閆 萌,張 征,邢保健,張 鵬,李潤婷,朱小年

(1.保定市第一中心醫(yī)院普通外三科,河北 保定 071000;2.保定市第二醫(yī)院婦科,河北 保定 071000;3.桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)系,廣西 桂林 541000)

胃癌(Gastric carcinoma,GC)是消化系統(tǒng)最常見惡性腫瘤之一,是全球第五大常見惡性腫瘤和第三大癌癥相關(guān)死亡原因,病死率位居首位。手術(shù)是目前臨床根治胃癌的唯一方法,其可通過對腫瘤組織及其鄰近受到腫瘤細(xì)胞侵襲的組織進(jìn)行切除,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞及組織的清除[1-2]。盡管其綜合治療的效果顯著提高,但胃癌的高侵襲轉(zhuǎn)移特點(diǎn)導(dǎo)致患者的臨床治愈率和長期生存率仍然很低。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是一種細(xì)胞生物學(xué)過程,其中上皮細(xì)胞通過特定程序下調(diào)上皮特征后獲得間充質(zhì)表型[3-4]。EMT與惡性腫瘤發(fā)生進(jìn)展關(guān)系密切,為開發(fā)潛在的治療靶點(diǎn)提供思路。E-cadherin、Vimentin和N-cadherin 是較為常用的EMT 相關(guān)基因。E-cadherin參與同型細(xì)胞間的黏附連接,在維持細(xì)胞形態(tài)及極性中具有重要作用,是一種經(jīng)典的上皮細(xì)胞標(biāo)志物;Vimentin是細(xì)胞骨架蛋白中的一種,廣泛分布于各種內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞中,在維持間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子中起到重要作用;N-cadherin蛋白表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移[5]。趨化素樣因子超家族8(CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing,CMTM8)作為含有 MARVEL 跨膜結(jié)構(gòu)域的趨化素樣因子超家族成員[6],在包括肝臟、肺、結(jié)直腸、胃、食管等多種實(shí)體瘤中表達(dá)下調(diào)[7],并參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程。最新研究[8-9]表明,CMTM8通過激活Wnt-β-catenin信號通路,誘導(dǎo)腫瘤EMT過程。而CMTM8與胃癌EMT表型的關(guān)系尚未見報(bào)道,本研究通過分析CMTM8與EMT在胃癌組織中的表達(dá),進(jìn)而探討CMTM8與EMT之間的關(guān)系及臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集78例保定市第一中心醫(yī)院2014年1月至2020年5月通過病理確診為胃癌患者的胃癌組織和相應(yīng)癌旁5 cm以上的正常胃黏膜組織。所有患者術(shù)前均未接受任何放療或化療。從患者病歷中收集完整臨床信息,并記錄自手術(shù)日期到死亡日期或最后一次隨訪的生存時(shí)間。病例納入標(biāo)準(zhǔn):符合《胃癌規(guī)范化診療指南(試行)》中診斷表標(biāo)準(zhǔn)[10];有完整的臨床資料;排除標(biāo)準(zhǔn):合并腎間質(zhì)、肝、肺纖維化者;有并發(fā)其他腫瘤者;心、腎功能不全者。本研究通過保定市第一中心醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 試 劑 CMTM8兔抗人多克隆抗體購自Proteintech公司(15039-1-AP),E-cadherin、Vimentin和 N-cadherin兔抗人多克隆抗體均購自北京博奧森生物公司; 免疫組化檢測試劑盒、DAB 顯色劑及 GAPDH 鼠抗人單克隆抗體均購自北京中杉金橋公司。

1.3 免疫組化法檢測CMTM8在胃癌與癌旁正常組織中的表達(dá) 胃組織蠟塊標(biāo)本制成5 μm厚的組織切片,采用免疫組化染色間接染色法按試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化染色。一抗包括CMTM8(1∶150),E-cadherin(1∶300),Vimentin(1∶300),N-cadherin(1∶300)。結(jié)果判定:為了評估CMTM8表達(dá),隨機(jī)選擇每個(gè)標(biāo)本中的5個(gè)區(qū)域,并在顯微鏡下計(jì)數(shù)>500個(gè)細(xì)胞,以確定免疫染色細(xì)胞的平均百分比。按陽性細(xì)胞染色百分比劃分為5個(gè)等級:無陽性細(xì)胞為0分,陽性細(xì)胞數(shù)占6%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,大于75%為4分。根據(jù)染色強(qiáng)度劃分為4個(gè)等級:無染色為0分,淡黃色為1分,黃色為2分,棕黃色為3分。最后將兩項(xiàng)得分相加之和作為CMTM8最終染色得分:>4分定為CMTM8陽性,≤4分定為CMTM8陰性。E-cadherin>50%的細(xì)胞呈棕黃色為陽性; Vimentin>10%的細(xì)胞呈棕黃色顆粒為陽性;N-cadherin>10%的細(xì)胞呈棕黃色為陽性。

1.4 Western blot法檢測CMTM8、EMT標(biāo)志蛋白在胃癌與癌旁正常組織中的表達(dá) 在新鮮的胃癌組織中加入RIPA裂解液后提取組織中的總蛋白,采用 BCA 法測定組織樣品中的蛋白表達(dá)。將總蛋白置于10%的SDS-PAGE中進(jìn)行電泳,分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜后以5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別孵育一抗 CMTM8(1∶1000),4 ℃過夜。次日以相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗 ( 1∶1500) 室溫孵育 2 h,用 ECL 發(fā)光并拍照。結(jié)果用 Image J 軟件進(jìn)行條帶灰度值測定,以與內(nèi)參GAPDH( 1∶1500) 的比值作為各指標(biāo)的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示,采用χ2檢驗(yàn);用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)CMTM8蛋白表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征之間以及EMT標(biāo)志蛋白之間的相關(guān)性;采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析;P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CMTM8蛋白表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系 Pearson相關(guān)檢驗(yàn)表明,患者的性別、年齡、家族史、腫瘤直徑、糖鏈抗原199(CA199)、血清癌胚抗原(CEA)、漿膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與CMTM8表達(dá)無相關(guān)性(r=0.071、3.375、1.012、1.928、0.002、0.238、0.347、0.039,P=0.790、0.066、0.314、0.165、0.964、0.626、0.556、0.843),患者的疾病分化程度、TNM分期、發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與CMTM表達(dá)呈正相關(guān)(r=4.136、5.285、5.309,P=0.042、0.022、0.021);胃癌組織中E-cadherin、Vimentin和N-cadherin的陽性率分別為:30.8%、34.6%和61.5%;CMTM8與E-cadherin表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.242,P=0.006),與Vimentin和N-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.285、-0.332,P=0.002、0.026)。見表1。

表1 CMTM8表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.2 CMTM8在胃癌和癌旁正常黏膜組織中的表達(dá)比較 免疫組化結(jié)果顯示,CMTM8主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中(圖1)。胃癌組織中CMTM8的陽性率(29.49%,23/78),明顯低于癌旁正常黏膜組織(61.54%,48/78)(P<0.01),見表2。

圖1 CMTM8在胃癌和癌旁正常黏膜組織中的表達(dá)(免疫組化染色,×400)

表2 CMTM8在胃癌和癌旁正常黏膜組織中的表達(dá)(例)

2.3 CMTM8與EMT標(biāo)志蛋白在胃癌組織和正常黏膜組織中的表達(dá)比較 胃癌組織中,CMTM8蛋白和E-cadherin蛋白表達(dá)水平低于癌旁正常黏膜組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);胃癌組織中Vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)水平高于癌旁正常黏膜組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見圖2。

A:CMTM8蛋白表達(dá)情況;B:E-cadherin蛋白表達(dá)情況;C:Vimentin蛋白表達(dá)情況;D:N-cadherin蛋白表達(dá)情況;與癌旁正常黏膜組織比較,*P<0.05

2.4 CMTM8蛋白表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 根據(jù)免疫組化結(jié)果,將78例胃癌患者分為陽性表達(dá)組和陰性表達(dá)組,以探討其與預(yù)后的關(guān)系。CMTM8陽性表達(dá)和陰性表達(dá)的胃癌患者中位生存時(shí)間分別為61個(gè)月(95%CI:50.80～71.55)、41個(gè)月(95%CI:33.28～49.60),對數(shù)秩檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn),CMTM8陰性表達(dá)組胃癌患者預(yù)后差于陽性表達(dá)組胃癌患者(P<0.05)。

3 討 論

在腫瘤細(xì)胞中,EMT的發(fā)生往往導(dǎo)致細(xì)胞惡性生物學(xué)行為增強(qiáng),EMT過程使正常細(xì)胞和癌細(xì)胞之間失去細(xì)胞間連接、上皮與基質(zhì)間黏附、正常上皮細(xì)胞極性,從而獲得間質(zhì)細(xì)胞特性[11]。而胃癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移與胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT密切相關(guān)。其特點(diǎn)是上皮標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)下調(diào),間質(zhì)標(biāo)記物Vimentin、N-cadherin表達(dá)上調(diào)[12]。因此,對EMT相關(guān)分子的研究將可能對胃癌的治療及改善預(yù)后起到重要作用。

CMTM8是新近發(fā)現(xiàn)的新型人類趨化性細(xì)胞因子,其表達(dá)產(chǎn)物為4次跨膜蛋白并具有MARVEL結(jié)構(gòu)域,其過表達(dá)可通過減弱EGFR介導(dǎo)的信號傳導(dǎo),加速EGFR從細(xì)胞表面的內(nèi)化,進(jìn)而影響細(xì)胞增殖[13]。CMTM8及其剪接變異體CMTM-V2(缺少由外顯子2編碼的MARVEL結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)的YXX基序)通過半胱天冬依賴和非依賴的途徑誘導(dǎo)多個(gè)腫瘤細(xì)胞系凋亡[14]。

CMTM8在腫瘤中的作用使其成為近年來的研究熱點(diǎn)。先前的研究[15-17]已經(jīng)發(fā)現(xiàn),CMTM8在卵巢癌和腦轉(zhuǎn)移性三陰乳腺癌中低表達(dá),并且在骨肉瘤中確定為新的候選抑癌基因。在膀胱癌中,低表達(dá)的CMTM8與較晚的TNM分期和腫瘤分級相關(guān),提示預(yù)后不良,而過表達(dá)的CMTM8可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[18-19]。本課題結(jié)果表明,CMTM8在胃癌中的表達(dá)低于癌旁正常胃黏膜組織,并與胃癌患者的分化程度、TNM分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),且有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌組中CMTM8蛋白表達(dá)水平低于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組。此外,我們還發(fā)現(xiàn)低表達(dá)的CMTM8提示胃癌患者預(yù)后不良。胡浩等[20]報(bào)道,CMTM8在低級別腎透明細(xì)胞癌的細(xì)胞膜上表達(dá)強(qiáng)度明顯下降,在高級別腎透明細(xì)胞癌的細(xì)胞膜上表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)一步減弱,同時(shí)其肺轉(zhuǎn)移及骨轉(zhuǎn)移組織中細(xì)胞膜表達(dá)水平持續(xù)下降,提示CMTM8與腎透明細(xì)胞癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移呈顯著負(fù)相關(guān)。以上研究結(jié)果與本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致,提示CMTM8表達(dá)下降可能對胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。既往文獻(xiàn)[21]報(bào)道,上調(diào)的CMTM8可以通過HGF/c-MET/ERK信號傳導(dǎo)通路抑制ERK-MAPK通路的激活,從而抑制HepG2肝癌細(xì)胞的EMT過程,進(jìn)而使肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能力減弱。Shi等[8]報(bào)道,CMTM8與溶血磷脂酸(LPA)之間的相互作用導(dǎo)致Wnt-β-catenin信號傳導(dǎo)通路的激活,并因此誘導(dǎo)胰腺癌的EMT過程,這使CMTM8被認(rèn)為是LPA誘導(dǎo)胰腺癌侵襲的關(guān)鍵因素。在一項(xiàng)結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn),CMTM8與上皮相關(guān)標(biāo)志物TJP1呈負(fù)相關(guān),與間充質(zhì)相關(guān)標(biāo)志物如MMP3、MMP7、MMP9呈正相關(guān)[22]。

綜上所述:本研究在胃癌組織水平研究了CMTM8表達(dá)與EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)的關(guān)系,結(jié)果表明:CMTM8與E-cadherin表達(dá)呈正相關(guān),與Vimentin和N-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān);進(jìn)一步Western blot檢測發(fā)現(xiàn),CMTM8高表達(dá)的胃癌組織中,E-cadherin同樣高表達(dá),而Vimentin和N-cadherin低表達(dá),反之亦然,這表明CMTM8參與胃癌的EMT過程,其低表達(dá)促進(jìn)了胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。值得注意的是,本研究雖然與其在結(jié)腸癌中的結(jié)果不一致,但這充分說明了CMTM8乃至其家族功能的復(fù)雜性,可能對不同類型腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生積極或消極的影響。有關(guān)CMTM8的研究尚處于起步階段,探討其與胃癌EMT的關(guān)系有助于揭示胃癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制,使其有望成為胃癌診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。