劉俊哲,王利平,雷錕堅,羅 敏,楊新宇,楊璐菲,葉敏華

(1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,南昌 330006; 2.婺源縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科,江西 上饒 333200)

膠質(zhì)瘤是成年人中最常見的顱內(nèi)腫瘤之一[1],主要起源于神經(jīng)膠質(zhì)細胞,具有高度的侵襲性,易在顱內(nèi)進行廣泛播散,患者的預(yù)后通常很差,中位生存時間僅為12個月甚至更少[2]。臨床上對膠質(zhì)瘤常用的治療手段為外科手術(shù)切除,加以輔助放化療,但由于其在顱內(nèi)播散廣泛,難以通過手術(shù)治療進行腫瘤全切[3]。此外,膠質(zhì)瘤對放化療易產(chǎn)生抗性的特征也使得術(shù)后的放化療難以獲得滿意的療效,探索新的診斷及預(yù)后標志物及治療靶點對膠質(zhì)瘤的診治具有重要的參考意義[4]。

細胞周期紊亂是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素,通過調(diào)控細胞周期能為腫瘤發(fā)展及治療提供新的治療方向,而細胞周期調(diào)控分子的研究可為特異性靶向藥物的篩選與研發(fā)提供依據(jù)。大量研究[5-6]證明,抑癌基因編碼的蛋白質(zhì)對于細胞周期過程有關(guān)鍵的調(diào)控作用,被證明與細胞周期密切相關(guān)。在本課題組前期研究[7]中已經(jīng)表明CWF19L1(CWF19 Like cell cycle control factor 1)在膠質(zhì)瘤的進展中參與關(guān)鍵的調(diào)控作用,但其具體作用機制尚未被完全揭示,本文進一步設(shè)計相應(yīng)實驗,探究CWF19L1對細胞周期的影響以及在腫瘤細胞增殖,遷移與浸潤中的作用,進而影響其惡性進展,為進一步探索針對膠質(zhì)瘤治療尋找新的靶點和診療思路。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料與儀器

人正常神經(jīng)細胞SVG、人胚腎細胞HEK293T和膠質(zhì)瘤細胞系U87、T98、U118、LN229及U251均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。DMEM、MEM培養(yǎng)基、opti-MEM培養(yǎng)基及0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco生物科技公司。胎牛血清購買自蘇州依科賽生物科技公司,CWF19L1、GAPDH單克隆抗體山羊抗兔與山羊抗鼠二抗購自美國Proteintech公司;細胞周期試劑盒、CCK-8試劑盒及BCA試劑盒購買自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,超敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(Super ECL Plus)購自蘇州優(yōu)逸蘭迪生物科技有限公司,sh-NC、sh-CWF19L1-1、sh-CWF19L1-2、sh-CWF19L1-3慢病毒質(zhì)粒購自吉凱基因生物科技有限公司,LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen生命技術(shù)有限公司。本研究使用的主要儀器有低溫高速離心機(美國Thermo Fisher生物科技公司)、超凈工作臺(蘇潔凈化設(shè)備有限公司)、熒光顯微鏡(德國Leica公司)、流式細胞儀(美國Beckman公司)、多功能酶標儀(美國Thermo Fisher生物科技公司)、細胞培養(yǎng)箱(美國BD公司)、細胞計數(shù)儀(江蘇卓微生物科技有限公司)、蛋白質(zhì)電泳儀(美國Bio-Rad公司)等。

1.2 細胞培養(yǎng)

除U87細胞培養(yǎng)于含10% FBS的MEM培養(yǎng)基外,上述其余細胞系均培養(yǎng)在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中,培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃,5% CO2。細胞鋪板后,均待其進入對數(shù)生長期再進行操作。細胞消化均使用含有EDTA的0.25%胰蛋白酶,37 ℃ 環(huán)境下消化3 min,等量完全培養(yǎng)基中止消化,離心后取得細胞沉淀以進行后續(xù)實驗。

1.3 慢病毒包裝

在六孔板上進行HEK293T細胞鋪板,使用慢病毒包裝體系(psPAX2、pMD2.0+慢病毒質(zhì)粒)進行慢病毒的包裝,使用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑進行質(zhì)粒共轉(zhuǎn),轉(zhuǎn)染后6 h換液,去除轉(zhuǎn)染試劑后36 h收集上清,即為病毒溶液。將收集的病毒溶液通過0.22 μm細胞篩進行過濾,使用慢病毒濃縮試劑盒進行慢病毒濃縮后置于-20 ℃冰箱備用。

1.4 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系構(gòu)建

將U251膠質(zhì)瘤細胞接種于六孔板中,細胞生長至50%～60%密度時進行慢病毒轉(zhuǎn)染操作。將收集的慢病毒溶液加入六孔板中進行孵育,12 h后進行細胞換液重置培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞長至適宜密度使用嘌呤霉素進行細胞篩選。收集篩選后的穩(wěn)定CWF19L1敲低細胞系進行大量擴增并部分在-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆?同時保留部分細胞進行后續(xù)實驗。

1.5 蛋白質(zhì)提取及蛋白質(zhì)印跡法(WB)實驗

待CWF19L1敲低穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞和陰性對照未做處理的細胞生長至合適濃度時,用RIPA細胞/組織裂解液裂解細胞,使用超聲破碎儀進行細胞破碎,提取細胞蛋白質(zhì)通過BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。進行WB實驗時,每孔的上樣量為30 μg,以確定蛋白質(zhì)電泳時蛋白質(zhì)樣品的上樣量。將樣品蛋白與loading buffer進行混合,置于100 ℃金屬浴鍋中煮沸至蛋白質(zhì)變性,置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。WB實驗采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,每孔上樣量為30 μg。電泳條件分別為濃縮膠:90 V、30 min;分離膠:120 V、60 min,待電泳結(jié)束后,用濕轉(zhuǎn)法將分散開的電泳蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到事先用甲醇溶液激活的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,轉(zhuǎn)膜條件為400 mA、60 min。轉(zhuǎn)膜完成后用5%脫脂牛奶將膜封閉4 h,之后用1：10 000稀釋的CWF19L1單克隆抗體在4 ℃ 條件下進行過夜孵育。次日,TBST清洗3次后,用山羊抗兔抗體(1：3000)孵育4 h,繼續(xù)用TBST清洗3次,最后在顯影液中孵育并通過顯影儀(Tanon-5200Multi)在暗室中進行熒光拍照。將最終獲得的圖像用ImageJ軟件進行灰度值讀取,并取GAPDH作為內(nèi)參對照對目的蛋白的表達進行半定量統(tǒng)計學(xué)分析。

1.6 細胞周期實驗

分別取CWF19L1穩(wěn)定敲低細胞和正常對照組細胞,胰酶消化細胞后用PBS清洗。將潤洗后的細胞使用80%乙醇在-20 ℃條件下過夜進行細胞固定。再使用RedNucleus Ⅰ對細胞的雙鏈DNA染色,再通過流式細胞儀上638 nm為激發(fā)波長的FL2通道中檢測熒光強度,將結(jié)果在Flowjo軟件中進行細胞周期分析。

1.7 細胞增殖實驗

分別取未做處理以及穩(wěn)轉(zhuǎn)sh-CWF19L1-2慢病毒的U251膠質(zhì)瘤細胞進行消化重懸及鋪板,將兩種細胞以每孔3000個的密度接種于96孔板中,充分搖勻,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～4 d。分別在培養(yǎng)第1、2、3、4天時,根據(jù)CCK-8試劑盒說明書進行操作,利用酶標儀在450 nm處進行吸光度的測量,根據(jù)結(jié)果確定細胞的增殖情況。根據(jù)測得的不同時期的細胞生長數(shù)差異,繪制細胞的生長特征曲線。

1.8 劃痕實驗

取前述轉(zhuǎn)染敲低慢病毒的U251膠質(zhì)瘤細胞,以5×105個細胞每孔進行鋪板,待細胞貼壁過夜生長,待生長至大約60%密度,用1 mL槍頭進行劃痕操作(事先用marker筆在皿的反面進行標記),每隔0.5～1.0 cm一道劃痕,用PBS清洗培養(yǎng)皿3次,洗去刮下的細胞,加入無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng),重新放回5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),并且在0、6、12、24 h 分別進行拍照和取樣,觀察劃痕周圍腫瘤細胞向劃痕進行遷移的程度和速率。遷移率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度。

1.9 Transwell實驗

取轉(zhuǎn)染敲低質(zhì)粒慢病毒的U251膠質(zhì)瘤細胞,經(jīng)消化離心后,用無血清培養(yǎng)基進行細胞重懸,并用細胞計數(shù)儀進行細胞密度的計算,用培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至2.5×105個·mL-1,每個Transwell小室的上室中鋪200 μL細胞懸液。同時,向下室中加入500 μL含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基,在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,去除上室上膜殘留的細胞,對已進入下室中的細胞用1%的結(jié)晶紫溶液進行染色10 min,通過顯微鏡對下室細胞進行觀察并拍照記錄,最后使用ImageJ軟件對照片進行分析并計數(shù)。以上實驗在相同的條件下均重復(fù)3次或以上,以避免偶然誤差。

1.10 生物信息學(xué)分析

通過GEPIA網(wǎng)頁工具(http://gepia.cancer-pku.cn/),分析CWF19L1在GBM與LGG兩種腫瘤中分別與對應(yīng)正常組織之間的表達差異。從TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫下載TCGA、CGGA及GEO數(shù)據(jù)庫中的膠質(zhì)瘤RNA-seq數(shù)據(jù),按照CWF19L1表達量高低分成2組,結(jié)合患者的生存時間應(yīng)用R軟件(Version:4.0.4)進行數(shù)據(jù)處理并繪圖,最終確定CWF19L1的表達量與腫瘤之間的關(guān)系。匹配每位患者的生存與表達數(shù)據(jù),使用“Survival”“Survminer”包分析CWF19L1基因表達與患者預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均由實驗所得原始數(shù)據(jù)通過SPSS 22.0軟件進行分析所得,所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差進行呈現(xiàn),組間比較行t檢驗,變量之間使用Spearman相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CWF19L1在膠質(zhì)瘤組織中的表達

在GBM和LGG兩種腫瘤中,CWF19L1的表達存在明顯差異,其中在2組腫瘤樣本中表現(xiàn)為腫瘤組表達均高于正常組(P<0.05)(圖1A)。初步推斷CWF19L1作為抑癌基因,在腫瘤組中高表達以抑制腫瘤的生長和侵襲,但這種抑制作用不足以抑制腫瘤的發(fā)展,因此設(shè)計了后續(xù)實驗對上述猜想加以驗證。通過提取各細胞系的全蛋白質(zhì)進行蛋白質(zhì)電泳,選擇GAPDH作為內(nèi)參,進行CWF19L1蛋白質(zhì)的表達量比較,最終確定在U251膠質(zhì)瘤細胞系中,CWF19L1蛋白質(zhì)的表達最高(圖1B)。

A:在TCGA與GTEx合并數(shù)據(jù)庫LGG和GBM樣品中,腫瘤組織相較于癌旁組織CWF19L1表達量更高。B:在6種基礎(chǔ)細胞系中檢測CWF19L1蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)表達量,顯示在U251細胞中CWF19L1表達最高。*P<0.05。

2.2 CWF19L1高表達對預(yù)后的影響

在3個數(shù)據(jù)庫中各樣本進行表達分析,將患者的CWF19L1表達量分成高低兩組,對其生存時間進行統(tǒng)計學(xué)處理,結(jié)果如圖2A—C,在TCGA、CGGA和GEO數(shù)據(jù)結(jié)果均顯示,低表達組患者的生存時間通常較短,預(yù)示著CWF19L1對于膠質(zhì)瘤屬于保護基因,其高表達能有效限制膠質(zhì)瘤細胞的惡性程度,減少膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生的損傷。

圖2 TCGA、CGGA、GEO數(shù)據(jù)庫中CWF19L1生存分析

2.3 sh-CWF19L1-2敲低效果

對實驗組U251膠質(zhì)瘤細胞進行轉(zhuǎn)染敲低慢病毒(圖3A),對照組U251膠質(zhì)瘤細胞進行陰性對照慢病毒的轉(zhuǎn)染,收集蛋白質(zhì)進行WB檢測,結(jié)果如圖3B所示,CWF19L1蛋白表達相較于陰性對照組出現(xiàn)明顯的敲低,并且sh-CWF19L1-2對CWF19L1基因具有最明顯的敲低效果,后續(xù)亦選擇該質(zhì)粒進行功能實驗。

A:轉(zhuǎn)染慢病毒后通過普通顯微鏡及熒光顯微鏡觀察到的U251膠質(zhì)瘤細胞;B:WB檢測三保一敲低慢病毒轉(zhuǎn)染情況各組之間的CWF19L1蛋白質(zhì)表達量,n=3。

2.4 CWF19L1敲低在膠質(zhì)瘤細胞周期中的表達

細胞周期實驗的流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明,CWF19L1敲低細胞系中處于DNA合成期與合成后期(S/G2期)的細胞比例相較于對照組明顯上調(diào)(42.22%比33.00%,P<0.05),見圖4。提示CWF19L1蛋白能抑制U251膠質(zhì)瘤細胞的細胞周期G1/S期轉(zhuǎn)化,表現(xiàn)為具有抑制細胞周期進展的作用。

圖4 流式細胞術(shù)檢測CWF19L1敲低組與對照組對細胞周期的影響(n=3)

2.5 敲低CWF19L1對膠質(zhì)瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力的影響

CCK-8實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞樣本吸光度明顯升高(P<0.001),見圖5,提示敲低CWF19L1后,膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力顯著提升,這進一步驗證了CWF19L1作為腫瘤抑制基因?qū)δ[瘤增殖的抑制作用。通過在不同處理組細胞中進行劃痕實驗,結(jié)果顯示,敲低組中細胞通過相同時間的培養(yǎng)后,劃痕間距較未處理組明顯縮短(P<0.001),見圖6,提示CWF19L1對于腫瘤細胞的遷移存在明顯的抑制作用。Transwell結(jié)果進一步顯示,敲低細胞內(nèi)CWF19L1的表達后,細胞的侵襲能力顯著增強,處理組細胞系在Transwell小室中出現(xiàn)的細胞數(shù)量超過對照組(P<0.001),見圖7。

時間/dn=3。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。圖5 敲低CWF19L1的表達對細胞增殖能力的影響

n=3,*P<0.001。圖6 敲低CWF19L1的表達對細胞遷移能力的影響

n=3,*P<0.001。圖7 敲低CWF19L1的表達對細胞遷移和侵襲能力的影響

3 討論

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤,是神經(jīng)系統(tǒng)致死率最高的腫瘤之一,對其發(fā)生發(fā)展機制的研究已持續(xù)幾十年,已有一部分實驗研究應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的臨床治療,但由于血腦屏障的存在及其對大部分藥物具有較強的阻隔效應(yīng),不能將藥物擴散至顱內(nèi)發(fā)揮作用,因此藥物治療往往收效甚微[8]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細胞周期的進程密切相關(guān),通過改變細胞周期的進展從而對腫瘤細胞的增殖與浸潤產(chǎn)生影響[9-11]。表觀遺傳學(xué)說明了腫瘤的發(fā)生與基因改變之間的聯(lián)系,原癌基因表達升高或抑癌基因表達抑制是腫瘤發(fā)生的主要因素之一,基因表達水平研究的不斷深入能從分子水平解答腫瘤的病因及影響因素,并憑此開發(fā)新的腫瘤治療方案。

鑒于在腫瘤樣本中CWF19L1表達相較于正常樣本普遍升高,但其在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中并未發(fā)生明顯的突變現(xiàn)象,而腫瘤細胞的惡性進程激發(fā)了CWF19L1抑制腫瘤細胞周期的作用[12]。在分子水平上表現(xiàn)為腫瘤組織中CWF19L1表達升高,但其發(fā)揮的抑癌作用的效力只能減緩腫瘤細胞的進展,不能達到殺傷腫瘤細胞的目的。

除了通過細胞周期調(diào)節(jié)腫瘤細胞生理特征的作用,還有研究[13]表明,CWF19L1基因突變可能導(dǎo)致其他腦部疾病。例如,CWF19L1發(fā)生基因突變導(dǎo)致早發(fā)常染色體隱形小腦共濟失調(diào),提示CWF19L1通過細胞通路調(diào)控細胞生物學(xué)行為的方式并不單一。CWF19L1通過直接影響細胞周期對細胞生命活動起到的調(diào)控作用有限,CWF19L1還可能通過作用于miRNA進而調(diào)節(jié)細胞過程,有實驗[14-16]證明CWF19L1可調(diào)控細胞中miR-132-3p水平,對骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化加以調(diào)控,從而對成骨作用產(chǎn)生調(diào)控。臨床亦有報道[17]稱CWF19L1突變導(dǎo)致胎兒脊柱畸形與六指畸形,更確定了其在成骨過程中的調(diào)控作用。

敲低CWF19L1表達腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力均有所提高,但產(chǎn)生這種提高的可能原因有CWF19L1蛋白質(zhì)對細胞周期的直接作用以及CWF19L1通過調(diào)控miRNA間接對腫瘤細胞的各種生理過程產(chǎn)生影響[18-21],但其具體調(diào)控機制或哪條途徑對腫瘤惡性功能的影響更大,需要通過后續(xù)實驗加以驗證,探究新的CWF19L1相關(guān)調(diào)控軸。敲低CWF19L1改變腫瘤細胞特性也可能是通過調(diào)控軸實現(xiàn),最終促進腫瘤的增殖、遷移與侵襲。應(yīng)用相關(guān)藥物改變調(diào)控軸中各分子的含量,從而定向調(diào)控細胞的各項生命活動,為限制腫瘤的進展,甚至達到治愈腫瘤提供了新的治療靶點[22]。

綜上所述,CWF19L1作為抑癌基因,其表達與細胞周期緊密聯(lián)系,因此通過調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞中該蛋白的表達,能顯著影響細胞周期,對腫瘤細胞的增殖,遷移及浸潤產(chǎn)生作用,可作為治療膠質(zhì)瘤的潛在靶點。