炎癥性疾病,LPS是牙周炎病原菌的重要致病因素。TLR4是模式識(shí)別受體家族的關(guān)鍵受體之一,是LPS的主要受體,與牙周炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]。有研究[11]顯示,LPS處理過(guò)的人牙周膜細(xì)胞(human periodontal ligament cell,hPDLC)中TLR4的表達(dá)顯著上升,且有研究者[12-13]發(fā)現(xiàn)牙周炎病人的唾液和血漿中的TLR4表達(dá)明顯提高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,牙周炎模型組TLR4的蛋白表達(dá)明顯升高,與對(duì)照組相比一致。TLR4通路的激活可以增強(qiáng)NF-κB的活性,從而促進(jìn)炎癥因子的生成[14-15]。NF-κB是一種公認(rèn)的轉(zhuǎn)錄因子,可以調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生,包括TNF-α、IL-1、IL-8和IL-10等[16]。同時(shí)有研究者報(bào)道,TLR4表達(dá)的增加與NF-κB的激活相關(guān),以響應(yīng)TLR4配體,導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子水平升高[17]。在hPDLC炎癥反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中,LPS誘導(dǎo)后,miR-146a 通過(guò)抑制 TLR4 信號(hào)途徑抑制炎癥反應(yīng),并降低炎性細(xì)胞因子 NF-κB 的表達(dá)[18]。本研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,牙周炎模型組NF-kB蛋白表達(dá)明顯升高,促炎因子IL-8的水平明顯升高,同時(shí)抗炎因子IL-10的水平明顯降低。三黃漱口液給藥后,牙周炎大鼠的牙周組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)和促炎因子IL-8的水平均降低,而抗炎因子IL-10的水平有所升高,這表明三黃漱口液可能通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4-NF-κB通路發(fā)揮對(duì)牙周炎的治療作用。

綜上所述,本研究結(jié)果證明三黃漱口液對(duì)牙周炎具有一定的治療作用,其作用機(jī)制可能包括降低TLR4水平,調(diào)節(jié)TLR4-NF-κB通路,促進(jìn)抗炎因子IL-10的生成和抑制促炎因子IL-8的生成。