周冬梅,李蓮芳,朱存福, 顧 夢,張合瑤,李小軍,劉 嫻,侯海雄,王文俊
(1.西南林業(yè)大學林學院,昆明 650224;2.西南林業(yè)大學西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點實驗室,昆明 650224)
滇油杉(Keteleeria evelyniana)為松科(Pinaceae)油杉屬喬木樹種,其主要分布于云南,四川西南部和貴州西部等地區(qū),分布區(qū)海拔1 400~2 500 m;云南主要以滇中為分布中心[1]。滇油杉干形通直,樹形優(yōu)美,樹皮耐火,因此,可用其作為分布區(qū)的優(yōu)質(zhì)用材林和防火隔離帶樹種;其耐蔭,可與多種樹種混交成林[2-5]。在滇中,滇油杉的嫩莖葉作為森林蔬菜食用,可結合森林撫育開展資源有效利用。
滇油杉種子無堅硬的外種皮保護,種皮富含油腺,種子富含油脂,故此,成熟種子貯存期間油脂易氧化,種子容易失去生活力。已有研究指出,滇油杉種子在室溫下貯藏,其生活力最長保持時間為6個月,采集制種后采用0.45 g/L IBA和0.30 g/L IAA混合溶液浸種可提高滇油杉種子發(fā)芽率(56.0%)和發(fā)芽勢(27.0%),縮短發(fā)芽時間[6-7]。姜若超等[8]發(fā)現(xiàn),0.1 g/L 的GA3和0.05%的殼寡糖(chitosan oligosaccharide, COS)溶液混合浸種提高滇油杉種子場圃發(fā)芽(69.6%)。褪黑素(melatonin, MT)是一種多功能的植物生長調(diào)節(jié)劑,其廣泛存在于動植物體內(nèi)[9],具有極強的抗氧化功能,有效緩解活性氧積累的傷害,保護細胞結構,清除自由基[10]。已有研究發(fā)現(xiàn),褪黑素可以有效緩解鹽脅迫、干旱脅迫、鎘脅迫、低溫和高溫等脅迫的傷害[11-14]。黎力乙等[15]指出,150 mmol/L NaCl溶液脅迫下,0.1 mmol/L褪黑素浸種對苜蓿(Medicago sativa)種子緩解鹽脅迫極為有效。王慧等[16]采用褪黑素溶液葉面噴施和根施干旱脅迫的黑麥草(Lolium perenne)和苜蓿植株,黑麥草的生物量分別增加14.5%和29.6%,苜蓿的則增加36.6%和49.1%;提高黑麥草和苜蓿的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化物酶(peroxidase, POD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)活性以及N、P 含量,減少葉片中丙二醛(malondialdehyde, MDA)的積累,抗氧化能力和保護酶活性顯著提高。向警等[17]在水稻(Oryza sativa)種子的試驗中發(fā)現(xiàn),0.2 mmol/L的褪黑素溶液浸種后,可有效緩解鹽脅迫對水稻種子的傷害,提高種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、主根長及CAT活性;0.4 mmol/L的褪黑素溶液浸種后則有效提高種子的SOD和POD活性。
目前,滇油杉在其分布區(qū)森林面積較小,且碎片化,人工林培育是恢復其森林植被的主要途徑,苗木培育是造林的基礎。雖然已有滇油杉種子發(fā)芽和苗木培育的相關試驗研究,但促進種子發(fā)芽的措施僅開展生長激素浸種等方面的研究。本研究基于滇油杉種子富含油脂而易氧化的特性,采用不同濃度的褪黑素溶液浸種,了解外源褪黑素對滇油杉種子發(fā)芽和苗木抗氧化能力的影響,為滇油杉種子發(fā)芽及苗木培育提供科學依據(jù),豐富褪黑素在種子發(fā)芽方面應用的相關資料。
試驗于2022 年3 月底在西南林業(yè)大學林學院苗圃(102°45'E,25o03'N;海拔約1 890 m)中進行,其屬亞熱帶低緯度高原山地季風氣候,日照長,霜期短,年均氣溫約14.7 ℃,年均降水量1 035 mm,年均相對濕度68.2%,年均日照時長2 200 h;土壤類型為山地紅壤[18],試驗地位于滇油杉的分布中心。滇油杉種子于2021年12月采自宜良縣國有花園林場(103°14'E,24°92'N;海拔約1 700 m),制種后測定的種子生活力為40.0%,種子貯藏于通風干燥的室溫條件下,播種時種子已在室溫下貯藏4 個月。褪黑素購自上海源葉生物科技有限公司(CAS 號S20287)的分析純粉劑,采用無紡布容器(9 cm×9 cm)進行發(fā)芽和苗木培育。
根據(jù)已有文獻和本試驗的種子特性確定褪黑素的濃度梯度,其濃度為0.3~1.2 mmol/L,并增加1個不處理的對照(表1),采用單因素完全隨機設計進行試驗實施,試驗共5個處理,每處理450粒種子(3次重復,每重復150粒)。
表1 試驗的因素水平表Table 1 Factorial levels of the trial
試驗前平整苗床,將采集的苗圃土分裝入容器中,采用0.5% KMnO4溶液對基質(zhì)和苗床進行消毒。選取大小一致,形態(tài)飽滿的滇油杉種子,按試驗設計分別用紗布包裹后置于不同濃度褪黑素溶液中浸種12 h,浸種結束后,將種子播入無紡布容器中,每處理90 個無紡布容器,每個容器中播種5 粒種子,播種后均勻覆蓋一層基質(zhì)并澆透水,搭建塑料拱棚,保證種子發(fā)芽所需溫度,拱棚上覆蓋遮陰網(wǎng)。發(fā)芽和苗木培育期間定期澆水除草。
種子發(fā)芽后,每2 d 記錄1 次發(fā)芽數(shù);待發(fā)芽結束后,計算發(fā)芽率(%)、發(fā)芽勢(%)、平均發(fā)芽時間(d)和發(fā)芽指數(shù)(粒/d)。發(fā)芽指標的計算公式如下[19]:
式中,n為測定時間內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù);N為置床的種子數(shù);N0為日發(fā)芽種子數(shù)達到最高峰時正常發(fā)芽的種子數(shù);di為從播種之日算起的天數(shù),ni為相應各日正常發(fā)芽粒數(shù)。
苗齡65 d 時,測定其幼苗生長和生物量,具體方法為苗木取回實驗室后測定地徑、苗高、胚軸長和針葉數(shù),之后每株編號分根、莖、葉測定生物量鮮重,分單株按編號密封于信封內(nèi)置入120 ℃烘箱內(nèi)殺青2 h,再調(diào)至50 ℃烘干至恒重,稱其烘干重,計算根、莖、葉的含水率。生長和生物量測定的同期,每處理選擇3~5 株苗木,隨機剪取一定數(shù)量的針葉混合,稱取0.2 g針葉,采用乙醇浸提法[20],測定其葉綠素和類胡蘿卜素含量;MDA 含量、CAT、POD 和SOD 活性使用蘇州格瑞思生物科技的試劑盒采用硫代巴比妥法[21]、紫外吸收法[22]、愈創(chuàng)木酚比色法[21]和WST-8 法[21]于紫外分光光度計(UV-6100 Double Beam Spectrophotometer)上進行測定。
采用Microsoft Excel 2016 和SPSS 26.0 軟件進行數(shù)據(jù)整理和分析。處理間若指標呈現(xiàn)顯著或極顯著差異,采用鄧肯氏(Duncan's)法進行多重比較;相關性采用Pearson法分析[23]。
不同濃度褪黑素溶液浸種的滇油杉種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢分別為41.5%~60.0%和14.5%~32.1%,CK的則為40.4%和15.2%;低濃度(0.3 mmol/L)褪黑素處理的發(fā)芽率和發(fā)芽勢顯著高于對照的(P發(fā)芽率=5.50E-05<0.01,P發(fā)芽勢=9.42E-07<0.01),與對照相比提高了48.5%和111.2%,發(fā)芽率和發(fā)芽勢隨著褪黑素濃度的升高呈現(xiàn)下降的趨勢(圖1),結合此二指標,說明低濃度的褪黑素溶液浸種有利于種子發(fā)芽。
褪黑素處理的平均發(fā)芽時間和發(fā)芽指數(shù)分別為12.6~14.6 d 和4.5~7.2 粒/d;CK 的 為13.3 d 和4.2粒/d,其中,1.2 mmol/L的平均發(fā)芽時間顯著地長于其余處理的(P=1.10E-02<0.05),該濃度浸種延長種子發(fā)芽時間,降低發(fā)芽率;發(fā)芽指數(shù)與平均發(fā)芽時間相一致,隨著褪黑素溶液浸種濃度提高而降低;綜合平均發(fā)芽時間和發(fā)芽指數(shù),0.3 mmol/L的褪黑素溶液浸種,提高種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的同時,實現(xiàn)其發(fā)芽整齊一致(圖1),即0.3 mmol/L 的褪黑素溶液浸種有益于滇油杉種子發(fā)芽。
圖1 處理的發(fā)芽性狀Figure 1 Germination indexes of treatment
2.2.1 苗木生長
苗齡65 d 時,褪黑素處理的地徑、苗高、胚軸長、主根長和針葉數(shù)分別為0.8~0.9 mm、6.7~7.6 cm、3.0~3.6 cm、7.4~9.9 cm 和17.0~23.0 針/株(對照的分別為0.9 mm、6.5 cm、4.3 cm、7.4 cm 和15.8針/株),其苗高和針葉數(shù)優(yōu)于對照;處理間,0.3 mmol/L 褪黑素溶液浸種的主根長顯著長于除1.2 mmol/L 以外其余處理(P=5.10E-02<0.05),針葉數(shù)也是該濃度的最多;對照的胚軸較褪黑素浸種的長(表2)。種子培育的滇油杉苗木,其地上部分為萌蘗芽形成的無性系苗木,較長的胚軸推遲萌蘗芽形成,影響苗木生長,因此,褪黑素溶液浸種縮短胚軸,促進萌蘗芽快速發(fā)育,提高種子發(fā)芽和促進苗木生長。
2.2.3 苗木含水率
褪黑素處理的根、莖和葉的含水率分別為70.8%~75.7%、78.7%~80.7%和75.2%~84.8%,對照的分別為67.0%、76.3%和74.3%,褪黑素處理的均高于對照的;處理間,0.3 mmol/L褪黑素溶液浸種的針葉含水率顯著地高于其余處理的(P=1.30E-02<0.05;表2),即褪黑素溶液浸種同時可調(diào)節(jié)滇油杉幼苗的器官含水量。
表2 滇油杉幼苗生長及其器官含水統(tǒng)計Table 2 Statistics of seedling growth and water contents in organs of K. evelyniana seedlings
與生長測定的同期,褪黑素溶液浸種處理的葉綠素和類胡蘿卜素含量分別為0.96~1.43 mg/g 和0.16~0.23 mg/g(CK 的為0.98 mg/g 和0.21 mg/g);與發(fā)芽性狀和生長相同,0.3 mmol/L 褪黑素溶液浸種的葉綠素含量極顯著地高于其余處理的(P=1.75E-05<0.01),說明該濃度處理后,對種子發(fā)芽、葉綠素積累及苗木生長有著重要作用,隨著褪黑素濃度的升高葉綠素含量呈逐漸下降的趨勢;與葉綠素含量不同,0.9 mmol/L 處理的類胡蘿卜素含量極顯著高于其余處理的(P=4.18E-04<0.01),隨著褪黑素濃度的升高,類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)先增后降的趨勢(圖2),表明葉綠素和類胡蘿卜素合成對褪黑素浸種濃度的響應不一致,但濃度都不宜較高。
圖2 滇油杉幼苗葉綠素和類胡蘿卜素含量Figure 2 Chlorophyll and carotenoid contents of K. evelyniana seedlings
褪黑素溶液浸種處理的滇油杉幼苗葉片SOD、POD 和CAT 活性分別為210.8~360.7 U/(g·min)、24.4~64.9 U/(g·min)和1 754.6~1 916.3 U/(g·min),CK 的分別為185.4 U/(g·min)、34.8 U/(g·min)和1 532.1 U/(g·min),其中,褪黑素處理的SOD和CAT活性均高于對照的,處理間,SOD、POD 和CAT 活性具有極顯著的差異(P=1.20E-06~3.41E-03<0.01);0.3 mmol/L 處理的SOD 和POD 活性最高,CAT 活性最高的則是0.6 mmol/L 處理的,但0.3 mmol/L 處理的與其無顯著的差異(圖3)。綜合來說,0.3 mmol/L的褪黑素浸種提高滇油杉幼苗保護酶活性,可以增強對環(huán)境變化的抵御能力,促進苗木生長。
褪黑素處理的MDA 含量為9.5~17.0 nmol/g,對照處理的MDA 含量(25.6 nmol/g)顯著地高于褪黑素處理的(P=1.13E-02<0.05),與保護酶活性相一致,0.3 mmol/L 處理的MDA 含量最低(圖3)。MDA含量越高,苗木受膜脂過氧化傷害越大,因此,也進一步證明0.3 mmol/L褪黑素處理可以有效清除活性氧,有利于苗木抗性的提高。
圖3 不同處理幼苗的抗氧化酶Figure 3 Antioxidant enzymes of different treatment seedlings
相關分析結果(表3)表明,滇油杉種子發(fā)芽率與針葉數(shù)、葉綠素含量、SOD 活性、POD 活性之間,葉綠素含量與SOD活性、POD活性之間呈顯著或極顯著正相關關系(P<0.05或P<0.01);地徑和發(fā)芽率之間,苗高和地徑之間,MDA含量與發(fā)芽率、葉綠素含量、SOD 活性之間顯著或極顯著負相關關系(P<0.05 或P<0.01)。表明經(jīng)褪黑素溶液處理種子,滇油杉種子發(fā)芽性狀、幼苗器官生長及其含水率、幼苗生理特性間既有相互促進的,也有相互抑制的,可根據(jù)其相關性,選擇適宜濃度的褪黑素溶液浸種提高種子發(fā)芽性狀和苗木生長。
表3 滇油杉幼苗生長指標和生理指標間的相關性分析Table 3 Correlation analysis between growth index and physiological index of K. evelyniana seedlings
生理后熟是指種子的種胚在形態(tài)上看似發(fā)育完全,但種胚的生理狀態(tài)不具備發(fā)芽條件的現(xiàn)象[24]。王嚴嚴[25]發(fā)現(xiàn),額敏貝母(Fritillaria meleagroides)種子形態(tài)成熟后存在生理后熟現(xiàn)象,其中內(nèi)源抑制物可能是導致生理休眠的原因。劉自剛等[26]研究結果指出,桔梗(Platycodon grandiflorum)開花后55 d時,種子發(fā)芽率為53.0%,55~61 d 時,發(fā)芽率達93.3%,說明種子具有生理后熟現(xiàn)象。本研究制種后測定的滇油杉種子生活力為40.0%,室溫儲藏4 個月后播種,褪黑素處理的發(fā)芽率為60.0%,對照的40.4%,發(fā)芽率均高于生活力,與前述兩篇文獻的類似,滇油杉種子是否也具有生理后熟現(xiàn)象,需要開展相關的研究進行判斷。
種子發(fā)芽是苗木培育的基礎,其發(fā)芽性狀直接影響后期的苗木生長[14]。褪黑素作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑,被廣泛用于種子發(fā)芽與苗木生長的試驗中。已有研究表明,褪黑素有促進種子發(fā)芽,提高根系生長發(fā)育的作用[15]。劉珂等[27]發(fā)現(xiàn),0.1 mmol/L褪黑素處理后顯著改善香椿(Toona sinensis)種子的發(fā)芽性狀;董秋麗等[28]試驗表明,干旱脅迫下,0.15和0.20 mmol/L 褪黑素分別處理12和6 h時,達烏里胡枝子(Lespedeza davurica)種子發(fā)芽率最高;李陽[29]研究發(fā)現(xiàn),褪黑素處理棉花(Gossypiumspp.)種子后,可有效緩解NaCl 脅迫對棉花幼苗根系活力的抑制作用,提高其發(fā)芽率,促進幼苗下胚軸生長;唐鴻呂[30]研究指出,0.15 mmol/L 褪黑素處理種子,顯著提高低溫脅迫下甘藍(Brassica oleraceavar.capitata)種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和幼苗胚根長,促進幼苗地上部分、地下部分的生長及苗木生物量的積累。本研究中,0.3 mmol/L褪黑素浸種后,極顯著地提高滇油杉種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢,隨著褪黑素濃度的升高,發(fā)芽率呈下降趨勢,與前述文獻低濃度的褪黑素有益于種子發(fā)芽的類似,但本研究改善種子發(fā)芽性狀的褪黑素濃度略高于文獻的,是否更低濃度褪黑素浸種會更有利于提高滇油杉種子的發(fā)芽率,有待進一步試驗研究。
葉綠體是植物進行光合作用的重要場所,葉綠素存在于光合膜上[31]。已有研究表明,外源褪黑素處理可提高植物的葉綠素含量。張盼盼等[12]進行褪黑素處理生菜(Lactuca sativa)幼苗的試驗指出,褪黑素溶液根施可緩解干旱脅迫對生菜幼苗的傷害,顯著增加總根長、地上地下部分干物質(zhì)質(zhì)量、葉綠素含量等(P<0.05)。史中飛等[32]發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下0.1 mmol/L 褪黑素預處理后油菜(Brassica napus)幼苗的葉綠素含量增加28.5%。本研究中,0.3 mmol/L和0.6 mmol/L褪黑素處理顯著提高滇油杉幼苗的葉綠素含量和類胡蘿卜素含量,與對照相比提高32.7%和9.0%,與史中飛等[32]的研究結果基本一致。隨著褪黑素濃度的升高,葉綠素的含量呈下降趨勢,即高濃度的褪黑素對葉綠素的合成產(chǎn)生不同程度的抑制,低濃度促進葉片葉綠素合成,這與徐向東等[33]的研究結果相一致,也許葉綠素合成與褪黑素的濃度間存在一個匹配閾值。
已有研究表明,褪黑素可通過提高植物的抗氧化能力而降低逆境引發(fā)的氧化脅迫對植物生長發(fā)育的影響[34]。古咸彬等[9]發(fā)現(xiàn),中低濃度(0.1~0.2 mmol/L)褪黑素通過抑制H2O2和MDA 的生成,增強抗氧化酶的活性,從而緩解干旱對桃(Prunus persica)苗木的氧化傷害。施雨[35]發(fā)現(xiàn),低濃度褪黑素處理后,苜蓿種子中MDA含量隨褪黑素濃度的增加先下降后上升。劉建龍[36]研究表明,褪黑素浸種后,顯著降低干旱脅迫下番茄(Solanum lycopersicum)幼苗葉片中的MDA 含量,增加SOD、CAT 和POD 活性。張娜等[37]的試驗研究指出,褪黑素處理后,可有效提高NaCl 脅迫下狼尾草(Pennisetum alopecuroides)SOD、CAT 和POD 等抗氧化酶活性,降低MDA 的含量,從而緩解鹽脅迫對狼尾草幼苗的傷害。本研究中,未經(jīng)褪黑素處理的滇油杉幼苗的MDA 含量均高于褪黑素處理的,除1.2 mmol/L 處理的POD 活性低于對照的外,其余POD、SOD 和CAT活性均高于對照的,揭示褪黑素處理后,可以有效清除活性氧,降低膜脂過氧化對滇油杉種子的傷害,提高幼苗的POD、SOD 和CAT 活性,與張娜等[37]研究結果一致。MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物,未經(jīng)褪黑素處理的滇油杉種子,內(nèi)部油脂氧化后對種子發(fā)芽產(chǎn)生脅迫,從而種子產(chǎn)生的多余自由基導致膜脂過氧化,對種子的發(fā)芽產(chǎn)生傷害,也許這是導致未經(jīng)褪黑素處理的種子發(fā)芽率較低的原因。
基于褪黑素可以緩解植物體內(nèi)受多種因素脅迫的結論[9,11-17,27-30,32-39],本研究褪黑素處理后,提高滇油杉種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢,促進主根生長,顯著提高幼苗的光合色素含量,降低膜脂氧化損傷,抑制MDA 的積累,提高抗氧化酶的活性,有益于苗木生長。
本試驗采用單因素完全隨機設計,開展褪黑素不同溶液濃度處理對滇油杉種子發(fā)芽及幼苗生長和生理指標影響的試驗。褪黑素溶液浸種顯著或極顯著提高滇油杉種子發(fā)芽性狀、影響光合色素含量及抗氧化物質(zhì)的活性(P<0.05 或P<0.01)。綜合發(fā)芽、幼苗生長和生理特性,0.3 mmol/L褪黑素溶液浸種全面提高種子發(fā)芽性狀、光合色素形成和改善保護酶的活性,促進苗木生長,可應用于滇油杉的種子處理。