王 逍,李 慶,黃曉峰,王秋月,張卓然

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腦病醫(yī)院一病區(qū),陜西 咸陽 712000; 2.西安醫(yī)學(xué)院附屬寶雞醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,陜西 寶雞 721006; 3.陜西省中醫(yī)醫(yī)院老年病科,西安 710000)

腦卒中是中老年人高發(fā)的急性腦血管疾病,對患者的生命健康構(gòu)成極大威脅。腦卒中的起因是腦血管破裂或阻塞,導(dǎo)致腦部血流無法正常循環(huán),進而造成腦組織發(fā)生氧化應(yīng)激和炎癥損傷。腦卒中造成的損害通常是不可逆的,極有可能導(dǎo)致患者身體功能障礙,甚至死亡[1]。腦缺血性卒中(CIS) 是最常見且最危險的卒中類型[2],約占所有卒中病例的60%～70%,主要由頸內(nèi)動脈和椎動脈的閉塞或狹窄引起。目前,CIS的臨床診斷仍較為復(fù)雜,只能通過相關(guān)血液標志物結(jié)合頭部影像來判斷,治療方案以手術(shù)為主。有相當數(shù)量的CIS患者因無法得到及時、快速和有效的治療,因而遭受不可逆的神經(jīng)損傷甚至生命危險[3]。因此,尋找新的CIS診療方案是臨床研究的熱門課題。

MicroRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA(約22 nt),其可通過與mRNA的3′端UTR結(jié)合來抑制靶基因的生物學(xué)功能。miRNAs的異常表達與包括腦血管病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。循環(huán)miRNA也是癌癥、卒中和2型糖尿病等疾病的外周生物標志物。血清循環(huán)miRNA-221-3p和miRNA-382-5p可用作非侵入性診斷CIS的潛在生物標志物,miR-34b可以防止局灶性腦缺血再灌注損傷(IRI)[5]。 miRNAs在血清中穩(wěn)定表達,循環(huán)miRNAs的檢測方法靈敏準確,這意味著miRNAs具有作為診斷各種疾病的生物標志物的潛力。有研究[6]揭示了miRNAs在CIS患者腦組織和外周血中的異常表達,提示miRNAs與CIS的發(fā)病機制、診斷和預(yù)后有關(guān)。本研究評估CIS患者外周血miRNAs差異性表達與患者臨床預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2019年6月至 2021年6月于陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院就診的CIS患者36例,健康體檢者25例。納入標準:1)檢查確診為CIS;2)病例資料完整;3)患者或家屬對本研究知情同意。排除標準:1)合并腫瘤、其他心腦血管疾病、自身免疫缺陷病、感染性疾病或精神疾病者;2)器官功能障礙或藥物過敏者;3)入院前3個月內(nèi)接受過抗生素或手術(shù)治療者;4)懷孕或哺乳期患者;5)轉(zhuǎn)診患者;6)預(yù)期壽命<1個月者。本院倫理委員會審核批準了本研究。

收集記錄患者年齡、性別、美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評分、梗死體積、葡萄糖(GLU)、總膽固醇(TCH)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)[Lp(a)]。分別在卒中發(fā)病后24 h和7 d進行2次NIHSS評估,以評價短期預(yù)后。CIS發(fā)病后,于1個月、3個月、6個月和12個月進行回訪,以評價長期預(yù)后。

1.2 CIS患者外周血差異性表達miRNA篩選

健康體檢者和CIS患者的血液樣本在采集后4 h內(nèi)進行預(yù)處理,將血清在4 ℃下以 12 000 rpm離心10 min,儲存于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｊ褂胢iRNeasy Micro Kit(美國QIAGEN公司)提取CIS患者外周血miRNA。選擇3例健康體檢者和3例CIS患者使用高通量測序(HTS)分析和篩選差異性表達的miRNA,在CIS患者發(fā)病第2天(急性期)和第10天(恢復(fù)期)分別提取2次樣本。HTS委托北京諾和致遠生物科技有限公司完成,測序方式為HiSeq/MiSeq。

1.3 定量實時聚合酶鏈式反應(yīng)(qPCR)

使用miRNA提取分離試劑盒(天根生化科技公司)提取血清樣本中的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄,然后使用RealMasterMix Probe試劑盒(天根生化科技公司)進行qPCR檢測。反應(yīng)系統(tǒng)和循環(huán)條件:8 μL 2.5×RealMasterMix,正向引物和反向引物各1 μL(5 pmol·L-1,由Thermo Fisher Scientific公司設(shè)計)、1 μL 20×Probe Enhancer溶液、1 μL模板溶液和7 μL雙蒸水。反應(yīng)條件:94 ℃ 2 min,94 ℃ 20 s,60 ℃ 30 s,68 ℃ 1 min,重復(fù)43個循環(huán)。miRNA的表達水平以2-△△Ct分析,內(nèi)參為U6。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CIS患者外周血miRNA的差異性表達

HTS結(jié)果顯示,急性期和恢復(fù)期的CIS患者相比較,其外周血樣本中共有59個差異性表達的miRNA,其中上調(diào)30個,下調(diào)29個,包括miR-328-3p、miR-1301-3p、miR-320a等血清外泌體miRNA(圖1A)。急性期CIS患者與健康對照組相比,共有27個差異表達的miRNA,其中15個上調(diào)和12個下調(diào)的miRNA(圖1B)。

A:基于缺血性腦卒中患者急性期和恢復(fù)期之間不同表達 miRNA 的倍數(shù)變化和后驗概率火山圖;B:3組miRNA的表達差異熱圖(SE:急性期CIS患者,n=3;SL:恢復(fù)期CIS患者,n=3;N:健康對照者,n=3)。

2.2 CIS患者與健康體檢者的臨床特征比較

將CIS患者和健康體檢者的臨床資料進行比較,結(jié)果顯示2組GLU、TCH水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),2組HDL-C、LDL-C、miR-328-3p和Lp(a)水平均有明顯差異(P<0.05),見表1。

表1 CIS患者與健康體檢者的臨床特征比較

2.3 CIS患者外周血miR-328-3p的表達水平與臨床特征的相關(guān)性

與健康體檢者比較,CIS患者外周血miR-328-3p表達水平較低(P<0.05)。此外,腦梗死體積≥10 cm3的CIS患者外周血miR-328-3p表達水平明顯低于梗死體積<10 cm3的患者(P<0.05);且急性期患者外周血miR-328-3p水平明顯低于恢復(fù)期患者(P<0.05);短期預(yù)后不良的患者與短期預(yù)后良好的患者相比,miR-328-3p水平較低(P<0.05)。此外,急性期CIS患者外周血miR-328-3p水平與NIHSS評分相關(guān)(r=-0.694,P<0.05),恢復(fù)期CIS患者外周血miR-328-3p水平亦與NIHSS評分相關(guān)(r=-0.559,P<0.05)。見圖2。

A:不同梗死體積的CIS患者的miR-328-3p表達水平;B:CIS急性期、恢復(fù)期和健康對照組的miR-328-3p表達水平;C:miR-328-3p在短期預(yù)后良好和短期預(yù)后不佳患者中的表達情況(良好,n=28;不佳,n=8);D—E:miR-328-3p的表達水平與NIHSS評分的相關(guān)性。

2.4 外周血miR-328-3p的表達水平對CIS患者預(yù)后的預(yù)測價值

繪制外周血miR-328-3p預(yù)測CIS患者預(yù)后的ROC曲線,結(jié)果顯示急性期miR-328-3pAUC為0.920(95%CI:0.820～1.000),恢復(fù)期miR-328-3p的AUC為0.833(95%CI:0.701～0.965),均P<0.05。見圖3。

圖3 外周血中miR-328-3p表達水平對CIS

3 討論

CIS是一種全球高發(fā)的危重疾病,是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致成人殘疾的主要原因之一,由于其致病因素和診療方案的復(fù)雜性,CIS的潛在危險十分顯著[7]。深入挖掘CIS發(fā)病的分子機制是臨床研究的熱點。本研究利用HTS技術(shù)探索了CIS患者外周血miRNA的差異性表達及其與患者臨床預(yù)后的關(guān)系。

miRNA存在于人體血液、體液和組織中,能夠通過相對方便快捷的方法進行檢測[8]。傳統(tǒng)CIS的診斷過程復(fù)雜,不僅耗費大量的時間,而且經(jīng)濟成本高昂,無法實現(xiàn)大規(guī)模的臨床篩查,這使得CIS的早期診斷率較低。而早期診斷和及時治療對降低CIS患者高死亡率和改善其預(yù)后具有關(guān)鍵性意義[9]。有研究[10]表明,miRNA是CIS相關(guān)細胞生物學(xué)過程的關(guān)鍵調(diào)控者。本研究檢測了CIS患者和健康體檢者外周血中miRNA的表達情況,CIS患者急性期和恢復(fù)期比較得到59個差異性表達的miRNA,其中上調(diào)30個,下調(diào)29個,其中包括血清外泌體miRNA:miR-328-3p、miR-1301-3p和miR-320a。

CIS是由一系列病理生理事件組成的,包括炎癥、氧化應(yīng)激和細胞凋亡[11]。外周血miR-124可作為CIS的分子標志物,它可通過JNK信號通路加速CIS大鼠內(nèi)皮祖細胞的增殖[12]。有證據(jù)[13]表明miR-24可抑制CIS大鼠的腦組織細胞凋亡。電針治療可以通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子家族基因表達來平衡miR-328的水平,以促進缺血性大腦皮層組織的血管生成[14]。本研究發(fā)現(xiàn)CIS患者外周血miR-328-3p水平顯著低于健康患者,且與卒中梗死體積呈負相關(guān)。此外,外周血miR-328-3p水平還與CIS患者短期預(yù)后相關(guān),與短期預(yù)后良好的患者相比,短期預(yù)后較差的患者外周血miR-328-3p的水平較低。因此,外周血miR-328-3p水平可能是CIS的預(yù)后因素。

NIHSS是評價腦血管病神經(jīng)損傷程度的重要觀察指標之一:NIHSS評分越高,患者的神經(jīng)損傷越嚴重[15]。經(jīng)過Pearson相關(guān)系數(shù)分析,本研究發(fā)現(xiàn)CIS患者外周血miR-328-3p水平與其NIHSS評分呈負相關(guān)。此外,通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)急性期CIS患者外周血miR-328-3p水平AUC為0.92,miR-328-3p相對表達量<0.515時,預(yù)測CIS的敏感度和特異度分別為78.6%和53.6%,且敏感度隨著患者病情的嚴重程度逐漸升高。因此可初步確定外周血miR-328-3p具有預(yù)測CIS的潛力。

綜上所述,CIS患者和健康受試者外周血內(nèi)多種miRNA存在表達差異,其中miR-328-3p在CIS的預(yù)后預(yù)測中具有一定價值,具有成為新的CIS生物標志物的潛力。但本研究為單中心、小樣本研究,所獲結(jié)論尚需后續(xù)多中心、大樣本研究證實。