王 偉,王廣發(fā),閆春良,薛旗山,楊國輝,胡系偉

睡眠呼吸暫停綜合征(sleep apnea syndrome,SAS)是一組臨床常見疾病,主要表現(xiàn)為睡眠呼吸機(jī)能障礙,患病率高、危害嚴(yán)重[1]。臨床上將睡眠呼吸暫停分為阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea,OSA)與中樞型睡眠呼吸暫停(central sleep apnea,CSA),同時(shí)也常見兩種呼吸暫?；旌洗嬖诘幕旌闲运吆粑鼤和?mixed sleep apnea,MSA),其中臨床上以O(shè)SA為主的阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome,OSAHS)最為多見[2]。全球30～69歲的人群中,近10億人患有OSAHS,而中至重度OSAHS者估計(jì)接近4.25億人[3]。我國成年人的OSAHS患病人數(shù)接近1.8億,需要治療的中至重度OSAHS為6000萬～7000萬人[4]。目前,OSAHS的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。OSAHS的病理機(jī)制可能有多因素參與,除了氣道解剖結(jié)構(gòu)外,上氣道擴(kuò)張肌活動、通氣穩(wěn)定性的神經(jīng)調(diào)控以及中樞呼吸調(diào)控機(jī)制可能也參與其中,并發(fā)揮著重要的作用[5]。5-羥色胺(serotonin,5-HT)是一種重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì),研究發(fā)現(xiàn)5-HT與睡眠呼吸暫停關(guān)系密切,5-HT及其受體在呼吸中樞的調(diào)控和OSAHS的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[6]。本團(tuán)隊(duì)前期在麻醉并切斷大鼠雙側(cè)頸部迷走神經(jīng)條件下通過微透析的方法提高大鼠舌下神經(jīng)核5-HT及5-HT2受體激動劑水平,監(jiān)測大鼠頦舌肌肌電活動,發(fā)現(xiàn)提高Sprague-Dawley(SD)大鼠舌下神經(jīng)核整體5-HT及5-HT2受體激動劑水平可以提高SD大鼠頦舌肌肌電活動,從而證明提高SD大鼠舌下神經(jīng)核整體5-HT及5-HT2濃度可以增加SD大鼠舌下神經(jīng)核的興奮性[7-8]。但以上研究均是在麻醉并切斷大鼠雙側(cè)頸部迷走神經(jīng)的條件下完成的,并不能反映自然基礎(chǔ)狀態(tài)下5-HT對舌下神經(jīng)核的調(diào)節(jié)作用,為了進(jìn)一步研究自然狀態(tài)下5-HT對舌下神經(jīng)核的調(diào)節(jié)作用,本研究選取自然狀態(tài)下SD大鼠通過微透析方法給予舌下神經(jīng)核5-HT,觀察5-HT對大鼠睡眠呼吸暫停的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 由于SD大鼠是天然的中樞性呼吸暫停動物模型,本實(shí)驗(yàn)選取健康雄性SD大鼠8只,體質(zhì)量280～350 g,由北京聯(lián)合利華實(shí)驗(yàn)動物中心提供。SD大鼠均可自由活動、進(jìn)食、飲水;飼養(yǎng)溫度(22±2)℃,濕度40%;并予明暗周期(08:00～20:00開燈;20:00次日08:00熄燈)適應(yīng)。飼養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 微透析導(dǎo)管、腦電及肌電電極安放方法 SD大鼠通過腹腔注射氯胺酮及戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉,給予大鼠腹腔注射地塞米松及阿托品以減少大鼠腦水腫及氣道分泌物。觀察大鼠角膜反射消失,將大鼠頭部固定在腦立體定位儀上,并對其顱頂部皮膚剃毛消毒。從大鼠雙眼連線水平向后剪開顱頂皮膚并暴露頸肌,清潔顱骨表面,清晰顯現(xiàn)顱頂及十字縫。以十字縫為坐標(biāo)軸原點(diǎn),確定四針腦電電極于坐標(biāo)系的對稱位置,即分別位于(0.15,0.25)mm、(-0.15,0.25)mm、(-0.15,-0.25)mm、(0.15,-0.25)mm,用微型電鉆鉆透顱骨,將腦電極插入鉆孔內(nèi),切勿損傷硬腦膜,將電極板固定在顱骨表面,并將連接在肌電電極的導(dǎo)線引入頸部肌肉中,打結(jié)固定并縫合頸部皮膚。按《大鼠腦立體定位儀圖譜》定位舌下神經(jīng)核坐標(biāo):前囟后(14.0±0.5)mm,俯側(cè)(9.5±0.1)mm,中線旁(0.3±0.02)mm,用微型電鉆鉆透顱骨,切勿損傷硬腦,將微透析導(dǎo)管緩慢置入大鼠舌下神經(jīng)核內(nèi)并固定。術(shù)后將大鼠分籠單獨(dú)飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件同術(shù)前,1周后,觀察大鼠無異常后進(jìn)行睡眠呼吸監(jiān)測。

1.3 藥物配制 5-HT濃度為10～50 mmol/ L對舌下神經(jīng)核團(tuán)的影響最為明顯[9]。因此,本實(shí)驗(yàn)將5-HT溶解于新鮮人工腦脊液(ACSF)中,配制成濃度為10 mmol/ L的溶液備用。

1.4 睡眠呼吸監(jiān)測 睡眠監(jiān)測時(shí)間為360 min(11:00～17:00),此時(shí)間段為大鼠的生理睡眠時(shí)間。監(jiān)測前1 d相同時(shí)間將大鼠置于相同環(huán)境中預(yù)適應(yīng),以保證大鼠于監(jiān)測當(dāng)天能順利入睡,監(jiān)測時(shí)將上述電極與多導(dǎo)生理儀相連。監(jiān)測第1天未給藥,對大鼠進(jìn)行睡眠呼吸監(jiān)測;第2天,通過微量泵及微透析導(dǎo)管將新鮮ACSF以0.4 μL/min的速度勻速泵入舌下神經(jīng)核,共144 μL,同時(shí)進(jìn)行睡眠呼吸監(jiān)測;第3天以同樣的方法將新鮮配制的5-HT溶液通過微量泵及微透析導(dǎo)管泵入舌下神經(jīng)核,同時(shí)對大鼠進(jìn)行睡眠呼吸監(jiān)測。

1.5 肌電監(jiān)測 應(yīng)用生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),每隔10 s為一屏進(jìn)行分析,根據(jù)腦電及肌電波形,采用單盲法人工確定睡眠分期,分別為清醒期、非快速眼動(non-rapid eye movement,NREM)睡眠期及快速眼動(apideye-movemen,REM)睡眠期。同時(shí)采用單盲法人工進(jìn)行嘆息后呼吸暫停(post-sigh apnea,PS)及自發(fā)性呼吸暫停(spontaneous apnea,SP)的判斷,計(jì)算機(jī)記錄睡眠和呼吸的分析結(jié)果。分析完畢后,軟件自動計(jì)算各期睡眠時(shí)間及發(fā)生呼吸暫停的次數(shù),并計(jì)算嘆息后呼吸暫停指數(shù)(post-sigh apnea index,PSAI)、自發(fā)性呼吸暫停指數(shù)(spontaneous apnea index,SPAI)。

1.6 微透析導(dǎo)管植入確認(rèn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠再次通過腹腔注射氯胺酮及戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉,通過微量泵及微透析導(dǎo)管向大鼠舌下神經(jīng)核緩慢注入中性紅(2 μL/min)15 min進(jìn)行染色。將所有大鼠腦組織進(jìn)行冰凍切片,通過顯微鏡判斷微透析導(dǎo)管是否植入舌下神經(jīng)核。結(jié)果顯示,8只SD大鼠舌下神經(jīng)核微透析導(dǎo)管均植入準(zhǔn)確無誤,檢測正常(見圖1、圖2)。

圖1 大鼠腦組織切片(A為4倍鏡下圖;B為8倍鏡下圖;紅色部分為中性紅通過微透析導(dǎo)管注入舌下神經(jīng)核團(tuán)染色所致)

圖2 《大鼠腦立體定位圖譜》[10]中舌下神經(jīng)核與第四腦室位置(4V為第四腦室;Ⅻth為舌下神經(jīng)核)

2 結(jié) 果

2.1 不同處理因素對各期睡眠時(shí)間的影響

2.1.1 對NREM期睡眠時(shí)間的影響 給予ACSF時(shí)NREM期睡眠時(shí)間與未給藥時(shí)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給予5-HT時(shí)NREM期睡眠時(shí)間與未給藥時(shí)、給予ACSF時(shí)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 不同處理因素對各期睡眠時(shí)間的影響比較(±s) 單位:min

2.1.2 對REM期睡眠時(shí)間的影響 給ACSF時(shí)REM期睡眠時(shí)間與未給藥時(shí)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給5-HT時(shí)NREM期睡眠時(shí)間與未給藥時(shí)、給ACSF時(shí)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

2.2 不同因素對睡眠呼吸暫停的影響

2.2.1 對NREM期睡眠呼吸暫停的影響 給ACSF時(shí),NREM期PSAI、SPAI與未給藥時(shí)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給5-HT時(shí),NREM期PSAI、SPAI與未給藥時(shí)、給ACSF時(shí)比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 不同處理因素對睡眠呼吸暫停的影響比較(±s) 單位:次/h

2.2.2 對REM期睡眠呼吸暫停的影響 給ACSF時(shí),REM期PSAI、SPAI與未給藥時(shí)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給5-HT時(shí),REM期PSAI、SPAI與未給藥時(shí)、給ACSF時(shí)比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

3 討 論

睡眠呼吸暫停綜合征是一類患病率高、危害嚴(yán)重并可涉及各年齡段人群的疾病[11]。其中,以O(shè)SAHS在臨床上最為多見[12]。OSAHS病人在睡眠時(shí)存在上氣道完全或部分阻塞,在臨床上可表現(xiàn)為反復(fù)睡眠時(shí)打鼾、呼吸表淺、呼吸暫停,甚至憋醒、晨起頭痛、白天嗜睡、疲勞、低通氣、低氧血癥和高碳酸血癥等,具有潛在的危害,是引起心腦血管疾病尤其是高血壓的重要原因之一,甚至引起死亡[13]。OSAHS是涉及多個(gè)系統(tǒng)的復(fù)雜疾病,其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。在臨床工作中發(fā)現(xiàn)OSAHS病人在接受氣管切開治療后常出現(xiàn)CSA[14-15]。因此,OSAHS的發(fā)病機(jī)制除了與氣道解剖結(jié)構(gòu)的異常有關(guān)外,可能還涉及中樞機(jī)制[16]。研究顯示,5-HT與睡眠呼吸暫停關(guān)系密切,5-HT及其受體對舌下神經(jīng)核興奮性及呼吸中樞具有重要的調(diào)節(jié)作用[17]。但是由于血腦屏障的存在,5-HT在外周和中樞的作用截然不同[18]。腦內(nèi)的5-HT能神經(jīng)纖維在呼吸中樞及呼吸運(yùn)動神經(jīng)元均有分布,通過作用于呼吸中樞及呼吸運(yùn)動神經(jīng)元的5-HT受體,在呼吸的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[19]。OSAHS病人NREM期5-HT興奮性較清醒期降低,并在REM期進(jìn)一步降低,同時(shí)伴隨著舌下神經(jīng)發(fā)放沖動的減少,因而導(dǎo)致頦舌肌、頦舌骨肌、腭帆張肌等睡眠依賴的上氣道肌肉張力下降,造成了OSAHS病人氣道的狹窄和塌陷均發(fā)生在睡眠狀態(tài),并且在REM期更為嚴(yán)重,可能是OSAHS的發(fā)病機(jī)制之一[20]。

研究發(fā)現(xiàn),OSAHS動物模型給予5-HT后,舌下神經(jīng)核興奮性增加,頦舌肌活動明顯增加,上氣道不易塌陷,但上述研究都是在麻醉切斷迷走神經(jīng)或者去大腦條件下進(jìn)行的,相比較處于清醒或自然睡眠狀態(tài)的動物,麻醉去大腦或者切斷迷走神經(jīng)的動物中縫核活性是增加的,有更多的5-HT傳遞至舌下神經(jīng)核[21]。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在研究自然睡眠狀態(tài)下SD大鼠,通過微透析方法向舌下神經(jīng)核緩慢持續(xù)給予5-HT,觀察5-HT對SD大鼠睡眠呼吸暫停的作用。

本研究以SD大鼠為模型進(jìn)行相關(guān)研究,樣本量較少,結(jié)論存在局限性。本研究結(jié)果顯示,通過微透析的方法提高舌下神經(jīng)核整體5-HT濃度可改善SD大鼠NREM期及REM期的睡眠呼吸暫停。提高舌下神經(jīng)核整體5-HT濃度對SD大鼠NREM期及REM期睡眠時(shí)間無影響,表明舌下神經(jīng)核與5-HT及其受體在呼吸的調(diào)控中具有重要作用。同時(shí)本研究結(jié)果也存在一定的不足,首先腦內(nèi)的微透析結(jié)果只能反映固定時(shí)間范圍內(nèi)舌下神經(jīng)核對大鼠睡眠呼吸暫停的影響,并不能完全反映大鼠睡眠呼吸暫停情況,同時(shí)腦部植入微透析導(dǎo)管及腦電電極的安置均會對腦組織產(chǎn)生一定的損傷;其次,5-HT通過其受體發(fā)揮作用,不同受體功能不一,機(jī)制復(fù)雜[22-23]。本研究采用的5-HT濃度為10 mmol/L,由于5-HT參與睡眠調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)與受體類型和劑量濃度大小有關(guān),因此對于5-HT及其受體不同濃度對大鼠中樞舌下神經(jīng)核興奮性及睡眠呼吸暫停產(chǎn)生的影響仍需進(jìn)一步探討。因此,為進(jìn)一步闡明睡眠呼吸暫停的發(fā)病機(jī)制、尋找更具針對性的治療,還需對5-HT各受體亞型功能進(jìn)行更深入的研究。同時(shí),本研究以SD大鼠為研究對象,雖然大鼠是CSA的動物模型,但該動物的腦電活動及呼吸暫停與人類較相似,可作為睡眠呼吸暫停研究的天然動物模型,但研究結(jié)果并不能完全反映人類睡眠呼吸暫停的情況。因此,5-HT及舌下神經(jīng)核對人類睡眠呼吸暫停的影響仍需要進(jìn)一步深入研究。