李鎮(zhèn)宏，李昊卿，李嘉欣，曾憲垠，韓興發(fā)

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安 625014）

骨骼肌生長沉積是影響家畜生產(chǎn)性能及飼養(yǎng)經(jīng)濟效益的主要因素之一[1-2]。骨骼肌細(xì)胞分化、生長及肌肉沉積受多種內(nèi)分泌激素調(diào)控。公畜中，睪酮和胰島素樣生長因子1（IGF1）是促進骨骼肌生長沉積的主要激素，而糖皮質(zhì)激素則是引起骨骼肌降解萎縮的主要激素[3]。3 種激素間的動態(tài)拮抗平衡是決定公畜骨骼肌沉積量的重要機制[3]。

在畜牧生產(chǎn)中，手術(shù)去勢又稱外科閹割是一種古老且廣泛采用的生產(chǎn)管理技術(shù)，常用于降低公畜間的爬跨、打斗行為，以及改善畜禽肉品質(zhì)[4-5]。近年來隨著社會對動物福利的日趨重視，手術(shù)去勢越來越不被人們所接受[6]。目前，促性腺激素釋放激素（GnRH）主動免疫又稱免疫去勢，已成為替代傳統(tǒng)手術(shù)去勢的動物友好的新去勢方法[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，去勢引起的動物性激素缺乏[9]或是衰老引起人的性激素分泌降低[10]均導(dǎo)致骨骼肌萎縮。手術(shù)去勢與免疫去勢均顯著降低動物性激素含量[8,11-12]，但免疫去勢公畜骨骼肌肉含量通常顯著高于手術(shù)去勢公畜[7-8]。手術(shù)去勢與免疫去勢如何差異影響動物骨骼肌沉，目前鮮見報道。據(jù)此，本研究以SD雄鼠為模型，對比研究免疫去勢和手術(shù)去勢對骨骼肌組織學(xué)、骨骼肌沉積調(diào)控相關(guān)激素含量及相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響，以解析兩種不同去勢技術(shù)對公畜骨骼肌沉積的差異影響機制。

1 材料和方法

1.1 GnRH疫苗制備

參照我們前期所描述的方法[13]制備GnRH 疫苗。即通過化學(xué)合成法合成GnRH 十肽的串聯(lián)體，為方便與載體蛋白偶聯(lián)，合成過程中將GnRH 分子中第6 位甘氨酸（Gly）替換為D 型賴氨酸（D-Lys）。多肽合成后與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)，偶聯(lián)物經(jīng)高效液相色譜純化后與Specol 佐劑乳化，即為GnRH疫苗。

1.2 動物分組及處理

將36 只6 周齡體重相近的SD 雄鼠隨機分為3組:對照組（entire males, EM）、手術(shù)去勢組（orchectomy, ORC）和GnRH免疫組（immunocastration, IM），每組12 只。其中，對照組不做任何處理，手術(shù)去勢組雄鼠在6周齡時進行手術(shù)去勢。免疫去勢組雄鼠在8周齡時于前腿部肌肉注射0.5 mL 100 μg GnRH肽當(dāng)量去勢疫苗，4 周后以同樣的免疫方式和劑量進行加免，對照組和手術(shù)去勢組雄鼠注射不含GnRH抗原的疫苗乳化劑。試驗期間所有雄鼠自由采食和飲水，加免后8周（即20周齡）將所有動物麻醉處死后取樣。

1.3 樣品采集

20 周齡時，雄鼠過夜饑餓8 h 后稱重并在麻醉處死前通過摘眼球法采血。所有血樣于4 ℃，2 000 g 離心15 min 后分離血清，血清保存于-20 ℃冰箱，用以測定血清激素及尿素氮含量。雄鼠處死后，迅速分離下肢腓腸肌、睪丸、附睪及腎上腺并稱重，計算腓腸肌/體重的比值。部分腓腸肌和睪丸浸泡于4%的多聚甲醛，用于組織學(xué)分析，其余組織液氮速凍后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存待用。

1.4 血清激素及尿素氮含量測定

利用酶聯(lián)免疫法（ELISA）技術(shù)測定雄鼠血清中睪酮（T）、胰島素樣生長因子1（IGF1）和皮質(zhì)酮（CORT）濃度。測定方法嚴(yán)格參照試劑盒（Cusabio Biotech Co. Ltd）的操作說明書進行，每個樣品重復(fù)測定2次。睪酮、IGF1及皮質(zhì)酮測定靈敏度分別為0.06 ng/mL，0.151 ng/mL 及0.1 ng/mL。所測定激素批內(nèi)及批間變異系數(shù)均＜12%。

雄鼠血清尿素氮含量的測定參照我們以前所描述的方法[11]進行。

1.5 腓腸肌及睪丸組織學(xué)分析

將經(jīng)4%多聚甲醛固定的腓腸肌和睪丸通過石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（H&E）染色后，進行光學(xué)顯微鏡觀察組織學(xué)變化。采用Image J (v. 1.8)顯微圖像分析軟件測定每個樣品中100根肌纖維的截面積，算術(shù)平均后得到肌纖維的平均截面積。

1.6 基因檢測

用液氮將腓腸肌和腎上腺組織研磨至粉狀，取約100 mg 組織粉末通過苯酚-氯仿法提取組織總RNA。參照試劑盒（Invitrogen Co. Carlsbad, CA,USA）說明書進行RNA提取。凝膠電泳檢測RNA的完整性，然后用Nanodrop 2000 測定總RNA 濃度及純度。取1 μg RNA用于反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄試劑采用試劑 盒PrimeScript?RT reagent kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa, Dalian, China）。以cDNA 為模板，設(shè)計基因特異性引物（表1），利用熒光定量PCR方法檢測目的基因的表達(dá)，每個樣品重復(fù)3 次。PCR 反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性10 s, 59～61 ℃退火，延伸25 s，反應(yīng)結(jié)束后用熔解檢測PCR 擴增產(chǎn)物的特異性。以β-actin為內(nèi)參基因，目的基因mRNA 表達(dá)經(jīng)內(nèi)參基因正后，采用2-△△ct法計算其相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計分析

利用Graphpad Prism 9.2 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用AVOVA單因素方差分析對指標(biāo)進行組間差異檢驗，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 雄鼠GnRH免疫去勢效果

如圖1所示，與對照雄鼠（EM）相比，雄鼠GnRH主動免疫后睪丸（圖1A）、附睪（圖1B）重量及血清睪酮濃度（圖1C）顯著降低（P＜0.001）。睪丸組織切片顯示，對照雄鼠睪丸結(jié)構(gòu)完整，曲精細(xì)管包括各級生精細(xì)胞和成熟精子（圖1D方框所示），而GnRH免疫雄鼠睪丸曲精細(xì)管管腔空蕩，精子發(fā)生完全被阻斷，管腔中無精子細(xì)胞和成熟精子，表明GnRH主動免疫達(dá)到了良好的免疫去勢效果。

圖1 GnRH主動免疫對雄鼠睪丸、附睪重量、血清睪酮濃度及睪丸組織學(xué)的影響Figure 1 Effects of active immunization against GnRH on testes and epididymides weight, serum testosterone levels and testes morphology in male rats

2.2 GnRH 主動免疫與手術(shù)去勢對雄鼠骨骼肌萎縮的影響

如圖2 所示，與對照組（EM）相比，雄鼠手術(shù)去勢與GnRH 主動免疫后腓腸肌重量均降低（圖2A；P＜0.01），但GnRH免疫組雄鼠腓腸肌重量仍高于手術(shù)去勢組雄鼠（P=0.09）。當(dāng)使用體重矯正腓腸肌重量后（即腓腸肌指數(shù)）發(fā)現(xiàn)，與對照組相比雄鼠手術(shù)去勢后腓腸肌指數(shù)降低（圖2B；P＜0.01），而GnRH主動免疫后雄鼠腓腸肌指數(shù)僅顯示出下降的趨勢（圖2B；P=0.09），但腓腸肌指數(shù)在手術(shù)去勢組雄鼠與GnRH免疫組雄鼠間無顯著差異（P＞0.05）。切片分析顯示，雖手術(shù)去勢和免疫去勢對雄鼠腓腸肌肌纖維面積無顯著影響（圖2C 和D；P＞0.05），但兩種去勢處理后雄鼠部分腓腸肌肌纖維均出現(xiàn)了降解萎縮的跡象（圖2D 箭頭所示），且手術(shù)去勢雄鼠腓腸肌降解萎縮肌纖維數(shù)量明顯多于GnRH免疫雄鼠（圖2D）。

圖2 GnRH主動免疫與手術(shù)去勢對雄鼠腓腸肌重量、指數(shù)及組織學(xué)的影響Figure 2 Effects of active GnRH immunization versus surgical castration on the mass, ratio and histology of gastrocnemius muscle in male rats

2.3 GnRH 主動免疫與手術(shù)去勢對雄鼠肝臟重量及血清IGF1濃度的影響

如圖3 所示，與對照組（EM）相比，雄鼠GnRH主動免疫與手術(shù)去勢后肝臟重量及指數(shù)均降低（圖3A 和B；P＜0.05），且GnRH 免疫組雄鼠與手術(shù)去勢雄鼠間肝臟重量及指數(shù)均無顯著差異（P＞0.05）。與對照組（EM）相比，手術(shù)去勢降低雄鼠血清IGF1濃度（圖3C；P＜0.001），而GnRH 免疫僅有降低雄鼠血清IGF1 濃度的趨勢（P=0.063）。雄鼠處死時，GnRH 免疫組大鼠血清IGF1 濃度仍顯著高于手術(shù)去勢組大鼠（P＜0.05）。

圖3 GnRH主動免疫與手術(shù)去勢對大鼠肝臟重量、指數(shù)及血清IGF1濃度的影響Figure 3 Effects of active GnRH immunization versus surgical castration on the liver mass and ratio, and serum IGF1 concentrations in male rats

2.4 GnRH 主動免疫與手術(shù)去勢對雄鼠腎上腺重量及皮質(zhì)酮分泌的影響

如圖4所示，與對照組（EM）相比，GnRH主動免疫與手術(shù)去勢對雄鼠腎上腺重量及指數(shù)均無顯著影響（圖4A 和B，P＞0.05）。與對照組相比，手術(shù)去勢對雄鼠血清皮質(zhì)酮濃度無顯著影響（圖4C，P＞0.05），而GnRH主動免疫卻顯著降低雄鼠血清皮質(zhì)酮濃度（P＜0.05）。qPCR 檢測腎上腺皮質(zhì)酮合成關(guān)鍵酶基因mRNA 表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GnRH 主動免疫顯著下調(diào)腎上腺HSD3β1（圖4D，P＜0.05），而對腎上腺Star和Cyp11a1mRNA 表達(dá)無顯著影響（P＞0.05）。而與對照組相比，手術(shù)去勢對大鼠腎上腺上述皮質(zhì)酮合成關(guān)鍵基因mRNA 表達(dá)均無顯著影響（圖4D，P＞0.05）。

圖4 GnRH主動免疫與手術(shù)去勢對大鼠腎上腺重量、指數(shù)及皮質(zhì)酮合成的影響Figure 4 Effects of active GnRH immunization versus surgical castration on the adrenal mass and ratio, as well as corticosterone biosynthesis in male rats

2.5 GnRH 主動免疫與手術(shù)去勢對雄鼠血清尿素氮及腓腸肌沉積相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖5所示，與對照組（EM）相比，GnRH主動免疫與手術(shù)去勢均顯著增加血清尿素氮濃度（圖5A，P＜0.001），但GnRH 免疫組雄鼠血清尿素氮濃度顯著低于手術(shù)去勢組雄鼠（P＜0.001）。qPCR 分析顯示，與對照組（EM）相比，手術(shù)去勢下調(diào)腓腸肌Igf1rmRNA 表達(dá)水平（圖5B，P＜0.05），而上調(diào)MstnmRNA 表達(dá)水平（P＜0.05），對Ar及Igf1mRNA 表達(dá)無顯著影響（P＞0.05）。而，與對照組相比，GnRH主動免疫對大鼠腓腸肌所檢測肌肉沉積相關(guān)基因mRNA表達(dá)均無顯著影響（P＞0.05）。

圖5 GnRH主動免疫與手術(shù)去勢對大鼠血清尿素氮及腓腸肌沉積調(diào)控相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Figure 5 Effects of active GnRH immunization versus surgical castration on serum urea nitrogen levels and mRNA expressions of gastrocnemius accumulation-associated key genes in male rats

3 討論

骨骼肌約占家畜胴體重的30%～60%，是產(chǎn)肉家畜飼養(yǎng)的主要生產(chǎn)目標(biāo)。骨骼肌沉積受多種因素影響，其中睪酮和胰島素樣生長因子1（IGF1）是促進公畜骨骼肌生長沉積的主要調(diào)控激素[3,9]。去勢引起公畜血清睪酮及IGF1濃度顯著降低，顯著降低公畜胴體骨骼肌含量[8,14-15]。與前人研究結(jié)果一致，本研究中雄鼠手術(shù)去勢后血清睪酮和IGF1 濃度均顯著降低，腓腸肌質(zhì)量和指數(shù)均顯著降低，表明去勢顯著降低了雄鼠骨骼肌沉積量。與手術(shù)去勢一致，GnRH主動免疫也降低雄鼠血清睪酮和IGF1濃度，但GnRH免疫雄鼠血清IGF1濃度仍顯著高于手術(shù)去勢雄鼠。我們前期在豬及大鼠上也得到類似的結(jié)果[11-12]。因此，雄鼠GnRH 主動免疫后腓腸肌質(zhì)量仍高于手術(shù)去勢雄鼠，這可能與其體內(nèi)相對較高的IGF1濃度有關(guān)。

畜體骨骼肌含量多少是其合成與分解動態(tài)平衡的結(jié)果[16]。腎上腺分泌的糖皮質(zhì)激素是促進機體肌肉蛋白分解，致使骨骼肌萎縮減少的重要調(diào)控激素[3,17]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)手術(shù)去勢和GnRH主動免疫對雄鼠腎上腺重量和指數(shù)均無顯著影響，但GnRH 主動免疫選擇性降低了雄鼠血清皮脂酮濃度。前人研究結(jié)果也顯示，去勢對公畜例如公豬血清糖皮質(zhì)激素濃度無顯著影響[18]。qPCR分析顯示，GnRH主動免疫主要通過下調(diào)腎上腺皮質(zhì)酮合成關(guān)鍵基因HSD3β1的表達(dá)，進而降低皮質(zhì)酮合成。GnRH 主動免疫如何選擇性降低腎上腺HSD3β1mRNA表達(dá)，進而降低血清糖皮質(zhì)激素濃度，目前不清楚，有待深入研究。血清糖皮質(zhì)激素濃度降低意味著由其驅(qū)動的肌肉蛋白分解減緩。因此，雄鼠GnRH主動免疫后其骨骼分解萎縮程度較手術(shù)去勢后低，這還可能與其體內(nèi)相對較低的皮脂酮濃度有關(guān)。

血清尿素氮水平是反映動物機體蛋白分解流失的重要指示指標(biāo)[19-20]。本研究中，雄鼠GnRH 主動免疫與手術(shù)去勢后血清尿素氮濃度均顯著升高，這與兩種去勢處理后雄鼠骨骼肌沉積量相較于對照雄鼠均降低的結(jié)果一致，表明雄激素濃度降低或缺乏所引起的肌肉蛋白分解是兩種去勢處理導(dǎo)致雄性動物骨骼肌沉積量減少的共同原因。但值得注意的是，雄鼠GnRH 主動免疫后血清尿素氮濃度仍顯著低于手術(shù)去勢雄鼠，表明免疫去勢雄鼠骨骼肌分解程度或速度較低是其骨骼肌沉積量較手術(shù)去勢雄鼠多的重要原因。同時，qPCR 分析也證實手術(shù)去勢雄鼠腓腸肌肌肉分解關(guān)鍵基因Mstn表達(dá)水平顯著高于對照組和GnRH免疫組雄鼠。

對比研究兩種不同去勢處理對雄鼠腓腸肌沉積關(guān)鍵調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)手術(shù)去勢除選擇性上調(diào)腓腸肌Mstn表達(dá)外，還選擇性下調(diào)腓腸肌胰島素樣生長因子1受體（Igf1r）基因表達(dá)。這表明Igf1r表達(dá)的下調(diào)也可能是介導(dǎo)手術(shù)去勢降低動物機體骨骼肌含量的重要原因。除上述兩個基因外，兩種去勢處理均不影響腓腸肌雄激素受體（Ar）及Igf1基因表達(dá)。除肝臟分泌的IGF1外，肌肉組織自身產(chǎn)生IGF1 通過自分泌和旁分泌途徑在促進骨骼肌生長沉積調(diào)控中也發(fā)揮重要作用[3]。因此，兩種去勢處理可能均不會通過影響骨骼肌自身IGF1的合成來調(diào)控自身的生長萎縮。同時，兩種去勢處理降低血液睪酮含量后，也不會通過影響骨骼肌Ar的表達(dá)來進一步加劇骨骼肌萎縮。

4 結(jié)論

綜上所述，相較于GnRH主動免疫（免疫去勢），手術(shù)去勢引起雄鼠更為顯著的骨骼肌分解萎縮，這與其體內(nèi)相對較低的IGF1 和相對較高的糖皮質(zhì)激素含量有關(guān)。因此，GnRH 主動免疫相較于手術(shù)去勢更適合用于家畜的去勢管理和更有利于公畜的骨骼肌沉積。