王長(zhǎng)峰,陳顯俊,朱 瀅,歐 躍,劉如恩,2

(1.江西省人民醫(yī)院、南昌醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,南昌 330006; 2.北京大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)外科,北京 100044; 3.南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,南昌 330006)

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤,全球年發(fā)病率約6/10萬(wàn),男女比例約為1.6：1[1]。在病理學(xué)上,膠質(zhì)瘤可分為星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)瘤、室管膜瘤或混合膠質(zhì)瘤,其中星形細(xì)胞瘤最常見[2]。依據(jù)世界衛(wèi)生組織的劃分,神經(jīng)膠質(zhì)瘤根據(jù)其惡性程度分為四級(jí)(Ⅰ—Ⅳ)。其中,Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤是低級(jí)別腫瘤,如果能完全切除,預(yù)后良好;而Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤屬于高級(jí)別腫瘤,惡性度高,切除困難,易復(fù)發(fā)[3]。膠質(zhì)瘤發(fā)展到晚期(Ⅳ)時(shí)可能演變?yōu)槟z質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)。目前手術(shù)切除、化療和放射治療是神經(jīng)膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方法,但術(shù)后膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)率高,預(yù)后較差。在傳統(tǒng)治療模式遭遇瓶頸的現(xiàn)狀下,基于組織學(xué)結(jié)合分子標(biāo)記物的膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)后評(píng)估和治療已成為疾病管理的重要里程碑。相關(guān)研究[4]已經(jīng)表明,膠質(zhì)瘤的形成與細(xì)胞信號(hào)通路異常密切相關(guān),因此尋找相關(guān)分子標(biāo)記物在膠質(zhì)瘤的診治過程中具有重要意義。

ZMPSTE24是一種膜鋅金屬蛋白酶,最初在酵母中發(fā)現(xiàn),是層黏連蛋白A成熟過程中所需的酶[5]。有研究[6]表明,ZMPSTE24缺陷小鼠的細(xì)胞表現(xiàn)出延遲的DNA損傷反應(yīng)、非整倍體增加和基因組不穩(wěn)定性升高,是癌細(xì)胞的行為特征。ZMPSTE24通過突變途徑和表達(dá)途徑共同參與具有MSI-H表型的胃癌和結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[7]。ZMPSTE24是參與人類早衰癥病理機(jī)制的關(guān)鍵蛋白酶,同時(shí)參與抗病毒免疫途徑的組成,進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫水平[8]。目前,ZMPSTE24表達(dá)水平對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者的意義鮮有研究。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析中國(guó)膠質(zhì)瘤基因組圖譜計(jì)劃(Chinese glioma genome atlas,CGGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)[9],探究ZMPSTE24在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從CGGA中下載325例膠質(zhì)瘤患者的臨床數(shù)據(jù)和mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)[9-10]。提取ZMPSTE24基因表達(dá)量與臨床數(shù)據(jù)配對(duì)合并,同時(shí)剔除部分臨床數(shù)據(jù)缺失的病例(32例)。使用R軟件(4.2.1)提取ZMPSTE24基因的表達(dá)量,使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析2組之間基因表達(dá)水平的差異。根據(jù)膠質(zhì)瘤患者的發(fā)病狀態(tài),分為原發(fā)性膠質(zhì)瘤(210例)和復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤(83例)。依據(jù)ZMPSTE24基因在原發(fā)性膠質(zhì)瘤患者組織中表達(dá)量的中位值(18.61)將入選病例分為高表達(dá)組(105例)和低表達(dá)組(105例),用于進(jìn)一步分析ZMPSTE24基因表達(dá)量在不同類型原發(fā)性膠質(zhì)瘤患者中的臨床意義。ZMPSTE24高表達(dá)和低表達(dá)組原發(fā)性膠質(zhì)瘤患者的基線資料比較見表1。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有統(tǒng)計(jì)分析均使用R軟件(4.2.1)進(jìn)行。臨床因素與ZMPSTE24表達(dá)之間的相關(guān)性采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)和Logistic回歸進(jìn)行評(píng)估。使用Cox回歸和Kaplan-Meier方法確定與低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者總生存率相關(guān)的臨床因素。進(jìn)一步進(jìn)行時(shí)間依賴性受試者操作特征(ROC)曲線分析,以確定ZMPSTE24的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。多變量Cox分析用于探討ZMPSTE24表達(dá)在生存預(yù)測(cè)中的作用以及其他臨床特征(年齡、分級(jí)、性別)。采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)連續(xù)變量的正態(tài)性。正態(tài)分布數(shù)據(jù)的結(jié)果以平均值(標(biāo)準(zhǔn)差)表示,非參數(shù)數(shù)據(jù)的結(jié)果則以中值(四分位間距或IQR)表示。分類變量以計(jì)數(shù)(百分比)表示,并使用Pearsonχ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 功能富集分析

為了研究ZMPSTE24表達(dá)影響原發(fā)性膠質(zhì)瘤進(jìn)展的潛在機(jī)制,使用R軟件(V.4.2.1)進(jìn)行基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)篩選ZMPSTE24高表達(dá)和ZMPSTE24低表達(dá)組之間存在顯著差異的生物通路[11]。對(duì)于每一個(gè)分析,基因組排列被執(zhí)行1000次。假發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05和調(diào)整后P<0.05的基因組被認(rèn)為顯著富集,同時(shí)鑒定出顯著富集的基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路。

1.4 共表達(dá)分析

用limma軟件包收集與ZMPSTE24表達(dá)相關(guān)的基因。共表達(dá)的閾值為相關(guān)指數(shù)>0.5和P<0.001。此外,利用Corrplot和Circlize軟件包描述與ZMPSTE24共表達(dá)的基因。

1.5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與樞紐基因的選擇

ZMPSTE24被導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(版本:11.5b,https://string-db.org),以識(shí)別物理和功能相互作用的基因和蛋白質(zhì)[12]。以綜合評(píng)分>0.45構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),并通過Cytoscape進(jìn)行進(jìn)一步可視化。利用Cytoscape version 3.9.1(http://www.cytoscape.org/)的CytoHubba插件,通過最大集團(tuán)中心度(maximal clique centrality,MCC)算法篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中交互作用程度最高的前5個(gè)中心性基因。

1.6 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析

采用TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)分析ZMPSTE24表達(dá)與B細(xì)胞、CD+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、髓系樹突狀細(xì)胞(myeloid dendritic cells,DCs)的關(guān)系[13]。P<0.001為ZMPSTE24與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)顯著相關(guān)的閾值。

1.7 免疫組織化學(xué)分析

應(yīng)用來自人類蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)(The human protein atlas,HPA,http://www.proteinatlas.org)的免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)比較正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中ZMPSTE24的蛋白表達(dá)水平。

1.8 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)

臨床收集的膠質(zhì)瘤標(biāo)本病理診斷分別為H1(Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤)、H2(Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤)、H3(Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤)、H4(Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤)、H5(Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤)。將液氮中的病理組織用研缽研磨后,使用蛋白提取液在4 ℃、12 000 g的條件下離心15 min。提取上清保存于-80 ℃進(jìn)行分析。蛋白濃度測(cè)定采用BCA法(Beyotime)。等量的蛋白質(zhì)裝載在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳,然后通過電泳轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。用5%牛血清白蛋白在室溫下孵育2 h,ZMPSTE24一抗(FineTest)在4 ℃下孵育過夜。將Tris緩沖鹽水與吐溫-20洗滌液混合3次(5 min·次-1),加入1：20萬(wàn)稀釋雙熒光抗體,室溫孵育1 h。使用SPECTRA MAX SoftMax Pro分析軟件檢測(cè)薄膜上各波段的光密度(OD)信號(hào)強(qiáng)度。用β-肌動(dòng)蛋白作為負(fù)荷控制和標(biāo)準(zhǔn)化。

2 結(jié)果

2.1 ZMPSTE24的表達(dá)與原發(fā)性膠質(zhì)瘤臨床特征的關(guān)系

分析CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中210例原發(fā)性膠質(zhì)瘤患者的mRNA表達(dá)譜,結(jié)果表明ZMPSTE24的表達(dá)量與原發(fā)性膠質(zhì)瘤患者的WHO分級(jí)、年齡分組、是否化療、IDH分型高度相關(guān)(均P<0.001),與性別、是否放療無相關(guān)性(均P>0.05)。見圖1。

A:ZMPSTE24在不同腫瘤分級(jí)患者中的表達(dá);B:ZMPSTE24在不同年齡患者中的表達(dá);C:ZMPSTE24在不同性別患者中的表達(dá);D:ZMPSTE24在是否化療患者中的表達(dá);E:ZMPSTE24在是否放療患者中的表達(dá);F:ZMPSTE24在不同IDH分型患者中的表達(dá)。

2.2 ZMPSTE24的表達(dá)與原發(fā)性膠質(zhì)瘤患者總生存率的關(guān)系

在原發(fā)性膠質(zhì)瘤患者中,ZMPSTE24的表達(dá)量與總生存率相關(guān),ZMPSTE24低表達(dá)組的總生存時(shí)間較ZMPSTE24高表達(dá)組明顯延長(zhǎng)(圖2A)。在Ⅱ、Ⅲ級(jí)原發(fā)性膠質(zhì)瘤患者和Ⅳ級(jí)原發(fā)性膠質(zhì)瘤患者中,ZMPSTE24表達(dá)水平與總生存率同樣相關(guān)(圖2B—C)。預(yù)測(cè)原發(fā)性膠質(zhì)瘤患者1、3和5年預(yù)后的ZMPSTE24曲線下面積(AUC)值分別為0.768、0.850和0.858(圖2D)。分析Ⅱ、Ⅲ級(jí)原發(fā)性膠質(zhì)瘤患者和Ⅳ級(jí)原發(fā)性膠質(zhì)瘤患者1、3和5年預(yù)后的ZMPSTE24曲線下面積(AUC)值分別為0.853、0.810、0.810和0.545、0.776、0.748(圖2E—F)。提示ZMPSTE24預(yù)測(cè)Ⅱ、Ⅲ級(jí)原發(fā)性膠質(zhì)瘤患者生存期的能力更強(qiáng)。

A:ZMPSTE24表達(dá)與原發(fā)性膠質(zhì)瘤患者總生存率的相關(guān)性;B:ZMPSTE24表達(dá)與Ⅱ、Ⅲ級(jí)患者總生存率的相關(guān)性;C:ZMPSTE24表達(dá)與Ⅳ級(jí)患者總生存率的相關(guān)性;D:原發(fā)性膠質(zhì)瘤患者的時(shí)間依賴性ROC曲線;E:Ⅱ、Ⅲ級(jí)患者的時(shí)間依賴性ROC曲線;F:Ⅳ級(jí)患者的時(shí)間相關(guān)ROC曲線。

2.3 原發(fā)性膠質(zhì)瘤的單因素和多因素COX回歸分析

單因素Cox回歸分析顯示:年齡、腫瘤分級(jí)、是否化療、IDH分型和ZMPSTE24表達(dá)量與總生存期存在相關(guān)關(guān)系(均P<0.05)。性別和是否放療與總生存期無相關(guān)關(guān)系(均P>0.05)。多因素Cox回歸分析顯示:腫瘤分級(jí)、IDH分型和ZMPSTE24表達(dá)量與總生存期存在相關(guān)關(guān)系(均P<0.05);年齡、性別、是否化療、是否放療與患者總生存期無相關(guān)關(guān)系(均P>0.05)。見表2。

表2 原發(fā)性膠質(zhì)瘤的單因素和多因素COX回歸分析結(jié)果

2.4 GSEA富集分析

與MTMR14高表達(dá)密切相關(guān)的6個(gè)KEGG途徑為:基底轉(zhuǎn)錄因子、RNA降解、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用、N-多糖生物合成、細(xì)胞周期(圖3)。各富集通路富集分?jǐn)?shù)及校正q值見表3。

基底轉(zhuǎn)錄因子、RNA降解、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用、N-多糖生物合成、細(xì)胞周期與MTMR14表達(dá)正性相關(guān)。

表3 基于ZMPSTE24表達(dá)的KEGG富集分析

2.5 ZMPSTE24的共表達(dá)分析

圖4顯示與ZMPSTE24負(fù)相關(guān)的前3個(gè)基因以及正相關(guān)的前6個(gè)基因。結(jié)果表明,ZMPSTE24的表達(dá)水平與SLC35F5、FPGT、SLC39A1、SF3A3、SEC22B、SERBP1呈正相關(guān)關(guān)系(Cor>0.5,P<0.001),與MT-ND4、MT-RD4、GABBR1呈負(fù)相關(guān)(Cor<-0.5,P<0.001)。

2.6 蛋白質(zhì)相互作用和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析

ZMPSTE24的蛋白網(wǎng)絡(luò)圖見圖5A。通過CytoHubba插件確定的前5個(gè)中心性基因,并按照MCC評(píng)分進(jìn)行排序,確定連接最緊密的蛋白(圖5B)。TIMER2.0顯示ZMPSTE24的表達(dá)與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、髓系樹突狀細(xì)胞(DCs)有顯著差異(partiral.cor>0.45,P<0.001)(圖5C)。

A:ZMPSTE24的蛋白網(wǎng)絡(luò)圖,連線表示蛋白之間存在相互作用,線段粗細(xì)表示蛋白相互作用的程度;B:排名前5位的中心性基因分別為ZMPSTE24、ICMT、RCE1、FNTA和LMNB2(紅色的強(qiáng)度表示等級(jí))。

C:ZMPSTE24與B細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突細(xì)胞的評(píng)分及相關(guān)趨勢(shì)。

2.7 免疫組織化學(xué)分析

從HPA中檢索免疫組織化學(xué)染色數(shù)據(jù)。在正常腦組織中,腦細(xì)胞通常具有較弱ZMPSTE24染色(圖6A);原發(fā)性膠質(zhì)瘤組織具有較強(qiáng)的ZMPSTE24染色(圖6B)。利用5例臨床采集的腫瘤組織,進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明腫瘤級(jí)別越高,ZMPSTE24表達(dá)水平相對(duì)越高(圖6C)。

A—B:從HPA中檢索免疫組織化學(xué)染色數(shù)據(jù),A為正常腦組織(患者ID:2512);B為原發(fā)性膠質(zhì)瘤組織(患者ID:3120);C:蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(n=5)。

3 討論

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中,膠質(zhì)瘤是最常見的類型。在世界衛(wèi)生組織依據(jù)其惡性程度的分級(jí)中,級(jí)別越高,意味著更大的治療難度、更容易復(fù)發(fā)以及更高的病死率[14]。因此,準(zhǔn)確地評(píng)估預(yù)后對(duì)于在疾病早期選擇最合適的治療以改善患者預(yù)后至關(guān)重要。有研究[15]表明,基于生物標(biāo)志物的癌癥治療可以有效改善某些惡性腫瘤的預(yù)后。因此,本研究主要分析ZMPSTE24與原發(fā)性膠質(zhì)瘤的關(guān)聯(lián)和潛在機(jī)制。本研究結(jié)果顯示,ZMPSTE24表達(dá)水平與原發(fā)性膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展、惡性程度及預(yù)后密切相關(guān)。尤其ZMPSTE24表達(dá)水平越高,意味著原發(fā)性膠質(zhì)瘤的惡性程度越高。同時(shí),ZMPSTE24高表達(dá)的原發(fā)性膠質(zhì)瘤患者總生存期比ZMPSTE24低表達(dá)組顯著降低。

ZMPSTE24是一種膜鋅金屬蛋白酶,參與人類早衰癥病理機(jī)制[16]。最新研究[7]表明,ZMPSTE24通過突變途徑和表達(dá)途徑共同參與了具有MSI-H表型的胃癌和結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。通過PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與樞紐基因篩選,獲得ZMPSTE24相互作用的蛋白分子,同時(shí)以MCC評(píng)分為準(zhǔn),篩選出ZMPSTE24蛋白網(wǎng)絡(luò)中重要的節(jié)點(diǎn)蛋白,如異戊烯基內(nèi)肽酶(RCE1)、異戊二烯基半胱氨酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶(ICMT)等。其中,RCE1在真核生物多種信號(hào)通路中扮演著非常重要的角色,參與了真核細(xì)胞的增殖、分化和癌變等過程[17]?，F(xiàn)有研究表明RCE1與膠質(zhì)瘤[18]、膀胱癌[19]、前列腺癌、舌鱗癌[20]等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同時(shí),有研究[21]表明ICMT參與了肝癌的轉(zhuǎn)移過程和舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展。此外,有研究[22-23]發(fā)現(xiàn)與ZMPSTE24共表達(dá)的SEC22B、SLC39A1、SERBP1等基因,與肝癌、胃癌、膠質(zhì)瘤以及神經(jīng)細(xì)胞修補(bǔ)密切相關(guān)?；诨蚋患治霭l(fā)現(xiàn),ZMPSTE24可能參與泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用、基底轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期、RNA降解等重要分子通路。此外,依據(jù)TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)研究數(shù)據(jù),ZMPSTE24的表達(dá)與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、髓系樹突狀細(xì)胞(DCs)有顯著差異,這意味著ZMPSTE24可能通過某種作用機(jī)制,影響膠質(zhì)瘤的免疫浸潤(rùn)程度,進(jìn)而對(duì)原發(fā)性膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后產(chǎn)生相關(guān)影響。為進(jìn)一步驗(yàn)證mRNA水平研究的可靠性,本研究通過HPA和臨床病理組織免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ZMPSTE24在膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)水平高于正常腦組織,且ZMPSTE24的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)呈正相關(guān)。

本研究存在一些局限性。首先,僅在人類基因轉(zhuǎn)錄組水平上研究了膠質(zhì)瘤中ZMPSTE24的特征,沒有進(jìn)一步研究其在體內(nèi)或體外的功能;其次,ZMPSTE24在這些過程中的具體分子機(jī)制需要進(jìn)一步探索。

總之,高水平的ZMPSTE24提示原發(fā)性膠質(zhì)瘤的惡性程度較高,生存率較低,尤其在Ⅱ、Ⅲ級(jí)原發(fā)性膠質(zhì)瘤中ZMPSTE24表達(dá)量可以用于預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。因此,筆者推測(cè)ZMPSTE24可能是膠質(zhì)瘤發(fā)病和發(fā)展的重要基因,或許可以作為原發(fā)性膠質(zhì)瘤的獨(dú)立預(yù)后因子和潛在治療靶點(diǎn)。