涂韻之,傅 芬,陳秋連

(1.新余市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,江西 新余 338000; 2.南昌大學第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,南昌 330006)

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤,指的是起源于子宮頸的惡性腫瘤。在女性惡性腫瘤中,宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌,占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率的75%～90%左右[1]。在我國,宮頸癌的發(fā)病率和病死率呈上升趨勢,特別是在欠發(fā)達國家,宮頸癌的發(fā)病率和病死率均高于發(fā)達國家[2-3]。目前,宮頸癌的臨床治療主要采用手術(shù)、放療、化療等綜合治療方式,其中化療主要以鉑類藥物為主[4]。盡管目前的治療方法一定程度上改善了患者的生存率,但仍存在術(shù)后復發(fā)和耐藥性等問題,因此尋找有效治療宮頸癌的方法和手段仍是當前臨床面臨的難題。

鈣黏蛋白(cadherin,CDH)是一種跨膜糖蛋白,位于細胞表面,對細胞間的黏附功能發(fā)揮著重要作用。其中CDH3是鈣黏蛋白家族的一員[5]。有研究[6]表明,CDH3在癌癥發(fā)展中具有雙向作用。例如,在胃癌、胰腺癌和乳腺癌等腫瘤中,CDH3可以促進癌細胞的生長和擴散,而在肝細胞癌、非小細胞肺癌和黑色素瘤中,CDH3則抑制了腫瘤的發(fā)生。目前還沒有文獻報道CDH3在宮頸癌中的作用機制。

磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(protein serine threonine kinase,Akt)信號通路是促進存活、抗凋亡的經(jīng)典信號傳遞途徑,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及放療抵抗密切相關,是近年來腫瘤分子生物學研究的熱點領域[7]。有研究[8-9]表明,PI3K/Akt信號傳遞通路在多種人類惡性腫瘤中異?；罨?如宮頸癌、卵巢癌和胰腺癌等。本研究旨在探究CDH3基因表達變化對宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響,以及是否通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路來發(fā)揮作用。這將為揭示宮頸癌的分子機制和臨床治療提供新的實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)及樣本來源

從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)獲取宮頸癌患者的基因表達和相關臨床數(shù)據(jù)。

從2019年至2021年間于江西省新余市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科接受治療的10例宮頸癌患者手術(shù)中獲取活檢樣本(宮頸癌及癌旁組織)。樣本清洗后放入編號的離心管中,于液氮罐中儲存。人宮頸癌HeLa和C33A細胞系均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心,進行常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2 基因差異表達、生存和KEGG通路分析

使用R軟件的“l(fā)imma”包對宮頸癌患者的CDH家族基因的表達數(shù)據(jù)進行貝葉斯差異分析,得到差異表達基因,通過R軟件的“ggplot2”包繪制基因表達情況的箱式圖。將表達上調(diào)的CDH基因與生存相關的基因取交集,通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com),用best cutoff算法分析交集基因表達對患者總生存期(OS)的影響。根據(jù)交集基因表達的中位數(shù)將宮頸癌患者分為高表達組和低表達組,通過R軟件的“CluserProfiler”包對篩選出的基因進行KEGG通路分析。

1.3 qPCR

用Trizol試劑提取樣本總RNA。使用TransScript?Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)合成cDNA。使用PerfectStart?Green qPCR SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進行qPCR。目的基因引物序列為CDH3-F:5′-CAGGTGCTGAACATCACGGACA-3′;CDH3-R:5′-CTTCAGGGACAAGACCACTGTG-3′。內(nèi)參基因引物序列為GAPDH-F:5′-TCCACTGGCGTCTTCACC-3′;GAPDH-R:5′-GGCAGAGATGATGACCCTTTT-3′。

1.4 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人宮頸癌HeLa和C33A細胞系均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心,均培養(yǎng)于添加了10%胎牛血清的Eagle最低必需培養(yǎng)基(北京普邁精醫(yī)科技有限公司)中,在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

構(gòu)建sh-CDH3#1、sh-CDH3#2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞,干擾CDH3表達;構(gòu)建CDH3-OE質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞,增強CDH3表達;用sh-NC空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞,作為對照。

1.5 CCK8細胞增殖實驗

將轉(zhuǎn)染了sh-NC、sh-CDH3#1和sh-CDH3#2質(zhì)粒的細胞以相同的密度接種到新培養(yǎng)孔,培養(yǎng)0、1、2、3、4 d后加入CCK8工作液(CCK8溶液：培養(yǎng)基=1：10),37 ℃培養(yǎng)箱中孵育3 h后,測定450 nm 處的吸光值。

1.6 Transwell檢測細胞遷移、侵襲

將轉(zhuǎn)染了sh-NC、sh-CDH3#1和sh-CDH3#2質(zhì)粒的細胞接種到含有RPMI1640培養(yǎng)基(2%胎牛血清)的Transwell上室中,下室中加入胎牛血清濃度為20%的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后,加入4%多聚甲醛固定細胞15 min。擦去膜上側(cè)細胞,下側(cè)細胞用1%結(jié)晶紫溶液染色,用PBS洗去染色液后在顯微鏡下拍照分析細胞遷移。

侵襲實驗方法與遷移實驗基本相同,接種細胞前在Transwell上室中加入100 μL濃度為1 mg·mL-1的Matrigel,37 ℃孵育3～5 h使其凝固。

1.7 Western blot檢測

在轉(zhuǎn)染72 h收獲細胞,通過10% SDS/PAGE分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。封閉后,將膜在4 ℃下與一抗孵育過夜。洗膜后,再次將蛋白與二抗在室溫下孵育1 h,再次洗膜。最后,使用ChemiDocTMXRS顯影系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)檢測目標蛋白。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 CDH家族基因在宮頸癌患者中的表達情況

共從TCGA數(shù)據(jù)庫獲取547例宮頸癌患者和35例健康女性的基因表達數(shù)據(jù),分析結(jié)果顯示CDH15、CDH18、CDH24和CDH3在宮頸癌患者中表達上調(diào),CDH11、CDH4、CDH23、CDH5、CDH19、CDH12、CDH22、CDH8和CDH2表達下調(diào)(圖1)。把差異上調(diào)的CDH基因和生存相關的CDH基因取交集,得到2個基因:CDH3和CDH18(圖2)。而CDH3的表達量顯著高于CDH18(圖3),因此選擇CDH3作為目的基因進行后續(xù)實驗。

圖1 CDH家族基因在宮頸癌患者中的表達火山圖

圖2 表達上調(diào)與生存相關的CDH基因的韋恩圖 圖3 差異表達上調(diào)基因的表達量箱式圖

2.2 CDH3表達對宮頸癌患者OS的影響

生存分析結(jié)果顯示,與CDH3低表達組相比,CDH3高表達組患者的預后生存情況顯著較差(P=0.029)。見圖4。

2.3 CDH3在宮頸癌組織中高表達

qPCR結(jié)果顯示,宮頸癌組織中的CDH3表達水平顯著高于對應的癌旁組織(P<0.000 1)。見圖5。

2.4 CDH3敲低抑制宮頸癌細胞增殖

CCK8細胞增殖實驗結(jié)果顯示,HeLa和C33A的sh-CDH3#1組和sh-CDH3#2組的增殖能力均顯著低于NC組(P<0.01或P<0.001),CDH3敲低明顯降低了宮頸癌細胞的增殖能力。見圖6。

2.5 CDH3敲低對宮頸癌細胞遷移、侵襲能力的影響

Transwell遷移實驗結(jié)果顯示,與sh-NC組相比,sh-CDH3#1和sh-CDH3#2組的HeLa和C33A細胞的遷移能力顯著降低(P<0.001或P<0.000 1,圖7A)。侵襲實驗結(jié)果顯示,sh-CDH3#1和sh-CDH3#2組細胞侵襲能力較sh-NC組顯著降低(P<0.001或P<0.000 1,圖7B)。以上結(jié)果表明,敲低CDH3基因會抑制宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力。

A:敲低CDH3降低HeLa和C33A細胞的遷移能力;B:敲低CDH3降低HeLa和C33A細胞的侵襲能力。*P<0.001,**P<0.000 1。

2.6 CDH3通過PI3K/AKT通路影響宮頸癌細胞活動

KEGG分析結(jié)果顯示,CDH3在PI3K/AKT通路顯著富集(圖8A),提示CDH3通過調(diào)控PI3K/AKT通路影響宮頸癌細胞活動。Western blot實驗結(jié)果驗證了KEGG分析的結(jié)論:與NC組相比,sh-CDH3組CDH3表達水平降低,CDH3-OE組CDH3表達水平增加,表明HeLa和C33A細胞轉(zhuǎn)染均有效(圖8B);與NC組相比,shCDH3組P-PI3K和P-AKT表達量降低,PI3K和AKT表達無明顯變化,而CDH3-OE組P-PI3K和P-AKT表達量升高,PI3K和AKT表達無明顯變化(圖8C)。上述結(jié)果表明CDH3通過促進PI3K和AKT的磷酸化調(diào)控PI3K/AKT通路,進而影響宮頸癌細胞的活動。

A:CDH3的KEGG通路分析;B:CDH3敲低和過表達后,HeLa和C33A細胞中CDH3的表達水平;C:CDH3的敲低和過表達對PI3K/AKT通路相關蛋白的影響。

3 討論

宮頸癌是一種高發(fā)病率的癌癥,其中人乳頭瘤病毒是主要致病因素。盡管宮頸癌的治療已經(jīng)在多個方面取得了突破性進展,但大多數(shù)患者的預后仍然不理想,治療方案常常存在嚴重的副作用[10]。因此,探究影響宮頸癌預后的因素和機制顯得十分必要。CDH3屬于鈣素家族的一員,最初于1986年由國外學者NOSE等在小鼠胚胎發(fā)育中發(fā)現(xiàn)。該家族是一類重要的細胞間黏附分子,參與細胞極性和細胞分化的調(diào)節(jié),有助于維持組織內(nèi)的穩(wěn)態(tài)[11-13]。在人類正常組織中,只有胸腺和胎兒大腦中檢測到CDH3的低表達水平,然而在多種人類腫瘤組織中檢測到CDH3高表達[14]。已有研究[15]明確表明,CDH3參與胚胎發(fā)育和成體組織結(jié)構(gòu)中細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持過程,對細胞分化、形態(tài)、極性、生長和遷移等過程具有重要意義。

本研究通過差異表達分析發(fā)現(xiàn),CDH3和CDH18是與宮頸癌患者生存相關的2個基因。盡管這兩個基因都與生存相關,但CDH3的表達量更高,因此可以考慮CDH3對宮頸癌生存影響更大。此前的研究表明,CDH3在高分化胃癌組織中高表達,并被認為是胃癌患者預后的一個標志物[16-17]。本研究的預后生存分析也顯示,CDH3高表達組的患者預后明顯更差(P=0.029),這進一步證實了CDH3的表達差異會影響患者預后。因此,筆者收集了宮頸癌臨床患者的10對癌及癌旁組織,并檢測了CDH3的基因表達水平。結(jié)果顯示,CDH3在宮頸癌組織中的表達量顯著高于癌旁組織,這與筆者的生信分析結(jié)果一致。此外,其他研究[18-19]也表明CDH3在結(jié)直腸癌組織和患者血漿中高表達,并且CDH3的過表達會促進多種癌細胞的遷移和侵襲[20-21],包括胰腺導管癌[22]。針對CDH3在宮頸癌中的作用,本研究細胞實驗顯示,敲低CDH3表達可以抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。這些結(jié)果表明CDH3在宮頸癌中具有促進癌細胞發(fā)生和發(fā)展的作用。因此,CDH3有望成為宮頸癌診斷和治療的重要靶點。

PI3K/Akt信號通路參與調(diào)控細胞周期的各個進程,促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展,并且在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色[23]。當PI3K受到上游信號(如生長因子)等刺激后,能夠激活Akt。激活的Akt會進一步激活下游信號分子,發(fā)揮對腫瘤細胞多生物學活性的調(diào)控作用[24]。根據(jù)CDH3的表達中位數(shù)將患者分為高表達和低表達組,進行KEGG通路分析,發(fā)現(xiàn)CDH3與PI3K/Akt信號通路密切相關。隨后,筆者通過Western blot實驗證實,敲低CDH3后,P-PI3K和P-AKT表達量降低。過表達CDH3后,P-PI3K和P-AKT表達量升高。這些結(jié)果說明CDH3的表達變化會影響PI3K/Akt信號通路的激活。

本研究證實CDH3在宮頸癌組織中顯著高表達,并且與患者不良預后相關。通過細胞實驗證實CDH3在宮頸癌細胞中高表達,敲低CDH3表達會抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲,這種調(diào)控作用與PI3K/Akt信號通路的激活有關。這些發(fā)現(xiàn)可能為未來的宮頸癌臨床治療提供重要的理論基礎。然而,CDH3的具體作用機制尚不明確,需要進一步探索和驗證。