李孝君，隋志遠，王晨光，張永杰，張志帥，邢 鳳*

（1. 塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2. 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

初情期是雌性動物初次發(fā)情并發(fā)生排卵獲得生殖能力的時期，這一時期始于下丘腦內(nèi)GnRH 神經(jīng)元分泌促性腺激素釋放激素(GnRH)，這是由表達高水平跨膜催乳素受體的Kisspeptin 神經(jīng)元調(diào)節(jié)的。初情期的發(fā)生受生殖激素的調(diào)控，催乳素對黃體生成素和卵泡刺激素具有協(xié)調(diào)作用[1]。哺乳期間發(fā)現(xiàn)的血清PRL 水平升高，或由慢性催乳素（PRL）輸注引起，會降低促性腺激素和Kisspeptin 的分泌，并影響動物的發(fā)情周期及排卵，而在試驗中發(fā)現(xiàn)PRL有助于初情期的啟動從而獲得生殖能力[2]。

PRL跟其受體（PRLR）作用于靶細胞，調(diào)節(jié)繁殖相關(guān)生殖激素的合成和分泌，PRLR基因的表達[3],研究發(fā)現(xiàn)PRL結(jié)合其PRLR能產(chǎn)生不同的生理作用[4]。該基因變異對初情期年齡會產(chǎn)生影響[5]。PRLR 基因首先在大鼠上被發(fā)現(xiàn)的，隨后在小鼠上也被發(fā)現(xiàn)，學者們對其他動物的PRLR基因進行了克隆，如在猴、牛、羊、馬、兔，雞、鵝、羊駝、魚和豬等動物也發(fā)現(xiàn)了PRLR基因。

目前PRLR基因在綿羊、山羊、鴿子、烏龜、雞、鴨、羊駝、小鼠和大鼠等動物的下丘腦、垂體、子宮、卵巢、輸卵管和胎兒的一些細胞中均有表達，且不同時期的組織中的表達量存在差異[6-9]。多浪羊是新疆南疆的優(yōu)良綿羊品種，具有發(fā)情早，生長速度快等優(yōu)點。但國內(nèi)并沒有PRLR基因?qū)d羊初情期的影響的報道。因此，本試驗為多浪羊垂體中PRLR基因克隆測序后，進行生物信息學分析和熒光定量PCR（qPCR）的方法，對多浪羊的PRLR 基因的CDS 序列分析以及測定初情期前后3 個時期垂體、下丘腦、卵巢、子宮和輸卵管各組織中的PRLR基因的表達差異，為研究PRLR基因功能和進一步說明PRLR基因在綿羊初情期的啟動過程產(chǎn)生的影響提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料的采集

試驗動物是從南疆麥蓋提多浪羊種羊繁殖羊場購買，同一飼養(yǎng)條件下的小母羊（2 月齡）15 只飼養(yǎng)于塔里木大學實驗站，觀察其發(fā)情特征，初情期前（90日齡），初情期（初次發(fā)情后的4～6 d），初情期后（發(fā)情10 d后)在無菌條件下用專門處理過的手術(shù)器械快速采集以上羊的下丘腦、垂體、子宮、卵巢和輸卵管整個組織，其中同一年齡階段的5 個組織樣本視為生物學重復，采集的組織用酒精消毒剪成1 cm3大小的組織放入凍存管內(nèi)，儲存在液氮中，帶回放入-80 ℃的冷凍室備用。

1.2 試驗試劑

Trizol 購自Invitrogen；qPCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和DH5α感受態(tài)細胞從北京全式金生物技術(shù)有限公司進行購買；膠回收試劑盒和DNA Marker2000均在北京天根生化科技有限公司購買；藍白斑試劑從北京索萊寶科技有限公司購買；PMD19-T購自大連寶生物工程有限公司。

1.3 提取RNA與cDNA合成

使用 Trizol 法提取多浪羊各組織中的RNA，檢測其濃度后計算后在同一濃度下（1 000 ng/μL)使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA合成,將得到的cDNA放到-20 ℃的冷凍室備用。

1.4 引物設(shè)計及PRLR基因CDS區(qū)的克隆

從GeneBank 上找到的Ovis areas PRLR mRNA登錄號為；AF041257.1，根據(jù)Primer Premier5.0 設(shè)計PRLR基因克隆的引物見表1。PCR 反應體系為25 μL：12.5 μL 2×EasyTaq PCR SuperMix，9.5 μL ddH2O，上下引物各1 μL，1 μL cDNA。反應條件：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，1 min；重復35個循環(huán)；72 ℃，5 min；4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠檢測后，使用膠回收試劑盒回收的CDA 與PMD19-T 載體連接，將連接好的載體于DH5α 感受態(tài)細胞混合不含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基，進行搖床復蘇，條件為120 min，37 ℃，225 r/min。將含有大腸桿菌液接種在含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，放置30 min，培養(yǎng)皿倒置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜。挑出陽性重組子后進行PCR擴增，將合格菌液送至上海生工生物工程有限公司進行測序。利用測序獲得的序列設(shè)計qPCR引物，以β-actin為內(nèi)參基因。上海生工生物工程公司合成引物。

表1 引物設(shè)計以及產(chǎn)物長度Table 1 Primer design and product length

1.5 實時熒光定量 PCR

以多浪羊cDNA為模板，利用qPCR檢測多浪羊各組織中PRLR的表達量。反應總體系為15 μL：7.5 μL 2Transtant qPCR Mix，5.5 μL ddH2O，上下游引物各0.5 μL（10 nmol/μL），1 μL cDNA。反應條件：95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；55 ℃，15 s；68 ℃，20 s，重復反應40次。

1.6 生物信息學分析

用MEGA7.0 軟件對PRLR 蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析圖：ExPASy-PrortScale 和ExPASy-ProtParam tool 在線軟件分析PRLR 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；利用TMHMM2.0分析PRLR 蛋白跨膜區(qū)域；利用NetPhos 3.1軟件對PRLR蛋白進行磷酸化位點預測；SignalP 5.0 預測蛋白質(zhì)的信號肽；利用SOPMA 在線軟件預測蛋白二級結(jié)構(gòu)；SWISS-MODEL 軟件蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測。

1.7 統(tǒng)計分析

采用2-ΔΔct法計算得到的CT 值，使用SPSS 26.0單因方差分析差異是否顯著。P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 多浪羊PRLR基因PCR擴增結(jié)果

以多浪羊下丘腦cDNA 模板，通過RT-PCR 對多浪羊的PRLR基因進行擴增，使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后（圖1）。獲得含有目的基因的條帶，測序?qū)Y(jié)果進行了比對后發(fā)現(xiàn)，已獲得該基因序列。

圖1 多浪羊PRLR基因PCR產(chǎn)物Figure 1 PCR product of PRLR gene of Duolang sheep

2.2 PRLR 基因氨基酸序列對比相似性比較及系統(tǒng)發(fā)育樹

通過NCBI 分別獲取綿羊登錄號（Ovis aies登錄號：KAG5199221.1）、山羊（Capra hircus登錄號：NP_001272598.1）、人（Homo sapiens登 錄 號：NP_000940.1）、家 鼠（Mus musulus登 錄 號：NP_00124071）、馬（Equus asinus登 錄 號：XP_001500154.1）、豬（Sus scrofa登 錄 號：NP_001001868）、雞（Gallus gallus登 錄 號：NP_001384495.1）和馬鹿（Cervus elaphus登錄號：XP_043743252.1）的蛋白序列。由圖2 可得知，多浪羊PRLR基因氨基酸序列與綿羊、人、山羊、家鼠、豬、馬、雞和馬鹿的相似性分別為99.7%、70.7%、96.4%、43.5%、75.4%、75.5%、47.0%和49.7%。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，多浪羊與綿羊、山羊、馬鹿的親緣關(guān)系較近，與人、豬、馬和家鼠次之，與雞的親緣關(guān)系最遠（圖3）。

圖2 多浪羊PRLR蛋白質(zhì)氨基酸相似性對比分析Figure 2 Comparative analysis of amino acid similarity of PRLR protein of Duolang sheep

圖3 多浪羊PRLR蛋白氨基酸序列的進化分析樹Figure 3 Evolutionary analysis tree of PRLR amino acid sequence of Duolang sheep

2.3 PRLR蛋白理化性質(zhì)預測分析

2.3.1 多浪羊PRLR編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)分析

使用在線軟件ProtParam 分析多浪羊PRLR 蛋白物理化性質(zhì)，結(jié)果顯示：其分子質(zhì)量為65 208.33 Ku,其理論等電點為5.12；該蛋白分子式為：C2952H4538N734O883S24；ProtParam預測顯示PRLR蛋白序列中親水性氨基酸區(qū)域比疏水性的氨基酸區(qū)域多（圖4）；脂肪族指數(shù)：28.24；親水性的大平均值（GRAVY）：-0.432 為親水蛋白；不穩(wěn)定指數(shù)為49.28，為不穩(wěn)定蛋白。

圖 4 多浪羊 PRLR蛋白疏水性/親水性預測Figure 4 Hydrophobicity/hydrophilicity prediction of PRLR protein from Duolang sheep

2.4.2 PRLR蛋白磷跨膜區(qū)域預測

使用TMHMM2.0 蛋白結(jié)構(gòu)域及跨膜區(qū)域預測分析顯示PRLR蛋白2含跨膜結(jié)構(gòu)位于25到235，第259 到581。由圖5 可知，PRLR 蛋白存在2 個跨膜區(qū)域，跨膜區(qū)域起始位置與SMART 軟件預測序列一致。

圖5 多浪羊 PRLR跨膜區(qū)域預測Figure 5 PRLR transmembrane region prediction in Duolang sheep

2.3.3 PRLR蛋白磷酸化位點的預測

在線軟件NetPhos3.1 分析多浪羊PRLR 蛋白質(zhì)的磷酸化位點進行預測；結(jié)果顯示共有73個磷酸化位點見（圖6）其中11酪氨基酸、19個蘇氨基酸和41個絲氨酸。

圖6 多浪羊PRLR蛋白磷酸化位點預測圖Figure 6 PRLR Protein phosphorylation site prediction map of Duolang sheep

2.3.4 PRLR 蛋白質(zhì)信號肽的預測

在線軟件SignalP 5.0 預測多浪羊PRLR 蛋白質(zhì)的信號肽，測到該基因的蛋白信號肽（圖7）。

圖7 多浪羊PRLR跨膜信號肽的預測分析Figure 7 Predictive analysis of PRLR transmembrane signal peptide

2.3.5 多浪羊PRLR蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預測

利用SOPMA 在線軟件預測結(jié)構(gòu)可知，PRLR 蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由59.21%的無規(guī)則卷曲和21.69%的延伸鏈組成，其余結(jié)構(gòu)為15.83%的β-轉(zhuǎn)角和3.27%的α-螺旋結(jié)構(gòu)。（圖8）S WISS-MODEL 軟件對PRLR 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測驗證了PRLR 蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，GMQE為0.25, PRLR蛋白無配體結(jié)構(gòu)(圖9)。

圖8 多浪羊PRLR二級蛋白預測分析Figure 8 PRLR secondary protein prediction analysis of Duolang sheep

圖9 多浪羊PRLR蛋白三級結(jié)構(gòu)預測Figure 9 Tertiary structure prediction of PRLR protein of Duolang sheep

2.4 PRLR基因不同情期不同組織中的表達差異

通過qPCR方法對PRLR基因在多浪羊垂體、下丘腦、卵巢、子宮和輸卵管各組織5種組織中的表達進行檢測（圖10）。結(jié)果顯示：PRLR基因在多浪羊初情期前垂體的表達量較高，顯著高于其他4 個組織；初情期PRLR基因在垂體的表達量任相對較高，顯著高于下丘腦、子宮、卵巢和輸卵管；初情期后PRLR基因在垂體和下丘腦的表達量相對較高，顯著高于子宮、卵巢和輸卵管；初情期PRLR基因在垂體和輸卵管有升高的趨勢顯著高于初情期前和初情期后；初情期到初情期后PRLR基因在下丘腦持續(xù)升高的趨勢，初情期后顯著高于初情期，初情期顯著高于初情期前。初情期子宮中的PRLR基因的表達量先降低初情期后上升但差異不顯著。卵巢PRLR基因在初情期前先升高初情期后降低但差異不顯著。

圖10 不同時期不同組織多浪羊PRLR 相對分泌量Figure 10 Relative secretion of PRLR in different tissues of Duolang sheep in different periods

3 討論

雌性動物發(fā)情周期的不同階段PRLR基因的表達量發(fā)生變化，而PRLR基因的表達受生殖的激素調(diào)控。此外不同類型的PRL 受體在激素信息傳導中的產(chǎn)生的功能可能有所不同[10]。本文RT-RCR技術(shù)克隆了從多浪羊垂體提取的PRLR基因的片段共1 763 bp，其中CDS 區(qū)編碼區(qū)的序列長為1 746 bp，編碼氨基酸581 個，在其他羊上發(fā)現(xiàn)均為581 個氨基酸，在其他哺乳動物氨基酸數(shù)為小鼠589個、大鼠591 個、兔子592 個、牛和鹿557 個、人與猴598 個。通過生物學信息分析結(jié)果顯示，PRLR 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要由59.21%的無規(guī)則卷曲和21.69%的延伸鏈組成，屬于不穩(wěn)定親水蛋白，有蛋白信號肽，有2個蛋白跨膜結(jié)構(gòu)屬于跨膜蛋白[11]，PRLR蛋白屬于分泌蛋白，合成后會發(fā)生轉(zhuǎn)運。對蛋白磷酸化位點的預測發(fā)現(xiàn)了73 個蛋白磷酸化位點，其中11 個酪氨基酸(Y)位點、19個蘇氨基酸（T）位點和41個絲氨酸（S）位點。PRLR基因在動物之間有較高的保守[11]。試驗獲得的多浪羊PRLR蛋白氨基酸序列在不同物種分析同源性及構(gòu)建進化發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)多浪羊與綿羊、山羊、馬鹿親緣關(guān)系較近，與人、豬、馬、家鼠的親緣關(guān)系次之，與雞的親緣關(guān)系最遠，該結(jié)果符合動物進化的特征與其他的學者研究結(jié)果一致[12-17]。

許多研究證明PRLR基因在哺乳動物的下丘腦、垂體和性腺等組織中均有的廣泛表達，并且PRLR在幾乎所有的組織和胎兒的一些細胞中均有發(fā)現(xiàn)。成年內(nèi)蒙古絨山羊的下丘腦、垂體和卵巢均有PRLR基因的表達，卵巢是催乳素的靶器官，說明PRLR基因?qū)?nèi)蒙古絨山羊的繁殖力具有影響[18]。甘加藏羊發(fā)情周期中PRLR基因在垂體和卵巢組織中均有表達，且垂體組織中表達最高，且發(fā)情期前PRLR的表達顯著高于發(fā)情期和發(fā)情后。發(fā)情期卵巢的表達量高于發(fā)情前和發(fā)情后，PRLR基因參與了甘加藏羊發(fā)情周期的調(diào)控[19]。中國軟殼龜?shù)乃薪M織中發(fā)現(xiàn)了PRLR基因的表達，且在垂體得表達量最高，其基因在爬行動物參與的調(diào)控應該與鳥類中的是一致的[20]。浙江白東鵝在產(chǎn)蛋期和就巢期垂體的表達量顯著高于下丘腦、卵巢和輸卵管等組織[21]。黑番鴨就巢期子宮中PRLR基因的表達量高于產(chǎn)蛋期前后，卵巢中的表達量高于下丘腦，垂體中的表達量基本沒有變化[22]。PRLR基因可能參與了綿羊季節(jié)性繁殖的調(diào)控，成年的小尾寒羊黃體期的PRLR基因的表達量高于卵泡期[23]。皖西白鵝卵巢的表達顯著高于垂體和下丘腦，就巢期PRLR基因的表達量高于產(chǎn)蛋期前和產(chǎn)蛋后[24]；肉鴿嗉囊中PRLR基因在孵化期間到哺育第3 天的表達量逐漸增加，公鴿嗉囊中的PRLR的表達量高于母鴿，嗉囊中PRLR基因的表達量高于垂體、下丘腦和卵巢（睪丸）[25]。雌性條紋倉鼠春秋時期PRLR基因在下丘腦，卵巢的表達水平與LH 和FSH 血清濃度呈負相關(guān)，由此說明PRLR基因可能對季節(jié)生殖活動產(chǎn)生負反饋調(diào)節(jié)[26]。出生時垂體和卵巢中就有表達但其表達量較低在2～4 月齡時PRLR基因表達顯著高于1月齡和5月齡（性成熟），因此PRLR基因參與了前籽鵝的性成熟調(diào)控[27]。PRLR基因?qū)ξ闯墒煨∈蟮穆雅莅l(fā)育，生長及黃體生長及維持發(fā)揮著重要作用,隨小鼠周齡的增長PRLR基因在小鼠卵巢中的表達量也升高[28]。本研究PRLR基因在多浪羊垂體、卵巢和輸卵管等組織在初情期前到初情期的過程中的表達量顯著升高初情期后又降低，證明PRLR基因在多浪羊初情期的啟動過程中發(fā)揮著重要的作用。綜上所述，多浪羊PRLR基因在下丘腦、垂體、子宮和輸卵管均有表達，在垂體中高表達，初情期垂體和卵巢組織中的PRLR基因顯著性升高，而初情期時動物第一次排卵的過程，而卵巢中的PRLR基因可誘導排卵[29]。這為進一步多浪羊PRLR基因的在初情過程啟動過程中的調(diào)控基礎(chǔ)奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究獲得了多浪羊PRLR基因的CDs 區(qū)序列，其長度為1 746 bp，PRRL 蛋白在哺乳動物進化過程中具有高度的保守；多浪羊PRLR基因主要在垂體和下丘腦中表達，卵巢和子宮次之，輸卵管中表達最低，且PRLR基因在多浪羊垂體表達量顯著高于其他組織；多浪羊垂體和卵巢組織中PRLR基因在初情期前、初情期和初情期后表達量先升高再降低，揭示了PRLR基因可能參與了多浪羊初情期的啟動過程。