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CRISPR-Cas 系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌檢測中的應(yīng)用前景

2023-05-13 13:22喻義杭陳園園蔡青山趙亞芳
浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志 2023年11期
關(guān)鍵詞:結(jié)核敏感性特異性

喻義杭 陳園園 蔡青山 孔 嬌 趙亞芳

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染性疾病。隨著新型冠狀病毒的大流行,2022 年結(jié)核病成為全球僅次于新型冠狀病毒感染傳染病死因[1],嚴(yán)重危害全球人民的生命與健康。雖然目前有眾多的檢測手段,但據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計仍有近一半的病例未能確診。近年來基于成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas,CRISPRCas)系統(tǒng)發(fā)展迅速,其研發(fā)成果已應(yīng)用于基因編輯和體外分子診斷,國外已開發(fā)出多種用于高敏感性核酸檢測的通用系統(tǒng),例如Viqilant[2]、RAA-cas12atg[3]和ACasB[4]。本文通過對目前CRISPR-Cas 系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌檢測中的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述,進(jìn)而探討其應(yīng)用前景和面臨的挑戰(zhàn)。

1 CRISPR-Cas 系統(tǒng)簡介

1.1 發(fā)展歷史 CRISPR-Cas 系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期的斗爭中形成的適應(yīng)性免疫系統(tǒng),其利用RNA 引導(dǎo)的核酸酶靶向并降解外源核酸,保護(hù)細(xì)菌和古細(xì)菌免受外來遺傳物質(zhì)的干擾[5]。1987 年日本科學(xué)家Ishino 首次在大腸埃希菌基因組中發(fā)現(xiàn)了一段具有重復(fù)DNA 序列的遺傳物質(zhì)[6],隨后的1991 年在結(jié)核分枝桿菌中也發(fā)現(xiàn)了這一重復(fù)序列[7]。后來這段重復(fù)的遺傳物質(zhì)被命名為CRISPR,與其相關(guān)的蛋白就被叫做Cas 蛋白。2012 年Jinek 等在由結(jié)合CrRNA(CRISPR RNA)組成的雙RNA 結(jié)構(gòu)中,指導(dǎo)CRISPR相關(guān)蛋白在靶DNA 中進(jìn)行切割并與相應(yīng)序列互補位點的結(jié)合,揭示了CRISPR-Cas 系統(tǒng)在基因編輯方面的價值[8]。2016 年P(guān)ardee 等[9-11]將CRISPR-Cas9系統(tǒng)與核酸依賴性擴增檢測技術(shù)相結(jié)合,成功地從病毒性獼猴的血漿中檢測出寨卡病毒,其檢測限達(dá)到了1 fmol 并能檢測區(qū)分具有單堿基差異的不同病毒亞型,這表明了該項技術(shù)具有在體外檢測病原體的能力。后來張鋒團(tuán)隊開發(fā)的SHERLOCK 可將三種不同序列偏好的Cas13 蛋白與一種Cas12 蛋白放在同一個體系中,同時實現(xiàn)對四種不同病原體的檢測,提高了檢測效率,擴展了臨床應(yīng)用范圍[12]。目前第二代的SHERLOCK[13]通過將Cas13a 與Csm6(一種輔助的CRISPR 核酸酶)相結(jié)合,并用稀釋的方法對等溫擴增引物非飽和反應(yīng),敏感性提高了3 倍以上,實現(xiàn)了從定性到定量的跨越。CRISPR-Cas 系統(tǒng)作為一項革命性的技術(shù),自誕生起迅速成為了生命科學(xué)的研究熱點,特別是在生物醫(yī)學(xué)及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。

1.2 工作流程 CRISPR-Cas 系統(tǒng)是由前導(dǎo)區(qū)(leader)、重復(fù)序列(repeat)、間區(qū)(spacer)及CRISPR相關(guān)蛋白四個部分構(gòu)成,不同物種Cas 基因編碼形成不同功能的Cas 蛋白[14]。前導(dǎo)區(qū)是CRISPR 轉(zhuǎn)錄的啟動區(qū)域和結(jié)合位點,當(dāng)外來病毒入侵細(xì)菌時,為了獲取外源基因,細(xì)菌會表達(dá)出相應(yīng)的Cas 蛋白,主要是Cas1 和Cas2 的參與,可通過識別特異的前間隔序列鄰近基序(protospacer adjacent motif,PAM),將其附近的原間隔序列DNA 加工成一定長度的新的間隔序列,插入自身基因組(CRISPR 序列)中。當(dāng)外源基因再次入侵時,CRISPR 基因組轉(zhuǎn)錄出帶有間隔區(qū)序列的CrRNA 與Cas 蛋白形成Cas 蛋白/CrRNA/靶DNA 復(fù)合體發(fā)揮切割作用,這個復(fù)合物可產(chǎn)生兩種核酸酶活性[10-11,15],一種是在PAM 序列遠(yuǎn)端特異切割dsDNA(順式切割活性),另一種是非特異性切割周圍的ssDNA(反式切割活性)。通過設(shè)計crRNA 的序列,使Cas 蛋白/CrRNA/靶DNA 復(fù)合體特異識別外源片段,激活Cas 蛋白的核酸剪切酶活性,對體外的外源性遺傳物質(zhì)片段發(fā)揮分割作用。

1.3 分 類 原核生物的CRISPR/Cas 系統(tǒng)總體可以分為2 大類[16],即Class1 和Class2,每類由幾種類型和亞型組成。CRISPR/Cas1 類系統(tǒng),由多種效應(yīng)部蛋白質(zhì)復(fù)合物組成,每種蛋白質(zhì)在CRISPR 過程中執(zhí)行的功能較為單一。第2 類CRISPR/Cas 系統(tǒng)雖然是一個單一的效應(yīng)部蛋白,但是在CRISPR 過程中具有多種功能,因具有簡單高效的特點,廣泛地應(yīng)用在分子診斷學(xué)領(lǐng)域。按照效應(yīng)蛋白分類Class1 可分為3 種類型和12 個亞型[17],Class2 分為3 種類型和9 個亞型[18],包括Cas9、Cas12、Cas13,不同的Cas 蛋白具有不同的切割特點,Cas9 蛋白切割的是雙鏈DNA(dsDNA)、Cas13 切割的是單鏈RNA(ssRNA)、Cas12 切割的是單鏈DNA(ssDNA),三者都需要PAM 的協(xié)助,Cas9 蛋白識別的PAM 位點是NGG,Cas12 蛋白識別的PAM 位點是TTN,Cas13 蛋白識別位點為PAM 下游的A、U、C,當(dāng)靶基因沒有其特異的PAM 位點時,會限制其應(yīng)用。

2 CRISPR-Cas 系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌檢測中的研究現(xiàn)狀

Ai 等[19]開發(fā)了一種由CRISPR-Cas12a 系統(tǒng)介導(dǎo)的,將結(jié)核分枝桿菌基因組中IS6110 作為檢驗靶標(biāo),結(jié)合重組酶多聚酶擴增(recombinase polymerase amplification,RPA)技術(shù)的一種快速、簡便、靈敏的結(jié)核分枝桿菌檢測方法。在肺結(jié)核和肺外結(jié)核的隊列中,其總體敏感性和特異性分別為79%和98%,在肺結(jié)核的隊列中敏感性為90%,特異性為97%,達(dá)到了單拷貝分析敏感性,同時樣本輸入(500 μL)更少、花費的時間(1.5 h)也更少。有學(xué)者為了進(jìn)一步提高敏感性,在結(jié)合RPA 技術(shù)的CRISPR-Cas12a 系統(tǒng)檢測平臺中,專門設(shè)計了一種具有熒光團(tuán)和猝滅劑的長寡核苷酸探針,以識別核酸酶特異性切割的RPA 擴增子,將檢驗靶點改為IS1081,這種熒光分子是通過游離DNA 與淬滅劑連接在一起,只有二者分離,才能檢測出熒光信號,并能通過肉眼觀察顏色改變進(jìn)行定性、且熒光的強弱與濃度存在良好的線性相關(guān)(R2=0.9775)[20]。其敏感性提高到了99.2%,特異性為100%,與金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法的結(jié)果相當(dāng)。但是其花費的時間與Xpert 相比處于劣勢,幾乎是后者花費時間的2 倍。Sam 等[21]運用Cas12b 蛋白結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了一種新型結(jié)核分枝桿菌DNA 檢測平臺(TBQUICK),檢測低限低至1.3 拷貝/μL。TB-QUICK 不僅在結(jié)核分枝桿菌檢測中表現(xiàn)出具有86%的總體敏感性,超過了WHO 推薦用于臨床實踐的Xpert[22],而且在抗酸桿菌涂片鏡檢陰性的患者中也達(dá)到了80%的敏感性。這表明CRISPR-Cas 系統(tǒng)在涂片抗酸染色為陰性或者在標(biāo)本含菌量很少出現(xiàn)的情況下也可以檢測識別出結(jié)核分枝桿菌。Wang 等[23]開發(fā)了一種新的檢測平臺,稱為LACD。在這套系統(tǒng)中可以檢測任何目標(biāo)序列,通過觀察實時熒光儀信號的變化和橫向流生物傳感器上游離DNA 的降解進(jìn)行檢測,其敏感性為79.5%、特異性為100%。正因為CRISPR-Cas系統(tǒng)對非侵入性標(biāo)本如痰液、胃內(nèi)容物、糞便病原菌的檢出具有高度敏感性,在標(biāo)本含菌量很少的情況下也能檢測出病原菌。Lyu 等[24]認(rèn)為,基于CRISPRCas 系統(tǒng)的生物技術(shù)在兒童肺結(jié)核的病原學(xué)診斷方面有著很大的應(yīng)用前景,這種技術(shù)能夠減少兒童的有創(chuàng)操作,減輕患兒的痛苦,提升就醫(yī)體驗,提高兒童結(jié)核病的診治能力。Huang 等[25]美國學(xué)者發(fā)現(xiàn),CRISPR 對攜帶艾滋病病毒的兒童肺結(jié)核檢測具有高度敏感性,其敏感性和特異性分別為100%和85%,這主要是通過使用超靈敏的CRISPR-Cas12a系統(tǒng)檢測結(jié)核桿菌的游離DNA 實現(xiàn)的。同時發(fā)現(xiàn),血清中的游離DNA 濃度與抗結(jié)核藥物使用時間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),說明它還具有監(jiān)測抗結(jié)核藥物治療作用的能力。Xiao 等[26]將Cas12a 蛋白與靶向rpoB 序列的物種特異性gRNA 探針相結(jié)合,首次實現(xiàn)了結(jié)核分枝桿菌和臨床常見的幾種非結(jié)核分枝桿菌的鑒別,正確率接近100%。但這項研究未在真實的臨床環(huán)境中進(jìn)行驗證,無法得到真實世界的數(shù)據(jù)。為探索CRISPR-Cas 系統(tǒng)在耐藥基因檢測中的價值,有學(xué)者將鏈霉素耐藥基因中的Lys43Arg 和Lys88Arg 位點作為靶基因進(jìn)行檢測,只需要1 h 就可以完成檢測,其敏感性為100%、特異性100%[27]。另一項研究運用Cas13a 蛋白檢測耐氟喹諾酮類結(jié)核桿菌中的gyrA基因,其特異性和敏感性分別為100%和91.4%[28]。

3 CRISPR-Cas 系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌檢測中的局限性

CRISPR/Cas 系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌的檢測中也存在一些局限:(1)主要存在著脫靶的風(fēng)險,且隨時間的延長,其脫靶率也隨之上升,后期其脫靶效應(yīng)可高達(dá)66%[29],這主要是PAM 序列與單向?qū)NA(single guide RNA,sgRNA)序列[30]存在一定概率的錯配引起的;(2)DNA 擴增過程中存在的假陽性;(3)目前的研究只選擇大分子的Cas 蛋白作為載體;(4)目前基于CRISPR-Cas 系統(tǒng)的檢測技術(shù)大多數(shù)需要事先核酸擴增,擴增過程中存在交叉污染的可能;(5)現(xiàn)有研究只針對結(jié)核分枝桿菌單個靶基因的檢測、有一定的假陰性,而且無法進(jìn)行定量檢測。

4 總結(jié)與展望

結(jié)核病是全國第二大傳染病死亡原因,盡管有眾多的檢測手段,但仍有一半的病例未能確診,因此急需一種簡便快捷、低成本、高靈敏的檢測方案,而CRISPR-Cas 系統(tǒng)正好滿足這些要求。CRISPR-Cas系統(tǒng)作為一項新技術(shù)也并非完美,筆者認(rèn)為未來可以從以下方面進(jìn)行研究:(1)針對結(jié)核分枝桿菌不同基因的多重檢測方法;(2)CRISPR-Cas 系統(tǒng)與納米電子學(xué)、液滴微流控、免疫色譜法、酶促重組酶擴增等其他技術(shù)進(jìn)行結(jié)合,往多重耐藥基因、定量、自動化、免核酸擴增方向進(jìn)行研究;(3)選擇不同切割能力的Cas 蛋白,如Cas9、Cas13、Cas14 等;(4)16S rRNA[31-32]是分枝桿菌屬菌種共有高度保守又有高度多態(tài)性序列,我們可以把這種既含屬特異性位點,又有種特異性位點的基因作為分枝桿菌屬種鑒定的靶基因,同時將IS6110、IS1081 等保守區(qū)域作為結(jié)核分枝桿菌的靶基因,研發(fā)肉眼即可判讀檢測結(jié)果且不需要特殊設(shè)備的快速分枝桿菌分型檢測平臺。總之,基于CRISPR 的檢測方法具有花費時間少、低成本、可視化、高敏感性的特點,能有效提高廣大基層醫(yī)院結(jié)核病的防治水平,實施更加精準(zhǔn)的治療,及時調(diào)整抗生素方案,為結(jié)核分枝桿菌檢測提供新的思路。

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