李 菡 李 云 任學軍 王 健 郭振清 林小虎，* 韓玉翠，*

（1河北科技師范學院農學與生物科技學院/河北省作物逆境生物學重點實驗室，河北 秦皇島 066004；2河北科技師范學院鄉(xiāng)村振興研究中心，河北 秦皇島 066004）

鹽堿脅迫是主要的非生物脅迫之一，影響植物正常的新陳代謝和生長發(fā)育，甚至導致植物死亡［1］。全世界有超過4×109hm2的鹽堿地，約占全球鹽漬化土壤面積的50%，而我國鹽堿化土地面積超過3.7×107hm2［2-3］。在高濃度鹽堿成分的土壤中種植農作物往往會造成農作物大幅度減產，甚至絕收［4-5］。小麥是世界上主要的糧食作物之一，也是鹽堿地開發(fā)利用的主要作物之一［6］；但研究表明，在鹽堿條件下，小麥產量損失仍超過60%［7］。因此，深入研究小麥強耐鹽堿種質的耐鹽堿機理，進而選育耐鹽堿、高產的小麥新品種對保障耕地面積和糧食安全具有重要意義［8］。

經過進化，植物其有三種自我調節(jié)方式以應對鹽堿脅迫，即合成有機調節(jié)物質和無機離子進行滲透調節(jié)以應對滲透脅迫［9］；把鈉離子外排到植物體外或者在細胞內進行離子區(qū)隔化從而調節(jié)植物體內離子平衡以應對離子脅迫［10］；提高超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶和抗壞血酸酶等保護酶的活性，減少膜脂的過氧化作用以應對氧化脅迫［11］。植物為應對鹽堿脅迫引起的過氧化作用而形成的抗氧化系統(tǒng)包括：活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除酶，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）；參與抗氧化反應的谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）和抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）［12-14］；抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）、酚類化合物（類黃酮、花青素）、a-生育酚、類胡蘿卜素和脯氨酸等非酶抗氧化劑。這些抗氧化酶及非酶抗氧化劑可以清除ROS或減輕ROS過量累積對細胞膜的損傷，進而減緩鹽堿脅迫對植物的損傷［15］。賴弟利等［16］發(fā)現(xiàn)NaCl脅迫下，葉綠素含量、POD活性與燕麥幼苗耐鹽性呈正相關，丙二醛含量與幼苗耐鹽性呈負相關。陳春舟等［17］研究表明，在0.20 mol·L-1NaCl溶液脅迫下，小麥的苗長、根鮮重、苗鮮重、根干重、苗干重均低于對照，抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性均較對照升高。Zeeshan等［18］發(fā)現(xiàn)，苗期鹽處理后，小麥品種間以及根和葉處理間的SOD、POD、CAT、GR 等抗氧化酶活性均存在顯著差異。

有關小麥苗期耐鹽的形態(tài)指標和生理機制已取得一定成果，但我國大部分鹽漬化土壤為濱海鹽堿土，其最大特點是鹽堿組成與海水一致［19］，目前利用模擬海水研究小麥苗期耐鹽堿的生理響應機制仍鮮見報道，且不同小麥品種對鹽堿脅迫的響應機制存在一定差異。因此，本研究以兩個對鹽堿脅迫耐受性不同的小麥品種為試驗材料，分析模擬海水脅迫下不同鹽耐受性小麥品種的形態(tài)特點和生理特征，旨在為增強鹽堿地小麥的耐受性，擴大鹽堿地的利用范圍，實現(xiàn)小麥鹽堿地的高產栽培提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以河北省作物逆境生物學重點實驗室保存的津農7 號、煙農15、泰農18、師欒02-1、濟麥22、山農21、新麥9號、青豐1號、石農952、中麥998、邯5092、濟麥229、魯麥21、煙農836、德抗961 為試驗材料，以上材料由西北農林科技大學韓德俊課題組提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子處理及播種 挑揀發(fā)育良好、外觀相近的種子，置于10%的NaClO 溶液中消毒5 min，用蒸餾水沖洗3～5遍。4 ℃條件下浸種催芽24 h后，挑選長勢一致的小麥種子置于盛有等量石英砂的培養(yǎng)盒中，平均種植密度為1株·cm-2，放置于人工氣候箱進行培養(yǎng)，設置溫度25 ℃，光暗周期為14 h/10 h，空氣濕度60%，澆灌霍格蘭營養(yǎng)液，間隔2 d換一次。

1.2.2 鹽堿脅迫濃度及品種篩選 小麥生長至兩葉一心期時，開始進行脅迫，利用0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 倍標準鹽堿度模擬海水的霍格蘭營養(yǎng)液（標準鹽堿度溶液成分見表1），根據作物逆境栽培與種質創(chuàng)新課題組前期研究基礎，對6個小麥材料（津農7號、煙農15、泰農18、濟麥22、邯5092、濟麥229）進行處理，每處理3 次重復，每3 d 更換一次處理液。測定地上部鮮重、地上部干重、根鮮重，計算相對值并分析其差異顯著性，確定篩選濃度，并利用此濃度對15 個小麥材料進行處理，在脅迫后0、2、4、6、8、10 d時，每個重復隨機選取5株小麥，立即進行形態(tài)指標分析。

表1 標準鹽堿度模擬海水成分（鹽堿度為35‰）Table 1 Simulated seawater composition under standard saline-alkali degree（saline-alkali degree is 35‰）

1.2.3 不同耐鹽堿型品種的水培生理試驗 利用1.2.2 得到的適宜鹽堿篩選濃度（0.6 倍標準鹽度模擬海水）對耐鹽堿型品種中麥998和敏感型品種濟麥229進行水培試驗，鹽堿脅迫及形態(tài)指標測定方法同上；在脅迫第0、第2、第4、第6、第8 天時，每個重復隨機剪取10 株小麥的第1 和第2 片葉片，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，供生理指標分析。

1.2.4 生長發(fā)育指標的測定 測量苗高（莖頂端生長點到根莖之間的距離）、根長，并調查小麥苗的根數；使用電子分析天平稱量地上部鮮重及根鮮重，然后105 ℃殺青30 min，75 ℃烘干至恒重，稱量地上部干重及根干重。

1.2.5 丙二醛含量測定 丙二醛（malondialdehyde content，MDA）含量測定采用試劑盒說明書的方法測定，試劑盒購自蘇州科銘生物技術有限公司。MDA 含量計算公式如下：

MDA含量(nmol·g-1FW) = 25.8 ΔA ÷ W ΔAMDA= A532nm- A600nm

式中，A為吸光度；W為樣本質量。下同。

1.2.6 抗氧化酶活性測定 過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）活性測定采用試劑盒說明書的方法測定，試劑盒購自蘇州科銘生物技術有限公司。計算公式如下：

POD活性(U·g-1FW) = 2 000ΔA ÷ W

CAT活性(μmol·min-1·g-1FW) = 4.45(ΔA - 0.001 3) ÷ W

GR活性(nmol·min-1·g-1FW) = 536ΔA ÷ W

ΔAPOD= A測定- A405nm

ΔACAT= A470nm，2min- A470nm，1min

ΔAGR=A340nm- A340nm，180s。

1.2.7 抗氧化非酶類物質的測定 還原型谷胱甘肽（GSH）含量、氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量按照試劑盒說明書中的方法進行測定，試劑盒購自蘇州科銘生物技術有限公司。計算公式如下：

GSH(μmol·g-1FW) = 0.667ΔA ÷ W

GSSG(nmol·g-1FW) = 36.23(ΔA + 0.001 1) ÷ W

ΔAGSH=A測定- A空白

ΔAGSSG=A412nm，150s- A412nm，30s。

1.3 數據處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2010 軟件進行數據整理并作圖，各性狀指標以平均值±標準差表示，用DPS 7.05 軟件進行方差分析，用最小顯著差異法（least sifnificant difference，LSD法）進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同耐鹽堿型小麥品種篩選

由表2 可知，脅迫至4 d 時，在0.6 倍濃度下6 個品種的相對地上部鮮重和干重、相對根鮮重表現(xiàn)出一致的差異顯著性，即濟麥229和邯5092的3個指標顯著低于其余品種，煙農15、泰農18和濟麥22的3個指標顯著低于津農7號。因此，確定0.6倍標準鹽堿度模擬海水為適宜的耐鹽堿篩選濃度。進一步利用0.6 倍標準鹽堿度模擬海水的霍格蘭營養(yǎng)液對15 個小麥材料進行鹽堿處理，對各性狀指標進行綜合評價（表3），獲得極端耐鹽堿類型品種中麥998 和極端敏感類型品種濟麥229，后續(xù)試驗以中麥998和濟麥229為供試小麥品種。

表2 鹽堿脅迫（4 d）下6個品種間形態(tài)指標多重比較Table 2 Multiple comparison of morphological indices among 6 varieties under saline-alkali stress（4 d）

表3 小麥品種耐鹽堿性鑒定結果Table 3 Determination of saline-alkali tolerance of varieties

2.2 鹽堿脅迫對小麥幼苗葉片生長的影響

由圖1 可知，濟麥229 脅迫至6 d 時，第1 片葉全部黃化；脅迫至10 d 時，第1 和第2 片葉全部黃化萎蔫，且植株不能正常生長。中麥998 脅迫至6 d 時，第1 片葉開始黃化；脅迫至10 d 時，第1 片葉完全黃化萎蔫，第2 片葉開始黃化，但植株仍能保持正常生長。相同鹽堿脅迫條件下，中麥998 的生長狀況明顯優(yōu)于濟麥229。

圖1 兩小麥品種在鹽堿脅迫6～10 d時的生長情況Fig.1 Growth of two wheat varieties under saline-alkali stress at 6-10 d

2.3 鹽堿脅迫對小麥形態(tài)指標的影響

由表4 可知，與對照相比，鹽堿脅迫下濟麥229 和中麥998的苗高均從脅迫第4天開始顯著降低；隨著脅迫時間延長，兩品種苗高的降幅除中麥998第8天外均呈增加趨勢；中麥998的降幅均小于濟麥229，脅迫第10天時兩品種降幅均最大，分別為45.20%（濟麥229）、34.04%（中麥998）。鹽堿脅迫下兩品種最大根長隨處理天數的增加整體呈先升高后降低的趨勢。與對照相比，濟麥229 和中麥998 的最大根長分別從脅迫第2 和第4 天時開始顯著降低。中麥998 的降幅均低于濟麥229，中麥998和濟麥229的降幅分別為5.04%～9.35%和8.88%～23.76%。與對照相比，濟麥229的初生根數在脅迫2～8 d 時無顯著差異，脅迫第10 天時顯著下降，降幅為34.74%；中麥998 的初生根數在鹽堿脅迫下均無顯著差異。

表4 鹽堿脅迫對兩小麥品種形態(tài)指標的影響Table 4 Effects of saline-alkali stress on morphological indices of two wheat varieties

2.4 鹽堿脅迫對小麥苗期物質積累的影響

由表5可知，與對照相比，鹽堿脅迫下濟麥229和中麥998 地上部鮮重前期（0～2 d、0～4 d）均無顯著差異，后期（4～10 d、6～10 d）均顯著降低，降幅隨處理時間的延長呈上升趨勢。與對照相比，鹽堿脅迫下，濟麥229和中麥998 的地上部鮮重分別在脅迫第4 和第6 天時開始顯著降低，脅迫至第10 天時分別降低75.15%和48.90%，中麥998的降幅均小于濟麥229。濟麥229的根鮮重在脅迫至第4 天時開始較對照顯著降低，且降幅隨著處理天數的增加而逐漸增大。中麥998 的根鮮重在脅迫2～6 d 時較對照顯著增加，脅迫8～10 d 時無顯著差異。

表5 鹽堿脅迫對兩小麥品種物質積累的影響Table 5 Effects of saline-alkali stress on substance accumulation in two wheat varieties

在鹽堿脅迫下，濟麥229的地上部干重在脅迫2 d時最大，但與對照無顯著差異，脅迫至4 d 時開始較對照顯著下降，且降幅隨著處理天數的增加呈先升高后降低趨勢。中麥998 的地上部干重在脅迫至2 d 時較對照顯著升高，脅迫至4 d時開始較對照無顯著差異。與對照相比，濟麥229的根干重在鹽堿脅迫2～8 d時無顯著差異，脅迫至10 d 時顯著降低了33.88%；中麥998的根干重在脅迫第2天時無顯著差異，脅迫第4天時較對照顯著增加62.34%，之后無顯著差異。

由圖2 可知，與對照相比，濟麥229 的根冠比在脅迫第2和第10天時降低，4～8 d時升高，其中4 d時顯著升高29.76%；中麥998的根冠比在脅迫第2天時降低，4～10 d時升高，但差異均不顯著。

圖2 鹽堿脅迫對兩小麥品種根冠比的影響Fig.2 Effects of saline-alkali stress on root-to-shoot ratio of two wheat varieties

2.5 鹽堿脅迫對小麥葉片抗氧化酶活性的影響

由圖3-A可知，與對照相比，鹽堿脅迫下濟麥229的CAT活性在脅迫第2天時顯著降低，脅迫4和6 d時顯著增加，脅迫8 d時稍有下降但差異不顯著。隨著處理天數的增加，中麥998的CAT活性在鹽堿脅迫下呈先升高后下降趨勢，脅迫2～6 d時較對照顯著增加，脅迫第8天時無顯著差異。中麥998的CAT 活性較對照開始增加的時間早于濟麥229，且增加幅度較大。

由圖3-B可知，與對照相比，鹽堿脅迫下濟麥229葉片POD 活性呈上升趨勢，脅迫至6 d 時開始顯著升高。隨著處理天數的增加，中麥998 葉片POD 活性在脅迫下呈先下降后升高的趨勢，脅迫第2 天時較對照顯著降低，脅迫第4 天時較對照增加但差異不顯著，脅迫至6 d時開始顯著增加，增幅高于濟麥229。

由圖3-C 可知，濟麥229 的GR 活性在脅迫2～6 d時較對照無顯著差異，脅迫第8 天時較對照顯著增加。隨著處理天數的增加；鹽堿脅迫下中麥998 的GR 活性呈先升高后降低的趨勢，脅迫第2 天時較對照無顯著差異，脅迫第4 天時開始顯著增加，增幅大于濟麥229。

圖3 鹽堿脅迫對兩小麥品種CAT、POD、GR活性的影響Fig.3 Effects of saline-alkali stress on CAT，POD，GR activities of two wheat varieties

2.6 鹽堿脅迫對小麥葉片抗氧化非酶類物質的影響

由圖4-A可知，與對照相比，兩小麥品種葉片GSSG含量均在脅迫第2 和第6 天時顯著增加，中麥998 的增幅大于濟麥229，其余處理時間差異不顯著。

圖4 鹽堿脅迫對兩小麥品種GSSG含量、GSH含量、GSH/GSSG 比值的影響Fig.4 Effects of saline-alkali stress on GSSG content，GSH contents，GSH/GSSG ratio of two wheat varieties

由圖4-B 可知，鹽堿脅迫下兩小麥品種葉片GSH含量較對照均不同程度增加，且增加幅度隨處理天數的增加呈上升趨勢。與對照相比，濟麥229和中麥998的葉片GSH 含量分別在脅迫第6、第2 天時開始顯著增加。相較于濟麥229，中麥998葉片GSH含量較對照升高時間早，且增幅大。

由圖4-C 可知，兩品種的GSH/GSSG 比值在脅迫第2 天時較對照降低，但差異均不顯著，濟麥229 和中麥998 分別在脅迫第8、第4 天時開始顯著增加，且中麥998的增幅大于濟麥229。

2.7 鹽堿脅迫對小麥葉片MDA含量的影響

由圖5可知，鹽堿脅迫下，隨著處理天數的增加，兩小麥品種葉片MDA 含量呈先升高后降低的趨勢，脅迫至2 d時開始較對照顯著增加。與對照相比，鹽堿脅迫下濟麥229 的MDA 含量增幅隨著脅迫時間的延長而增加，且均高于中麥998。

圖5 鹽堿脅迫對兩小麥品種MDA含量的影響Fig.5 Effects of saline-alkali stress on MDA content in two wheat varieties

3 討論

3.1 耐鹽堿性鑒定與評價

植物耐鹽堿種質資源的鑒定與評價是耐鹽堿機制研究及培育耐鹽堿品種的重要前提和保證［20］。李琳等［21］研究發(fā)現(xiàn)，全株干重、地上部鮮重、根鮮重在第1至5 主成分表達式中的系數較大，可作為蕓豆苗期耐鹽堿性的鑒定指標。李小康等［22］對鹽脅迫下的耐鹽性綜合評價結果表明，鹽脅迫條件下141份人工合成六倍體小麥根干/鮮重及干重根冠比的變異程度都較大（＞80%），說明地上部干/鮮重和根鮮重的相對值可作為耐鹽堿性評價的重要指標。本研究發(fā)現(xiàn)，在鹽堿脅迫下，地上部干/鮮重和根鮮重的相對值均較對照降低，且不同品種間存在差異，說明這3 個指標對鹽堿脅迫的響應均較敏感，可作為小麥耐鹽堿性品種鑒定與評價的指標。

3.2 鹽堿脅迫對小麥形態(tài)特性的影響

小麥生長發(fā)育受鹽堿脅迫的影響較大，且影響程度因不同生長發(fā)育時期而異［23］。劉妍妍等［19］研究表明，小麥苗期較芽期對人工海水脅迫更為敏感。馬雅琴等［24］對28個小麥材料進行耐鹽性鑒定表明，苗期鹽害指數較小的材料在鹽漬土壤上種植表現(xiàn)出較高的保苗率，且最終產量較高。以上研究結果表明苗期是作物耐鹽堿的重要時期，因此，本研究對篩選出的兩個不同耐鹽堿基因型小麥品種進行了鹽堿脅迫下苗期形態(tài)特征及生理特性的相關研究。根作為吸收水分和營養(yǎng)的主要器官，當植物處于鹽堿脅迫下，最先抑制根對水分和營養(yǎng)的吸收，進而影響植物地上部分的生長［25］。任永哲［26］研究表明，鹽脅迫能促進小麥幼苗根系鮮/干重的增加。本研究表明，鹽堿脅迫導致鹽堿敏感型品種濟麥229 的根鮮/干重較對照降低，耐鹽堿型品種中麥998 的根鮮/干重較對照增加，說明耐鹽堿品種會通過根的迅速生長來應對脅迫。同時，本研究表明，隨著模擬海水脅迫時間的延長，相較于中麥998，濟麥229 的苗高、最大根長、地上部鮮/干重降低，說明鹽堿脅迫最終抑制敏感型小麥品種濟麥229 的生長，這與馮鞏俐等［27］、孫君艷等［28］的研究結果相似。植物不同部位對鹽堿的敏感性差異致使植物生物量分配發(fā)生變化，根冠比則反映植物在逆境條件下生物量的分配策略［29］。本研究表明，鹽堿脅迫下，中麥998 和濟麥229 的根冠比在脅迫4～8 d時較對照升高，其中濟麥229在脅迫第4 天時較對照顯著增加，這可能是由于地上部生長受到抑制，導致根冠比升高。此外，鹽堿脅迫對中麥998幼苗生長形態(tài)指標的影響明顯小于濟麥229，說明在鹽堿脅迫下耐鹽堿型小麥品種中麥998 能夠正常完成生長發(fā)育進程，而鹽堿敏感型小麥品種濟麥229 的生長受抑制，最終萎蔫死亡。

3.3 鹽堿脅迫對小麥生理特性的影響

植物在正常生理狀態(tài)下，體內ROS的產生和清除保持一種動態(tài)平衡［30］。SOD是清除ROS的活性酶，能催化過氧陰離子發(fā)生歧化反應，生成H2O2，進一步在POD、CAT 等抗氧化酶的作用下轉化成H2O 和O2，從而提高植物對逆境的耐受能力［30-31］。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著脅迫時間的延長，鹽堿脅迫下兩品種CAT 活性整體呈現(xiàn)先增加后降低趨勢，而POD 活性整體呈現(xiàn)增加趨勢，與前人研究結果相似［11，31］，說明兩品種在應對鹽堿脅迫時前期以調動CAT 途徑為主，后期以POD途徑為主。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，與對照相比，中麥998在脅迫第2 天時CAT 活性就開始顯著提高，而濟麥229 直到脅迫4 d時才顯著提高，說明鹽堿脅迫下濟麥229 對CAT途徑的調動晚于中麥998。另外，與對照相比，中麥998 在脅迫至2 d 時的POD 活性顯著降低，但CAT 活性顯著提高；濟麥229 在脅迫至2 d 時的POD 活性無顯著差異，但CAT活性顯著降低。說明不同耐受性品種的抗氧化酶系統(tǒng)對鹽堿脅迫的響應有所不同，植物主要通過提高保護酶活性以維持較高耐鹽堿能力來抵御鹽堿脅迫的危害。

GR 催化GSSG 轉化為GSH，并維持GSH 的還原狀態(tài)，在防御系統(tǒng)中對清除ROS起著至關重要的作用［32-33］。因此GSH 和GSSG 含量以及GSH/GSSG 比值能很好地反映細胞所處的氧化還原狀態(tài)。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，NaCl 脅迫下耐鹽小麥和大麥葉片及根系中的GR 活性顯著增加［18］，且GSH含量和GSH/GSSG比值增加［34］。本研究表明，模擬海水脅迫下，耐鹽堿型品種中麥998 的GSH含量顯著高于對照，相比之下，鹽堿敏感型品種濟麥229 的GSH 含量顯著低于對照。同時，中麥998 的GR 活性高于濟麥229，能夠維持較高的GSH/GSSG 比率，說明中麥998 中GR 活性的增強加速了GSH 的轉化，有利于清除植物體內的ROS。

MDA 是脂質過氧化產物之一，其含量通常作為植物耐鹽堿性評價的指標［9］。王婧澤等［35］研究發(fā)現(xiàn)，玉米體內的MDA 含量隨著鹽濃度的增大呈先升高后降低的變化趨勢。Feki等［36］研究發(fā)現(xiàn)，兩個小麥品種的MDA含量在NaCl脅迫下顯著增加。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽堿脅迫下，隨著脅迫時間的延長，兩品種小麥葉片MDA 含量呈先升高后降低的趨勢，相較于中麥998，濟麥229 的MDA 含量升高。說明在鹽堿脅迫下，濟麥229 植株體內的氧化壓力持續(xù)增加，細胞膜質過氧化嚴重，抗氧化能力較低，最終導致植株死亡。

本研究初步探明了中麥998 的耐鹽堿特點及生理響應機制。Quan 等［37］研究表明，較低的Na+/K+和高效的抗氧化系統(tǒng)有助于耐鹽基因型小麥在鹽脅迫下的生長。豆昕桐等［11］研究表明，耐鹽型小麥品種可分別通過其較強的K+/Na+和Ca2+/Na+調節(jié)能力緩解滲透脅迫和活性氧損傷，從而表現(xiàn)出耐鹽特征。為綜合分析不同耐鹽堿基因型品種的耐鹽堿生理機制，后續(xù)試驗將對K+、Ca2+、Na+含量及其比值等生理指標進行研究。

4 結論

模擬海水脅迫下，小麥幼苗的生長受到抑制，鹽堿敏感型品種濟麥229 受抑制的程度明顯高于耐鹽堿型品種中麥998。模擬海水脅迫導致小麥幼苗葉片MDA含量較對照顯著上升并引起抗氧化酶POD、CAT、GR活性的提高，中麥998 的抗氧化酶活性高于濟麥229。隨著脅迫時間的延長，中麥998幼苗葉片的GR 活性高于濟麥229，能夠維持較高的GSH/GSSG 比率，有利于清除植物體內的ROS，說明耐鹽堿品種在苗期可以通過抗氧化酶系統(tǒng)緩解模擬海水脅迫導致的氧化損傷。