陳瀅如,路士華,王 震,程 艷

心肌纖維化(myocardial fibrosis,MF)是以在正常心肌組織中的細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix,ECM)過(guò)度堆積為主要表現(xiàn)的疾病。心肌纖維化破壞心肌結(jié)構(gòu)進(jìn)而導(dǎo)致心肌紊亂,引起心臟電、機(jī)械和血管舒縮功能的不良變化,還可加劇心臟疾病事件的發(fā)生率[1]。目前心血管疾病仍是全球最常見(jiàn)的死亡原因[2],冠心病、主動(dòng)脈瓣狹窄和高血壓是心肌纖維化最常見(jiàn)的病因[3],心肌纖維化可出現(xiàn)在多種心臟疾病的過(guò)程中[4]。西醫(yī)主要以血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素受體拮抗劑、醛固酮拮抗劑、β受體阻滯劑、他汀類(lèi)等藥物治療。心肌纖維化屬于中醫(yī)學(xué)“心悸”“胸痹”“怔忡”等范疇,中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的治療特點(diǎn)。

養(yǎng)心氏片為周次清教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方,由黃芪、人參、丹參、延胡索、山楂、黨參、靈芝、葛根、當(dāng)歸、淫羊藿、地黃、黃連、炙甘草13味藥物組成,具有益氣活血、行脈止痛之效。研究表明,養(yǎng)心氏片具有改善血流動(dòng)力學(xué)、保護(hù)心肌、調(diào)節(jié)代謝、抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善抑郁等作用,廣泛應(yīng)用于冠心病的臨床治療且效果顯著[5],但是作用于心肌纖維化的機(jī)制研究較少。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討?zhàn)B心氏片治療心肌纖維化的潛在作用機(jī)制,并利用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)養(yǎng)心氏片的有效活性成分和受體蛋白分子進(jìn)行虛擬結(jié)合,以挖掘其作用靶點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 養(yǎng)心氏片活性成分檢索及相關(guān)靶點(diǎn)篩選 通過(guò)中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)(TCMSP,https://tcmspw.com)檢索黃芪、黨參、丹參、葛根、淫羊藿、山楂、地黃、當(dāng)歸、黃連、延胡索、靈芝、人參、甘草13味中藥的活性成分,由于中藥進(jìn)入體內(nèi)多通過(guò)有效成分入血發(fā)揮作用,故根據(jù)口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且類(lèi)藥性(drug-likeness,DL)≥0.18對(duì)活性成分信息進(jìn)行初步篩選[6],以獲得活性成分及作用靶點(diǎn),根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充預(yù)測(cè)到的活性成分的已知靶點(diǎn)。在Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)對(duì)活性成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范。

1.2 心肌纖維化相關(guān)靶點(diǎn)篩選 運(yùn)用基因名片數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards,https://www.genecards.org)、藥物遺傳學(xué)與藥物基因組學(xué)知識(shí)庫(kù)(PharmGKB,Pharmacogenetics and Pharmacogenomics Knowledge Base)、在線(xiàn)人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM,http://omim.org)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://go.drugbank.com/)及治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(TTD,http://db.idrblab.net/ttd/)分別以“cardiac fibrosis”或“myocardial fibrosis”為關(guān)鍵詞檢索獲得心肌纖維化相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將養(yǎng)心氏片的活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)上傳至Venny圖網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取交集作為養(yǎng)心氏片抗心肌纖維化的共有靶點(diǎn),獲得交集靶點(diǎn),利用 Cytoscape 3.8.0 軟件進(jìn)行可視化分析。

1.4 養(yǎng)心氏片“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)格構(gòu)建 通過(guò)軟件Cytoscape 3.8.0進(jìn)行養(yǎng)心氏片“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析。圖中以“節(jié)點(diǎn)”表示藥物,以“邊”表示活性成分與靶點(diǎn)之間的關(guān)系。

1.5 基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析與京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析 利用R語(yǔ)言軟件通過(guò)GO和KEGG對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程及作用通路分析,并將結(jié)果以條形圖、氣泡圖形式呈現(xiàn)。

1.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證 選取PPI網(wǎng)絡(luò)中度值(Degree)較高的靶點(diǎn),在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)獲取靶蛋白及配體結(jié)構(gòu),利用Pymol軟件對(duì)蛋白進(jìn)行脫水,清除配體,再將處理好的蛋白利用AutoDock vina軟件進(jìn)行加清等操作后轉(zhuǎn)為＊pdbqt格式,進(jìn)行分子對(duì)接并計(jì)算最低結(jié)合效能,評(píng)價(jià)養(yǎng)心氏片主要活性成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合活性。

2 結(jié) 果

2.1 養(yǎng)心氏片活性成分及靶點(diǎn) 通過(guò)篩選并去除重復(fù)成分后獲得符合條件的活性化合物269個(gè)、中藥預(yù)測(cè)靶點(diǎn)4 787個(gè)。養(yǎng)心氏片各中藥化學(xué)成分及預(yù)測(cè)靶點(diǎn)信息見(jiàn)表1。

表1 養(yǎng)心氏片各中藥化學(xué)成分及預(yù)測(cè)靶點(diǎn)信息

2.2 心肌纖維化相關(guān)靶點(diǎn) 將GeneCards、OMIM、PharmGKB、DrugBank、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的心肌纖維化疾病相關(guān)靶點(diǎn)合并,并剔除重復(fù)項(xiàng),最終獲得候選疾病靶點(diǎn)5 537個(gè)。將疾病靶點(diǎn)與活性成分靶點(diǎn)取交集獲得224個(gè)重復(fù)基因,運(yùn)用Venny 2.1制作韋恩圖(見(jiàn)圖1)。

圖1 養(yǎng)心氏片中藥活性成分與心肌纖維化基因數(shù)據(jù)庫(kù)韋恩圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將224個(gè)疾病與活性成分靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)中,將數(shù)據(jù)初步篩選后導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。詳見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 心肌纖維化與中藥活性成分靶點(diǎn)交集圖

圖3 心肌纖維化與中藥活性成分靶點(diǎn)交集PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖分析 將養(yǎng)心氏片中13味中藥的有效成分整理編號(hào),并篩選出共有成分,統(tǒng)一編號(hào)如“MOL000392=A1”,并將整理好的活性成分和靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中,構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖4),圖中包括521個(gè)節(jié)點(diǎn)和5 086條邊,通過(guò)Cytoscape 3.8.0軟件中“Network Analyzer”的功能計(jì)算出不同節(jié)點(diǎn)的Degree值,Degree值越大,節(jié)點(diǎn)面積越大,表示該節(jié)點(diǎn)的生物功能越重要。

圖4 藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因的GO與KEGG富集分析

2.5.1 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因的GO富集分析 對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析,運(yùn)用R軟件分析后獲得生物過(guò)程(biological process,BP)2 043個(gè)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)29個(gè)、分子功能(molecular function,MF)74個(gè)。排名前10位靶點(diǎn)基因的GO富集分析結(jié)果詳見(jiàn)圖5。

圖5 養(yǎng)心氏片和心肌纖維化“交集靶點(diǎn)”的GO富集分析

2.5.2 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因的KEGG富集分析 KEGG富集分析獲得165條結(jié)果,將富集顯著性最大的20條結(jié)果以氣泡圖輸出。詳見(jiàn)圖6。

2.6 分子對(duì)接分析 利用AutoDock vina軟件,選取PPI網(wǎng)絡(luò)Degree值排名前8位的蛋白與養(yǎng)心氏片作用心肌纖維化Degree值排名前8位的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接,以最低結(jié)合效能表示分子與靶點(diǎn)的結(jié)合性,將結(jié)果以熱圖形式展示,見(jiàn)圖7。靶點(diǎn)蛋白與藥物成分之間的結(jié)合活性度越高,結(jié)合能則越小,表示對(duì)接性越好,以≤-5.0 kJ/mol表示分子與靶點(diǎn)結(jié)合性較好[7]。對(duì)接結(jié)合效能最小的4個(gè)模型的相互作用見(jiàn)圖8。

圖7 分子對(duì)接結(jié)合熱圖

圖8 核心成分與靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)合較好的4個(gè)結(jié)果圖

3 討 論

心肌纖維化在心血管疾病中普遍存在,心肌纖維化可引起心肌舒縮、傳導(dǎo)功能及代謝異常,并在心室重構(gòu)中發(fā)揮重要作用,造成心力衰竭、各種心律失常等心血管疾病的發(fā)生,心肌纖維化是導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)的重要因素之一,但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚[8]。中醫(yī)根據(jù)辨證選方進(jìn)行個(gè)體化用藥,具有副作用小、耐藥性低、能有效緩解病人臨床癥狀等優(yōu)勢(shì)[9]。因此,中醫(yī)藥在治療心肌纖維化方面隱藏著巨大潛力。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)并結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)和醫(yī)學(xué)信息等多學(xué)科知識(shí)進(jìn)行探討,正契合了中醫(yī)學(xué)整體觀和辨證論治的治療原則。

3.1 養(yǎng)心氏片關(guān)鍵靶點(diǎn)分析 本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)分析養(yǎng)心氏片治療心肌纖維化的潛在作用機(jī)制,獲得養(yǎng)心氏片活性成分269個(gè),其作用于心肌纖維化的潛在靶點(diǎn)4 787個(gè);通過(guò)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)獲得心肌纖維化相關(guān)靶點(diǎn)5 537個(gè),養(yǎng)心氏片治療心肌纖維化潛在靶點(diǎn)224個(gè)。PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示,養(yǎng)心氏片治療心肌纖維化的靶點(diǎn)主要有表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、雌激素受體(ESR1)、白細(xì)胞介素-1B(IL-1B)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1 (JUN)、腫瘤壞死因子(TNF)、腫瘤蛋白p53(TP53)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGFA)等;結(jié)合文獻(xiàn)分析,其中AKT1信號(hào)傳導(dǎo)可抑制血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)及改善壓力過(guò)載引起的心臟重塑,參與心肌肥厚和重塑過(guò)程,進(jìn)而改善心功能[10]。TNF是免疫中樞的調(diào)節(jié)因子,有促炎作用,研究表明腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)和腫瘤壞死因子受體2(TNFR2)對(duì)組織重塑、肥大、炎癥和細(xì)胞死亡產(chǎn)生相反的作用,TNFR1激活會(huì)加劇左心室重構(gòu),而TNFR2會(huì)改善左心室重構(gòu)[11]。TP53是2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,在心肌損傷后TP53蛋白水平短暫降低,TP53表達(dá)或活性的潛在調(diào)節(jié)劑多存在于心肌損傷部位,包括大分子損傷、炎癥和缺氧等,其在細(xì)胞分化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要作用[12]。EGFR是一種跨膜糖蛋白,是表皮生長(zhǎng)因子受體家族中的一員,屬于受體酪氨酸激酶家族。EGFR作為細(xì)胞表面蛋白可與配體如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)結(jié)合,EGFR被激活后可再磷酸化下游蛋白,調(diào)節(jié)存活的信號(hào)通路[13]。綜上所述,養(yǎng)心氏片關(guān)鍵靶點(diǎn)可通過(guò)改善炎癥反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞的凋亡、改善心室重塑、改善心功能等不同角度來(lái)抗心肌纖維化,達(dá)到治療目的。

3.2 養(yǎng)心氏片活性成分分析 在“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析中,活性成分Degree值排名較前的活性成分為β-谷甾醇、異黃酮、芒柄花黃素、金英花堿、異鼠李素、山柰酚、槲皮素等,與疾病靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)密切,可能是養(yǎng)心氏片治療心肌纖維化的核心活性成分。其中β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗抑郁等生物活性,其通過(guò)調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體/核因子激活的B細(xì)胞的κ-輕鏈(PPARγ/NF-κB)增強(qiáng)信號(hào)來(lái)延緩心肌損傷,以減少心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡程度[14]。槲皮素作用于一氧化氮合成酶抑制劑直接對(duì)體內(nèi)的一氧化氮發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,可減輕心肌損傷[15]。異黃酮可降低心臟病的發(fā)病率,減少血清總膽固醇濃度,抑制氧自由基產(chǎn)生及脂質(zhì)過(guò)氧化;還可通過(guò)介導(dǎo)一氧化氮合酶的激活促進(jìn)一氧化氮生成并釋放,起到保護(hù)血管內(nèi)皮的作用;研究發(fā)現(xiàn),血管內(nèi)皮富含的雌激素受體(β-ER)是異黃酮首選的結(jié)合點(diǎn)[16-17]。異鼠李素對(duì)過(guò)氧化氫(H2O2)和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,其以濃度依賴(lài)性方式抑制AngⅡ誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成,從而達(dá)到預(yù)防心肌纖維化的作用[18]。山柰酚則可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心室重構(gòu),下調(diào)心肌組織成纖維化程度[19]。以上均表明養(yǎng)心氏片有效成分可能通過(guò)抗炎、抗氧化、減少心肌內(nèi)皮細(xì)胞損傷,從而達(dá)到抗心肌纖維化的作用。

3.3 活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)作用分析 GO分析結(jié)果顯示,在生物學(xué)過(guò)程中主要通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)、上皮細(xì)胞增殖、DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性等來(lái)調(diào)控;在細(xì)胞組分方面則有膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等核心基因富集;在分子功能上則有轉(zhuǎn)錄因子、配體激活等核心基因富集,表明養(yǎng)心氏片可能通過(guò)上述富集結(jié)果發(fā)揮作用。

KEGG富集結(jié)果表明,交集靶點(diǎn)主要富集在心肌纖維化晚期糖基化終末產(chǎn)物/晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(AGE/RAGE)信號(hào)通路、低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17(IL-17)信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路、C型凝集素受體信號(hào)通路。這些通路可能是養(yǎng)心氏片抗心肌纖維化的主要通路。AGE/RAGE信號(hào)通路已被證明與增加的肌成纖維細(xì)胞形成和間質(zhì)纖維化獨(dú)立相關(guān),可重塑激活的心肌細(xì)胞[20]。HIF-1是維持氧平衡的重要調(diào)節(jié)因子,通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成和血管重塑來(lái)控制氧氣的輸送,還可在代償肥大階段刺激適應(yīng)性血管生成發(fā)揮保護(hù)作用,但下調(diào)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中HIF-1表達(dá),可抑制內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化,改善心肌纖維化[21-22]。TNF信號(hào)通路可逆轉(zhuǎn)心血管結(jié)構(gòu)和功能,其中,TNF-α是TNF信號(hào)通路的一種促炎細(xì)胞因子,TNF-α中的B細(xì)胞還參與抗心肌纖維化[23]。研究表明,IL-17及相關(guān)細(xì)胞因子可導(dǎo)致間質(zhì)纖維化和微血管內(nèi)皮功能障礙,其在促心肌纖維化和不可逆左心室重構(gòu)中發(fā)揮重要作用,充分表明其是心肌纖維化的危險(xiǎn)因素[24]。松弛素是胰島素-松弛素超家族中的一種6 kDa肽,通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體、松弛素家族肽受體1進(jìn)而激活多個(gè)信號(hào)通路,達(dá)到抑制心律失常、抗炎、逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的作用[25]。除C型凝集素受體信號(hào)通路未查到相關(guān)報(bào)道外,其余文獻(xiàn)報(bào)道與本研究結(jié)果一致,分子對(duì)接結(jié)果也佐證了主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)均具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。

綜上所述,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù),對(duì)養(yǎng)心氏片治療心肌纖維化的活性成分、作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路進(jìn)行闡述,結(jié)果顯示養(yǎng)心氏片抗心肌纖維化具有多靶點(diǎn)、多成分、多通路的作用,為臨床應(yīng)用提供依據(jù),但是上述核心靶點(diǎn)和通路有待進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,為臨床實(shí)踐和基礎(chǔ)研究提供更強(qiáng)有力的支持。