吳海濱,趙愛國(guó),苗雅云,李 帥,張冠男,湛喜梅,王文勝

(河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺甲狀腺外科,河南 開封 475100)

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一[1],根據(jù)組織病理學(xué)特征可分為乳頭狀癌、濾泡狀癌、未分化癌等,其中甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)最常見,約占所有甲狀腺癌病例的85%～90%[2-3]。PTC患者經(jīng)外科手術(shù)治療后可獲得較好的治療效果,但腫瘤轉(zhuǎn)移依然是影響患者預(yù)后的主要因素之一[4]。因此,篩選PTC淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子,將有助于為PTC患者開發(fā)新的治療策略改善患者預(yù)后,提高生存率。腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(Tumor metastasis-associated gene 1,MTA1)是腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因位點(diǎn),在腫瘤細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)[5-6]。已有研究發(fā)現(xiàn)MTA1與腫瘤的發(fā)展有關(guān)[7]。叉頭翼螺旋轉(zhuǎn)錄因子3(Forkhead box protein 3,FOXP3)是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族中的重要成員,已被證實(shí)在PTC中發(fā)揮重要作用[8]。為了揭示FOXP3、MTA1的表達(dá)與PTC疾病進(jìn)展的關(guān)系以及兩者的相關(guān)性,本研究旨擬通過檢測(cè)PTC淋巴轉(zhuǎn)移患者癌組織中MTA1、FOXP3的表達(dá)水平,分析兩者在PTC淋巴轉(zhuǎn)移中的作用以及與患者預(yù)后的關(guān)系,以利于為PTC的防治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年1月到2022年6月在本院行手術(shù)治療的111例PTC患者為研究對(duì)象,男34例,女77例;年齡(45.59±8.44)歲,其中≥45歲35例、<45歲76例。術(shù)中收集癌組織標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本。病例納入標(biāo)準(zhǔn):診斷參考2017年WHO甲狀腺結(jié)節(jié)和分化型PTC的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9];均進(jìn)行甲狀腺全切或次全切術(shù);術(shù)前未接受過放化療及其他特殊藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn):合并其他惡性腫瘤;合并自身免疫性疾病及重要臟器功能障礙患者;有既往甲狀腺手術(shù)史;妊娠或哺乳人群。TNM分期Ⅰ+Ⅱ期69例,Ⅲ+Ⅳ期42例[TNM分期標(biāo)準(zhǔn)參考美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)甲狀腺癌分期系統(tǒng)(第8版)[10]];病灶單發(fā)73例,病灶多發(fā)38例;包膜侵犯36例,無包膜侵犯75例;合并橋本甲狀腺炎12例,無橋本甲狀腺炎99例;無脈管侵犯95例,有脈管侵犯16例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移71例,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例;腫瘤長(zhǎng)徑≥1 cm 56例,腫瘤長(zhǎng)徑<1 cm 55例。本研究經(jīng)我院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過,所有樣品采集均取得患者的知情同意,符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 研究方法 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)MTA1、FOXP3表達(dá):將福爾馬林固定石蠟包埋的組織切成4 μm厚的切片,70 ℃烘焙1 h,然后常規(guī)脫蠟水化。切片使用檸檬酸鹽緩沖液(10 mmol/L,pH6.0)進(jìn)行抗原修復(fù)。用0.3%的過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性20 min。然后將標(biāo)本與一抗(MTA1兔多克隆抗體,FOXP3兔多克隆抗體)在4 ℃下孵育過夜。在用檸檬酸緩沖液洗滌后,樣本加入抗體在37 ℃下孵育30 min。將載玻片沖洗進(jìn)行3,3’-二氨基聯(lián)苯胺染色。細(xì)胞核用蘇木精復(fù)染。最后,組織切片用玻璃蓋玻片密封,并用光學(xué)顯微鏡觀察。由兩名對(duì)臨床數(shù)據(jù)不知情的研究人員評(píng)估代表性區(qū)域的染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞百分比:染色細(xì)胞的百分比分別為1%～25%、26%～50%、51%～75%和>75%時(shí),陽(yáng)性染色評(píng)分為1、2、3或4分。無色、淡黃、黃色和棕色時(shí),染色強(qiáng)度記為0、1、2或3分。通過將百分比和強(qiáng)度的分?jǐn)?shù)相乘來計(jì)算最終的染色分?jǐn)?shù),總分0～12分。0～4分為陰性,5～12分為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)數(shù)資料采用[例(%)]表示,進(jìn)行卡方檢驗(yàn);采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法進(jìn)行相關(guān)性分析;采用單因素及多因素Logistic回歸風(fēng)險(xiǎn)模型分析PTC淋巴轉(zhuǎn)移影響因素;P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTA1、FOXP3在不同組織中的表達(dá)情況比較 111例PTC組織標(biāo)本中,MTA1陽(yáng)性表達(dá)率(MTA1陽(yáng)性例數(shù)/癌組織總例數(shù))為78.38%(87/111)高于癌旁組織17.12%(19/111),FOXP3在PTC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率(FOXP3陽(yáng)性例數(shù)/癌組織總例數(shù))為70.27%(78/111)高于癌旁組織13.51%(15/111),兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表1(圖1)。

2.2 PTC患者癌組織中MTA1與FOXP3表達(dá)的相關(guān)性 111例PTC組織標(biāo)本中,MTA1的陽(yáng)性表達(dá)87例,FOXP3陽(yáng)性表達(dá)78例,兩者表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.532,P=0.000)。

表1 MTA1、FOXP3在不同組織中的表達(dá)情況比較[例(%)]

A:PTC組織FOXP3表達(dá)情況;B:癌旁組織FOXP3表達(dá)情況;C:PTC組織MTA1表達(dá)情況;D:癌旁組織MTA1表達(dá)情況

2.3 癌組織中MTA1、FOXP3表達(dá)與PTC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 PTC患者癌組織中MTA1與FOXP3表達(dá)與患者年齡、性別、病灶數(shù)、橋本甲狀腺炎、腫瘤直徑、脈管侵犯無關(guān)聯(lián)(均P>0.05),與包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(均P<0.05),見表2。

表2 癌組織中MTA1、FOXP3表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

2.4 影響PTC淋巴轉(zhuǎn)移的單因素分析 單因素分析結(jié)果顯示淋巴轉(zhuǎn)移患者與未轉(zhuǎn)移患者在性別、病灶數(shù)、包膜侵犯、TNM分期、脈管侵犯、MTA1及FOXP3等病理特征方面比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05),見表3。

表3 影響PTC淋巴轉(zhuǎn)移單因素分析(例)

2.5 影響PTC淋巴轉(zhuǎn)移的Logistic多因素回歸分析 進(jìn)一步行多因素Logistic回歸分析,以性別(男=0,女=1)、病灶(單發(fā)=0,多發(fā)=1)、TNM分期(Ⅰ+Ⅱ=0,Ⅲ+Ⅳ=1)、包膜侵犯(無=0,有=1)、脈管侵犯(無=0,有=1)、MTA1(陰性表達(dá)=0,陽(yáng)性表達(dá)=1)、FOXP3(陰性表達(dá)=0,陽(yáng)性表達(dá)=1)為自變量,結(jié)果顯示性別、病灶、TNM分期、包膜侵犯及MTA1、FOXP3表達(dá)均是影響PTC淋巴轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素(均P<0.05),見表4。

表4 影響PTC淋巴轉(zhuǎn)移的Logistic多因素回歸分析

3 討 論

近年來,隨著PTC發(fā)病率的不斷上升,它已經(jīng)對(duì)世界上越來越多的人群構(gòu)成了巨大的威脅,尤其是女性[11]。雖然大多數(shù)病例經(jīng)及時(shí)治療后預(yù)后良好,但仍有相當(dāng)比例的患者惡性程度高,總生存期較差[12]。因此,尋找與PTC淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)的因子,對(duì)改善預(yù)后及延長(zhǎng)患者壽命具有重要指導(dǎo)價(jià)值。

MTA基因家族包括MTA1、MTA2和MTA3,該家族被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)節(jié)一系列癌癥發(fā)展進(jìn)程[13]。已有研究表明MTA1在多種腫瘤中存在異常高表達(dá),并與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[14-15]。如董旭媛等[16]研究發(fā)現(xiàn)MTA1在肺癌組織中高表達(dá),表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。王學(xué)培等[17]研究發(fā)現(xiàn)MTA1過表達(dá)可促進(jìn)食管癌細(xì)胞Eca-109的增殖和侵襲能力,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞血管的形成。本研究發(fā)現(xiàn)MTA1在PTC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織,其表達(dá)受包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期影響,與以往研究結(jié)果一致[4]。進(jìn)一步證明MTA1在PTC中發(fā)揮促癌基因的作用,其高表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移和侵襲,參與PTC淋巴轉(zhuǎn)移的發(fā)展過程,其作用機(jī)制可能是MAT1的高表達(dá)提高了PTC細(xì)胞的浸潤(rùn)及黏附能力,并促進(jìn)淋巴結(jié)內(nèi)皮組織的浸潤(rùn),從而導(dǎo)致淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。

FOXP3可通過調(diào)控T淋巴細(xì)胞,誘導(dǎo)免疫功能發(fā)生紊亂,從而導(dǎo)致癌細(xì)胞免疫逃逸[18]。近年來有多項(xiàng)研究顯示FOXP3在多種腫瘤疾病如甲狀腺乳頭狀癌、胃癌、肺癌、肝癌中異常表達(dá)[19-20]。趙水英等[21]研究發(fā)現(xiàn)FOXP3在PTC組織中表達(dá)增加,與PTC發(fā)生發(fā)展有關(guān),可作為一種潛在的PTC分子治療靶點(diǎn)。然而目前還缺乏評(píng)估FOXP3參與PTC淋巴轉(zhuǎn)移進(jìn)展的研究。本研究中PTC組織中FOXP3表達(dá)水平顯著高于癌旁組織,且表達(dá)水平與包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān),提示FOXP3參與PTC的發(fā)生及發(fā)展進(jìn)程,并可能在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮更為重要的作用,但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。此外,研究發(fā)現(xiàn)MTA1、FOXP3在PTC組織中的表達(dá)呈正相關(guān),提示兩者在PTC淋巴生成過程中可能存在協(xié)同作用,共同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性發(fā)展。Logistic回歸分析結(jié)果顯示性別、病灶、TNM分期、包膜侵犯與MTA1、FOXP3表達(dá)均是影響淋巴轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素,進(jìn)一步證明了MTA1、FOXP3與PTC淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān),也提示FOXP3及MTA1的異常表達(dá)與腫瘤侵襲和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān),兩者共同參與腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的發(fā)生,并有望成為PTC診療的新靶標(biāo)。

綜上所述,PTC淋巴轉(zhuǎn)移患者癌組織中MTA1、FOXP3均呈陽(yáng)性表達(dá),兩者是PTC淋巴轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,有望成為臨床預(yù)測(cè)PTC淋巴轉(zhuǎn)移情況的有效指標(biāo),具有重要的臨床意義。但目前FOXP3及MTA1在PTC淋巴轉(zhuǎn)移中的具體作用機(jī)制尚不明確,我們將在今后的研究工作中進(jìn)行完善并深入探討和分析。