李 丹，姜雨汝，張志鵬，杜 偉，許恒勇，張 姚，朱 慶，王 彥

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽生物組學(xué)重點實驗室，成都 611130）

抗生素被認為是醫(yī)學(xué)上不可或缺的藥物之一[1]，然而在現(xiàn)代畜牧生產(chǎn)中，抗生素的使用甚至濫用使得耐藥細菌的數(shù)量不斷增加，其所帶來的負面效益日益突出。為此，越來越多的國家和地區(qū)開始禁止將抗生素作為畜禽生長的促進劑[2]，這就使益生菌、微生物制劑等綠色健康的抗生素替代物成為了養(yǎng)殖業(yè)的研究熱點。

益生菌是一類有利于人、動物和植物生長的微生物的總稱，包括細菌和真菌。當(dāng)給予宿主足夠數(shù)量的益生菌時，它能給宿主帶來多種健康益處[3-4]。大量研究表明，益生菌作為飼料添加劑，對促進動物生長及改善養(yǎng)殖環(huán)境具有重要作用[5-9]。同時，它還可以改善動物腸道健康，增加腸道菌群的穩(wěn)定性，抑制病原體的定植，從而降低發(fā)病率[10-13]。近年來，在家禽上，越來越多的研究也表明益生菌能提高家禽的生長性能，改善胃腸道的健康，增強其對致病菌的免疫反應(yīng)等[14-15]。如A. Rehman 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在羅斯肉雞中添加益生菌和益生元可以提高肉仔雞的生長性能，同時還能提高傳染性法氏囊病的抗體效應(yīng)。Chen C.等[17]則發(fā)現(xiàn)飼糧中混合益生菌的添加能有效降低雞白痢的死亡率，可調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，防止雞感染后發(fā)生白痢。此外，Yan F.等[18]報道稱飼糧中益生菌的添加不僅改變了產(chǎn)蛋雞盲腸微生物群組成，同時還降低了產(chǎn)蛋雞無殼產(chǎn)蛋率，提高了骨礦化水平。

綜上可以看出，目前關(guān)于家禽生產(chǎn)中益生菌的研究主要集中在腸道菌群、生長性能和免疫性能等方面，鮮少有對公雞繁殖性能的研究。隨著現(xiàn)代蛋雞養(yǎng)殖的發(fā)展，種公雞高品質(zhì)的精液品質(zhì)是保證種蛋受精率的重要前提基礎(chǔ)，也是直接影響母雞繁殖性能的關(guān)鍵因素。因此，種公雞繁殖性能的優(yōu)良就顯得格外重要?；诖耍驹囼炓跃G殼蛋雞種公雞為研究對象，探究日糧中添加益生菌對綠殼蛋雞種公雞精液品質(zhì)、血液指標和抗氧化性能的影響，以期客觀評估其在綠殼蛋雞種公雞生產(chǎn)中的應(yīng)用效果，從而為提高種公雞的繁殖性能提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗動物及分組處理

本試驗采用單因子試驗設(shè)計，選取四川農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽育種場中體重相近且健康的綠殼蛋雞種公雞90只，隨機分為2組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)15只雞。對照組飼喂正常基礎(chǔ)飼料和飲水；試驗組除正常飲水外，則在基礎(chǔ)飼糧中按1 g/kg 直接添加復(fù)合益生菌[復(fù)合益生菌購于山東蘇柯漢生物工程股份有限公司，以芽孢桿菌（≥1×109CFU/g）、乳酸菌（≥2×107CFU/g）和酵母菌（≥1×107CFU/g）為主]。種公雞30 日齡時，試驗組的日糧中就開始添加益生菌，直至34周齡。飼養(yǎng)期間的基礎(chǔ)日糧主要為玉米-豆粕（營養(yǎng)水平詳見表1）。所有種公雞采用3層梯式籠養(yǎng)方式，每籠飼養(yǎng)1只雞。在試驗期間，種公雞自由飲水，自由采食。舍內(nèi)溫度、濕度、光照以及免疫程序均依照四川農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽育種場《綠殼蛋雞種公雞的管理手冊》進行。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis)

1.2 睪丸樣品采集與制備

在飼養(yǎng)的第34周，隨機從試驗組和對照組中各選取3 只種公雞進行禁食、禁水處理，12 h 后，稱量試驗組和對照組中種公雞的體重，頸部放血處死，隨后采集公雞兩側(cè)睪丸。將左側(cè)睪丸用PBS 清洗后，放入4%多聚甲醛中固定（每48 h 換一次固定液），用于后續(xù)切片制作，而右側(cè)睪丸則被放入液氮中凍存，用于后續(xù)RNA的提取和定量檢測。

1.3 組織樣品的制備與觀察

將前期固定好的睪丸組織用清水沖洗后，采用常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋和蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色的方法，將切片制備成5 μm厚度，放置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 精液品質(zhì)測定

在第34 周時，采用背腹部按摩法采集精液（每個重復(fù)隨機選取8 只雞），將采集好的精液置于37 ℃水浴鍋中保溫，隨后立刻按世界衛(wèi)生組織（WHO）提供的精液質(zhì)量測定方法[19]進行精液品質(zhì)的檢測。

1.5 血液指標測定

在240 日齡時，分別對每組雞用翅靜脈采血法采集血液2 mL，置于無抗凝劑的抗凝管中，隨后2 000 r/min、4 ℃離心20 min，離心后吸取500 μL 血清置于新的EP管中備用。參照ELISA試劑盒（江蘇寶萊酶免生物科技有限公司）的使用說明，利用Varioskan LUX 酶標儀測定種公雞血清中的激素和抗氧化指標，包括睪酮（T）、雌二醇（E2）、促卵泡素（FSH）、促黃體激素（LH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（T-SOD）和總抗氧化能力（T-AOC）。

1.6 睪丸組織中抗氧化和凋亡相關(guān)基因表達水平的測定

1.6.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank 公布的雞Caspase-3、Caspase-9、Bax、CyclinD1等基因序列信息，利用Primer 6.0軟件設(shè)計特異引物（序列信息見表2）。試驗以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參基因，所有引物均委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，為凍干品，使用時溶解于RNase Free ddH2O，稀釋后引物濃度為50 pmol/μL，分裝保存于-20 ℃冰箱備用。

1.6.2 熒光定量PCR

將40 mg 睪丸組織放于液氮中進行研磨，待其成為粉狀后采用RNAiso plus 試劑提取睪丸組織中的總RNA。為除去RNA 中的DNA，采用Prime-ScriptTMRT reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒按其操作說明在含有2 μL 5× gDNA EraserBuffer，1 μL gDNA Eraser，6 μL RNase-Free ddH2O和1 μL RNA的體系中 通 過T100TMThermal Cycler PCR 儀，按42 ℃2 min、12 ℃保存的程序進行。接著，在含有1 μL PrimerScriptRTEnzyme Mix I，1 μL RT Primer Mix，4 μL 5× Primer Buffer 2（for Real time）和4 μL RNase-Free ddH2O 的反應(yīng)體系中，通過37 ℃ 15 min、85 ℃5 s 的反應(yīng)程序進行RNA 反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在含有1 μL 引物（10 μmol/L），1 μL cDNA，5 μL SYBR Green PCR Master Mix 和3 μL dd H2O 的反應(yīng)體系中檢測睪丸組織中各基因的表達情況。反應(yīng)在CFX96TMReal-time PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）上進行，其反應(yīng)條件為：98 ℃ 2 min；98 ℃ 2 s，X℃15 s（具體退火溫度見表2），72 ℃ 10 s，共39 個循環(huán)。所有樣品均進行3個技術(shù)重復(fù)。

表2 RT-PCR引物序列Table 2 Primer sequences for RT-PCR

1.7 數(shù)據(jù)分析

實時熒光定量結(jié)果利用CFX Manager系統(tǒng)進行查看，并利用2-△△Ct的方法計算基因的相對表達情況；所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，通過Duncan 法進行多重比較；利用Graphpad Prism 8 軟件進行圖表繪制。當(dāng)P＜0.05 或P＜0.01時，則表示差異顯著或極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 種公雞精液品質(zhì)的比較

對試驗組和對照組綠殼蛋雞種公雞的精液品質(zhì)進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加益生菌后種公雞精子活力提高了5.6%，精子活率提高了9.5%，但兩組間差異不顯著（P＞0.05）。同時，益生菌降低了種公雞精子畸形率（21.4%）、精液量（8%）以及pH 值（1.5%），但差異不顯著（P＞0.05）（表3）。

表3 公雞精液品質(zhì)測定Table 3 Determination of semen quality in cocks

2.2 種公雞睪丸組織結(jié)構(gòu)的變化

為確定益生菌對種公雞睪丸組織的影響，我們對其進行了HE 染色。HE 結(jié)果表明益生菌添加前后種公雞睪丸組織的被膜都是完整的，且實質(zhì)內(nèi)生精小管管腔大小不一，呈圓形或卵圓形，管壁由基膜和復(fù)層上皮組成；薄層基膜緊貼上皮，上皮較厚，可見精原細胞、精母細胞和精子細胞、精子和支持細胞等，各類細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)較為正常（圖1A 和圖1C）。對比圖1B 和圖1D 發(fā)現(xiàn)，試驗組中種公雞生精小管內(nèi)精子比對照組略多，且生精小管之間間質(zhì)組織內(nèi)可見血管；未見其他明顯病理變化。

圖1 睪丸組織HE染色結(jié)果（200×）Figure 1 HE staining results of testicular tissue （200×）

2.3 種公雞血清生殖激素含量

如表4所示，與對照組相比，飼料中添加益生菌后，種公雞血清中睪酮（T）和雌二醇（E2）的含量都極顯著增加，分別提高了18.4%和13.7%（P＜0.01），而促卵泡素（FSH）卻略有降低，但兩組間差異不顯著（P＞0.05）。同時，試驗組種公雞的促黃體激素（LH）含量比對照組提高了3.29%，但差異不顯著（P＞0.05）。

表4 種公雞血清中生殖激素的含量Table 4 Content of reproductive hormones in serum of male breeders

2.4 種公雞血清抗氧化酶活性比較

由表5可知，添加益生菌后，種公雞血清中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（TSOD）活性都極顯著高于對照組（P＜0.01），分別高了14.6%和16.7%。此外，益生菌的添加顯著提高了種公雞血清中總抗氧化能力（T-AOC），這比對照組提高了30.2% (P＜0.05)。

表5 種公雞血清中抗氧化酶活性測定結(jié)果Table 5 Determination of antioxidant enzyme activity in serum of male breeders

2.5 種公雞睪丸組織中凋亡、增殖和抗氧化基因的表達水平

為了進一步探究益生菌的添加對睪丸發(fā)育的影響，我們通過RT-qPCR法檢測了對照組和益生菌組種公雞睪丸組織中凋亡基因和抗氧化基因的表達情況。由圖2可知，與對照組相比，雖然益生菌組種公雞睪丸組織內(nèi)的促凋亡基因Caspase-3和Caspase-9的表達量均下降，且Bax的表達量增加，但兩組間的差異都不顯著（P＞0.05）。相反，添加益生菌后公雞睪丸組織中細胞增殖和周期相關(guān)基因CDK2的表達量極顯著提高（P＜0.001），且PCNA和CyclinD1的表達量也均有增加，但兩組間差異不顯著（P＞0.05）。此外，我們又檢測了種公雞睪丸中抗氧化基因的表達情況。由圖3可知，添加益生菌后，種公雞睪丸組織中抗氧化基因GPX2、GPX3、GPX4、GPX7、GST和GSR的表達量均顯著或極顯著高于對照組（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），GPX1和SOD的表達量也均有增加，但兩組間差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 種公雞睪丸組織中凋亡基因的表達情況Figure 2 Expression of apoptotic genes in testes of male breeders

圖3 種公雞睪丸組織中抗氧化基因的表達情況Figure 3 Expression of antioxidant genes in testes of male breeders

3 討論

3.1 益生菌對綠殼蛋雞種公雞精液品質(zhì)和生殖激素的影響

影響種公雞精液品質(zhì)的因素眾多，主要包括種公雞老齡化、飼料中營養(yǎng)缺乏和飼養(yǎng)管理中的應(yīng)激因素等[20]，而種公雞的精液質(zhì)量又會直接影響種蛋的受精率、孵化率等生產(chǎn)指標[21]。因此，提高種公雞精子質(zhì)量是提高生產(chǎn)指標的關(guān)鍵。

前期，有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)益生菌的添加可以提高家禽精子量、產(chǎn)蛋量、蛋品質(zhì)和孵化率，推測其原因，可能是益生菌使家禽體內(nèi)產(chǎn)生了大量具有抗氧化和DNA 保護特性的裂解酶及代謝產(chǎn)物[22]。與此同時，G. Passini 等[23]研究也發(fā)現(xiàn)，精子的發(fā)生及精液品質(zhì)與類固醇激素水平是密切相關(guān)的。本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加益生菌可提高綠殼蛋雞種公雞的精液品質(zhì)。同時，試驗組種公雞血清中的T、E2和LH含量均有提高，而FSH略有下降，推測其原因可能與益生菌的添加濃度有關(guān)，但具體的原因還有待進一步研究。

睪丸是公雞提供精子的主要場所，良好的睪丸條件對生殖能力至關(guān)重要[24]。有研究表明，35周齡前公雞睪丸發(fā)育良好，睪丸內(nèi)有良好的血管分布，而35周齡后，睪丸發(fā)育程度就會顯著下降[25]。本試驗采集240日齡（34.3周齡）種公雞睪丸，從HE染色可以發(fā)現(xiàn)，睪丸內(nèi)各類細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)較為正常，生精小管之間間質(zhì)組織內(nèi)有明顯的血管分布，生精小管內(nèi)精子分布較密集，且試驗組高于對照組。由此可見，在種公雞飼糧中添加益生菌可以改善睪丸發(fā)育情況。

3.2 益生菌對綠殼蛋雞種公雞生精細胞凋亡的影響

有研究發(fā)現(xiàn)[26]，精子發(fā)生過程中生精細胞會出現(xiàn)自發(fā)性和誘導(dǎo)性的凋亡，最終生成精子量的多少與生精細胞凋亡程度直接相關(guān)。本試驗通過熒光定量PCR 測定了公雞睪丸組織生精細胞的凋亡基因、增殖和周期相關(guān)基因的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，促凋亡基因Caspase-3和Caspase-9在試驗組種公雞睪丸組織中的表達量均降低，而細胞增殖和周期相關(guān)基因CDK2、CyclinD1和PCNA的表達量均增加。這一結(jié)果充分說明益生菌可以通過降低種公雞睪丸組織中生精細胞的凋亡，促進其增殖進而來提高公雞的精子量。

3.3 益生菌對綠殼蛋雞種公雞抗氧化能力的影響

當(dāng)生物體受應(yīng)激、外界污染和放射等影響時，機體內(nèi)會產(chǎn)生大量自由基，進而損傷蛋白質(zhì)或核酸等大分子物質(zhì)，從而損害機體健康。為了保護機體免受損傷，機體中T-AOC、GSH-Px 和T-SOD 等抗氧化酶會自發(fā)消除過氧化氫、超氧自由基等活性氧來終止自由基鏈式反應(yīng)，進而增強機體的抗氧化能力[27]。因此，提高雄性動物的抗氧化性能，保護其睪丸結(jié)構(gòu)和功能對改善后期種公雞的精液品質(zhì)十分重要。例如，2018 年，齊曉龍等[28]研究發(fā)現(xiàn)在日糧中添加2%的亞麻油可顯著增強種公雞機體抗氧化防疫能力。2019年，他們又發(fā)現(xiàn)日糧中添加硒可顯著提高種公雞血漿抗氧化酶活性和精子活力[29]。同樣，飼料中添加左旋肉堿（LC）可顯著增加公雞的精子活力、存活率、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性[30]。近年來，關(guān)于益生菌對雞繁殖性能的研究更多是在母雞上，如飼糧中益生菌（地衣芽孢桿菌）的添加可調(diào)節(jié)蛋雞生殖激素分泌，從而提高蛋雞產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)[31]。而關(guān)于益生菌對種公雞抗氧化性影響的研究還較少，在Inatomi 和Otomaru 的研究中，他們發(fā)現(xiàn)日糧中添加含有芽孢桿菌的益生菌后，公雞睪丸中GSH-Px的表達量很高，進而改善了公雞的氧化活性和精液質(zhì)量[32]。和他們結(jié)果相同，我們也發(fā)現(xiàn)添加了益生菌后的公雞血液中GSH-Px、T-SOD 和T-AOC 含量分別極顯著或顯著高于對照組，而且和對照組相比，益生菌組睪丸組織中抗氧化基因GPX2、GPX3、GPX4、GPX7、GST和GSR的表達量也顯著或極顯著增高，這進一步表明益生菌可以提高種公雞的抗氧化能力。

4 結(jié)論

飼糧中益生菌的添加，可顯著提高綠殼蛋雞種公雞血清中抗氧化酶活性，提高睪丸組織中抗氧化基因的表達，減少睪丸組織中生精細胞的凋亡，促進增殖，進而提高了種公雞的精液品質(zhì)，對提高種公雞的繁殖能力有一定的改善作用。