曾本和 龔君華 劉海平 王萬良 王金林 何林強(qiáng)

摘要：為探索拉薩裂腹魚（Schizothorax waltoni）胚胎適宜孵化水溫，提高胚胎受精率和孵化率，降低初孵仔魚畸形率，設(shè)置5℃、9℃、12℃、14℃、16℃、18℃、20℃、22℃共8個(gè)溫度梯度進(jìn)行拉薩裂腹魚魚卵孵化實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)各溫度下的胚胎發(fā)育速度、魚卵受精率和孵化率、初孵仔魚畸形率及形體指標(biāo)。結(jié)果顯示，拉薩裂腹魚胚胎卵裂期發(fā)育最快，到囊胚期、原腸期、器官分化期及出膜期，每個(gè)發(fā)育時(shí)期積累時(shí)間逐漸增長；隨溫度的升高，胚胎發(fā)育時(shí)間縮短，發(fā)育速度加快。各溫度條件下，胚胎發(fā)育時(shí)期與孵化時(shí)間均呈冪函數(shù)關(guān)系，孵化積溫隨溫度升高呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。水溫9～18℃的魚卵受精率較高，均超過90%；水溫12～16℃的孵化率較高，均超過95%；水溫9～16℃的魚苗畸形率較低，均低于4%。初孵仔魚全長與孵化溫度呈二次多項(xiàng)式函數(shù)關(guān)系；不同水溫的初孵仔魚體高沒有顯著性差異，但卵黃囊體積先升高、后降低、再升高。研究表明，適當(dāng)提高孵化水溫能縮短胚胎孵化周期，但水溫過高會(huì)影響胚胎孵化率，增加初孵仔魚畸形率，影響仔魚對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用以及器官發(fā)育分化。綜合考慮胚胎孵化周期、孵化率、初孵仔魚畸形率及形體指標(biāo)，拉薩裂腹魚胚胎適宜孵化水溫為12～16℃。

關(guān)鍵詞：拉薩裂腹魚；胚胎發(fā)育；受精率；孵化率；畸形率；水溫

中圖分類號(hào)：Q142 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：1674-3075（2023）02-0096-08

魚卵受精率和孵化率、胚胎發(fā)育各階段的存活率和發(fā)育速度及初孵仔魚畸形率是魚類胚胎發(fā)育過程的重要生物學(xué)參數(shù)，各種內(nèi)、外環(huán)境因素對(duì)這些參數(shù)均有不同程度的影響（唐麗君等，2014）。水溫、溶氧、pH、光照及遺傳變異等對(duì)魚類胚胎發(fā)育均有影響（Zacharia & Kakati，2004），其中溫度的影響尤為顯著（Hilder & Ned，2003）。研究表明，在一定的范圍內(nèi)，水溫升高能加速魚類胚胎發(fā)育進(jìn)程，縮短孵化時(shí)間（El-Gamal，2009）。但魚類胚胎對(duì)水溫變化的適應(yīng)能力有一定限度，若超出適宜水溫閾值，過高或過低的水溫都會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育畸形或者停滯甚至死亡（Jobling，1993）；此外，不同魚類的胚胎發(fā)育對(duì)水溫的敏感性也不盡相同（孫恒志和任麗珍，1992）。溫度首先是對(duì)胚胎細(xì)胞體酶系統(tǒng)產(chǎn)生影響，繼而影響魚類胚胎發(fā)育（劉艷超等，2018）。在適宜的溫度范圍內(nèi)，溫度越高，孵化酶活力越強(qiáng)，孵化周期越短；高于或低于此范圍，孵化酶活力就會(huì)受到破壞或抑制（郭永軍等，2004）；在胚胎發(fā)育過程中，水溫還可能造成胚胎變態(tài)發(fā)育（張甲等，2004），其中溫度脅迫使得魚類胚胎的成活率、孵化率和生存能力均下降，初孵仔魚畸形率上升（柳學(xué)周等，2004）。

拉薩裂腹魚（Schizothorax waltoni）俗稱拉薩弓魚，隸屬于鯉形目（Cypriniformes）、鯉科（Cyprinidae）、裂腹魚亞科（Schizothoracinae）、裂腹魚屬（Schizothorax），僅分布于我國西藏地區(qū)的雅魯藏布江中上游干、支流及附屬水體，資源量少，生長速度緩慢，性成熟年齡較遲，為我國特有種，也是西藏地區(qū)主要的經(jīng)濟(jì)魚類之一（西藏自治區(qū)水產(chǎn)局，1995）。近幾十年以來，受外來魚類入侵、水電水利工程建設(shè)、過度捕撈、水質(zhì)環(huán)境惡化等因素的影響（周賢君，2014；劉海平等，2018），2016年拉薩裂腹魚被《中國脊椎動(dòng)物紅色名錄》列為易危魚類（VU）（蔣志剛等，2016），2019年被《西藏雅魯藏布江中游裂腹魚類優(yōu)先保護(hù)等級(jí)定量評(píng)價(jià)》列為三級(jí)優(yōu)先保護(hù)魚類（李雷等，2019），2021年被列為國家二級(jí)水生野生保護(hù)動(dòng)物。因此，亟待開展拉薩裂腹魚自然資源相關(guān)保護(hù)性研究工作。

目前，有關(guān)拉薩裂腹魚的研究包括分類學(xué)與起源和演化（Qiu & Chen，2009）、分子系統(tǒng)發(fā)育與生物地理學(xué)（Guo et al，2014）、基因組（周建設(shè)等，2019）、年齡與生長（郝漢舟，2005）、食性組成（周賢君，2014）、人工馴養(yǎng)（王萬良等，2016）、人工繁殖（曾本和等，2020a）、胚胎發(fā)育（徐濱等，2020）、苗種培育（曾本和等，2020b）等，但迄今未見有關(guān)其胚胎適宜孵化水溫的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置一系列溫度梯度孵化拉薩裂腹魚胚胎，探究水溫對(duì)其孵化時(shí)間、受精率、孵化率、初孵仔魚畸形率、形體指標(biāo)的影響，明確其適宜孵化水溫，以期為拉薩裂腹魚資源保護(hù)積累生物學(xué)資料。

1 ? 材料和方法

1.1 ? 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料選取2019年4月12日在西藏自治區(qū)重要特有魚類水產(chǎn)種質(zhì)資源場(chǎng)生產(chǎn)的拉薩裂腹魚受精卵1.3萬粒，親本為雅魯藏布江日喀則段捕獲的野生群體，經(jīng)人工催產(chǎn)，在水溫（12.0±0.5）℃條件下干法授精所得。

1.2 ? 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ? 實(shí)驗(yàn)分組 ? 魚卵擠出后，在12℃的自然水溫下，待魚卵吸水膨脹后，用體積法計(jì)算魚卵總數(shù)量，并將魚卵平均分成8組，每組3個(gè)重復(fù)，分別于5℃、9℃、12℃、14℃、16℃、18℃、20℃、22℃共8個(gè)水溫條件下孵化魚卵。

將魚卵置于長×寬×高規(guī)格為21 cm × 7 cm × 4 cm孵化盤中，底部覆蓋網(wǎng)孔直徑為1.5 mm的篩網(wǎng)。孵化盤置于直徑45 cm、高度25 cm的紅色塑料盆中。14℃、16℃、18℃、20℃、22℃水溫組通過恒溫加熱棒調(diào)節(jié)，溫差±0.5℃；5℃通過冰箱調(diào)節(jié)溫度，溫差±1.0℃；9℃通過恒溫培養(yǎng)箱調(diào)節(jié)溫度，溫差±1.2℃。孵化用水為曝氣后的井水，溶氧≥8 mg/L，每天換水1次，每次換水1/3。

1.2.2 ? 日常管理 ? 每天測(cè)量水溫和溶氧4次（6：00、12：00、18：00、0：00），如水溫偏高或者偏低應(yīng)及時(shí)調(diào)節(jié)。每天剔除1次死卵并記錄。從受精卵到魚苗出膜，每隔2 h在顯微拍照系統(tǒng)下觀察各溫度組胚胎發(fā)育時(shí)期并拍照記錄。孵化結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)不同溫度組胚胎受精率、孵化率、初孵仔魚畸形率，計(jì)算不同溫度組胚胎孵化積溫，測(cè)量出孵仔魚形體數(shù)據(jù)。

1.3 ? 計(jì)算方法

胚胎受精率和孵化率、初孵仔魚畸形率以及孵化積溫、孵化速度、卵黃囊體積計(jì)算公式如下：受精率=（原腸中期活卵數(shù)/總卵數(shù)）×100%；孵化率=（孵出仔魚數(shù)/受精卵數(shù)）×100%；畸形率=（孵出仔魚畸形數(shù)/孵出仔魚數(shù)）×100%；孵化積溫=孵化平均溫度（℃）×孵化持續(xù)時(shí)間（h）；孵化速度=1/孵化時(shí)間；卵黃囊體積 = （4/3）π ×（R/2）×（r/2）2，式中：r為卵黃囊短徑，R為卵黃囊長徑（駱豫江等，2008）

1.4 ? 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)通過Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和作圖；采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中One-way ANOVA進(jìn)行單因子方差分析，若差異顯著，則采用Duncan's進(jìn)行多重比較，顯著水平為P<0.05。

2 ? 結(jié)果

2.1 ? 胚胎發(fā)育特征

拉薩裂腹魚胚胎呈棕黃色，沉性，非粘性，不含油球，卵質(zhì)均勻分布，極性不明顯。發(fā)育過程一般可分為受精卵、胚盤期、卵裂期、囊胚期、原腸期、神經(jīng)胚期、器官分化和孵化期共8個(gè)階段（表1）。初孵仔魚身體透明，淡黃色，色素未出現(xiàn)，大多數(shù)在水底靜息，在外界刺激下游動(dòng)。

2.2 ? 水溫與胚胎孵化時(shí)間

水溫對(duì)各發(fā)育時(shí)期胚胎孵化時(shí)間的影響見表1和圖1。水溫5℃時(shí)，拉薩裂腹魚受精卵發(fā)育到原腸早期便全部死亡；水溫9～22℃，受精卵均能發(fā)育到魚苗出膜。拉薩裂腹魚受精卵卵裂期發(fā)育最快，至囊胚期、原腸期、器官分化期及出膜期，每個(gè)發(fā)育時(shí)期所需時(shí)間逐漸增長。回歸分析表明，各溫度組的發(fā)育期與孵化時(shí)間均呈冥函數(shù)關(guān)系，并且擬合方程的相關(guān)系數(shù)（R2）均較大，隨著孵化水溫升高，函數(shù)系數(shù)越小，各發(fā)育時(shí)期所需時(shí)間越短（表2）。

水溫與孵化時(shí)間和速度的關(guān)系見圖2-a和圖2-b。隨著水溫升高，拉薩裂腹魚孵化時(shí)間逐漸減少，孵化速度逐漸升高。5℃組胚胎不能順利孵化出膜，9℃組胚胎孵化時(shí)間最長（557 h）；22℃組胚胎孵化時(shí)間最短（95 h），較9℃組縮短了462 h。回歸分析表明，孵化時(shí)間（H）與孵化水溫（T）呈冪函數(shù)關(guān)系：H=580.84T-0.876（R2=0.9655）；孵化速度（V）與孵化水溫（T）呈線性關(guān)系：V=0.0014T+3×10-5（R2=0.9629）。

2.3 ? 水溫與孵化積溫

水溫與孵化積溫的關(guān)系見圖2-d。隨著水溫升高，拉薩裂腹魚胚胎孵化積溫逐漸降低，9℃組孵化積溫最高（5 249 h·℃），22℃組孵化積溫最低（2 118 h·℃）?；貧w分析表明，水溫與孵化積溫呈冪函數(shù)關(guān)系：y=5 232.3x-0.439（R2=0.9135）。

2.4 ? 水溫與孵化效果

2.4.1 ? 受精率 ? 水溫對(duì)胚胎受精率的影響見圖2-c。5℃組胚胎發(fā)育到原腸早期便不再發(fā)育，9～18℃組胚胎受精率較高，均超過90%；水溫在20℃及以上時(shí)，魚卵受精率明顯降低，20℃組受精率81.47%，22℃組受精率僅18.34%。

2.4.2 ? 孵化率 ? 水溫對(duì)胚胎孵化率的影響見圖2-e。隨著水溫升高，胚胎孵化率呈先升高、后降低趨勢(shì)。5℃組孵化率最低，為0；5～14℃，孵化率逐漸升高，14℃時(shí)達(dá)到最高，為96.23%；水溫超過16℃后，孵化率明顯降低；22℃組最低，僅有3.29%。水溫12～16℃，孵化率較高，均超過95%?；貧w分析表明，水溫與孵化率呈二次函數(shù)關(guān)系：y=-7.9608x2+68.145x-44.317（R2=0.9138）。

2.4.3 ? 仔魚畸形率 ?水溫對(duì)初孵仔魚畸形率的影響見圖2-f。隨著水溫升高，初孵仔魚畸形率顯著升高。12℃組畸形率最低，為0.76%；水溫9～16℃時(shí)畸形率較低，且均低于4%；水溫高于18℃后，畸形率顯著升高；18℃、20℃、22℃組的畸形率分別為16.04%、27.87%、84.21%。回歸分析表明，水溫與畸形率呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系：y=0.2325e0.7935x（R2=0.8926）?；昔~苗主要表現(xiàn)為尾部畸形、脊柱骨畸形、眼睛缺失或發(fā)育不良和卵黃囊畸形（圖3）。

2.5 ? 水溫與初孵仔魚形體指標(biāo)

水溫對(duì)初孵仔魚形體指標(biāo)的影響見表3。水溫與初孵仔魚全長呈二次多項(xiàng)式函數(shù)關(guān)系（圖4-a）。12～20℃，各溫度組全長沒有顯著性差異（P>0.05），但顯著高于9℃組與22℃組（P<0.05）。水溫與初孵仔魚卵黃囊體積呈3次函數(shù)關(guān)系（圖4-b）；9～20℃各組間沒有顯著性差異（P>0.05），22℃組顯著性增加（P<0.05）。水溫9～14℃，初孵仔魚眼徑隨溫度升高顯著增加（P<0.05）；14～20℃，各溫度組差異不顯著（P>0.05）；22℃組顯著降低（P<0.05）。水溫9～22℃，初孵仔魚體高均沒有顯著性差異（P>0.05）。

3 ? 討論

3.1 ? 水溫對(duì)胚胎發(fā)育速度的影響

水溫可直接影響胚胎發(fā)育的速度（沈和定等，2005），在一定溫度范圍內(nèi)，胚胎發(fā)育速度隨水溫升高而加快（甘小平，2012）。本次實(shí)驗(yàn)中，由于水溫5℃時(shí)胚胎發(fā)育在原腸早期之后就停止發(fā)育，無法統(tǒng)計(jì)孵化時(shí)間；其余水溫組孵化時(shí)間隨溫度的升高而逐漸縮短。對(duì)拉薩裸裂尻魚（Schizopygopsis younghusbandi）（劉艷超等，2019）、尖裸鯉（Oxygymnocypris stewartii）（劉艷超等，2018）、日本黃姑魚（Nibea japonica）（許源劍等，2010）、稀有鮈鯽（Gobicypris rarus）（甘小平，2012）、大銀魚（Prolosalanx hylocranius）（戈志強(qiáng)等，2003）、云紋石斑魚（Epinephelus moara）（張廷廷等，2016）的研究均得出類似結(jié)果。

3.2 ? 拉薩裂腹魚孵化極限水溫及適宜水溫

水溫對(duì)于魚類的胚胎發(fā)育至關(guān)重要，水溫過低會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育停止（張?chǎng)卫冢?006）；即使能夠孵化出膜，初孵仔魚死亡率也極高（劉艷超等，2018）；而過高的水溫會(huì)影響孵化率，甚至使受精卵無法孵化（戈志強(qiáng)等，2003）。樓允東（1965）認(rèn)為魚類胚胎的孵化主要依靠胚體運(yùn)動(dòng)和孵化酶兩方面作用；溫度是影響酶催化活性最重要的外界因素之一，酶只有在其適宜的溫度范圍內(nèi)擁有最大活性，當(dāng)溫度在其適宜范圍之外時(shí)，酶活力會(huì)大大降低，且高溫下酶失活后的活性不可逆。樊廷俊和史振平（2002）指出，在胚胎發(fā)育過程中，溫度降低不僅顯著延遲孵化，而且胚胎的存活率也明顯降低；但溫度到達(dá)30℃時(shí)，受精卵發(fā)育至胚體形成期便停止分裂，長時(shí)間的高溫使孵化酶分泌受到抑制或過早消耗，最終導(dǎo)致絕大多數(shù)的胚胎無法破膜而出。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水溫5℃組胚胎發(fā)育在原腸早期即停止發(fā)育，水溫9～22℃時(shí)受精率和孵化率基本均呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)，各水溫組畸形率隨孵化水溫升高而顯著升高。溫度通過影響孵化酶的分泌及其活性控制仔魚孵出，同時(shí)影響胚胎的成活率和畸形率（樓允東，1965；樊廷俊和史振平，2002）。因此，綜合考慮受精率、孵化率、初孵仔魚畸形率等因素，拉薩裂腹魚胚胎發(fā)育極限最低溫為5℃，極限最高溫為22℃，適宜水溫為12～16℃。

拉薩裂腹魚極限最低溫與尖裸鯉、拉薩裸裂尻魚、大瀧六線魚（Hexagrammos otakii）相近；極限最高溫與扁吻魚（Aspiorhynchus laticeps）、大瀧六線魚相近，胚胎孵化適宜水溫與尖裸鯉、拉薩裸裂尻魚、大瀧六線魚、中華多刺魚（Pungitius sinensis）等大部分冷水性魚類接近，較鰱（Hypophthalmichthys molitrix）、鯉（Cyprinus carpio）、扁吻魚、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）等溫帶魚類和泰國斗魚（Betta splendens）、鱖（Siniperca chuatsi）、神仙魚（Pterophyllum scalare）、云紋石斑魚（Epinehelus moara）等熱帶魚類低，詳見表4。

3.3 ? 基于孵化水溫解析拉薩裂腹魚高原適應(yīng)性

魚類胚胎孵化極限水溫和適宜水溫與魚類長期生活環(huán)境水溫密切相關(guān)，半滑舌鰨繁殖季節(jié)的自然水溫17.5～22.0℃，其胚胎最適合孵化水溫為20.5～21.6℃（杜偉等，2004）；瓦氏黃顙魚繁殖季節(jié)的自然水溫22.0～28.0℃，其胚胎最適合孵化水溫為25℃（袁倫強(qiáng)等，2005）；以上2種溫帶魚的胚胎適宜孵化水溫均在繁殖季節(jié)自然水溫范圍內(nèi)。拉薩裂腹魚繁殖季節(jié)雅魯藏布江日喀則段水溫為5～8℃，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其適宜孵化水溫為12～16℃，較其繁殖季節(jié)自然水溫高，可能是在西藏高原隆起以前，拉薩裂腹魚生活環(huán)境為溫帶，喜歡溫帶水環(huán)境；但隨著西藏高原隆起，海拔逐漸升高，拉薩裂腹魚生活的水域水溫逐漸降低，為了生存不斷適應(yīng)低溫環(huán)境，但其胚胎發(fā)育目前還沒有完全適應(yīng)低溫環(huán)境。因此，拉薩裂腹魚的卵在高于自然水溫條件下孵化，其受精率、孵化率及初孵仔魚畸形率要優(yōu)于自然水溫條件。拉薩裂腹魚的繁殖在每年4-5月，為雅魯藏布江水溫升高的季節(jié)，在此時(shí)段繁殖，魚卵在水溫較高的環(huán)境中可獲得較高的孵化率，產(chǎn)生較多的后代，可見拉薩裂腹魚繁殖季節(jié)也是長期適應(yīng)高原水域環(huán)境的結(jié)果。

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（責(zé)任編輯 ? 萬月華）

Suitable Water Temperature for Incubating Schizothorax waltoni Eggs

ZENG Ben‐he1， GONG Jun‐hua1， LIU Hai‐ping1， WANG Wan‐liang1， WANG Jin‐lin1， HE Lin‐qiang2

（1. Institute of Fisheries Science， Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，

Lhasa ? 850002， P.R. China;

2. College of fisheries， Huazhong Agricultural University， Wuhan ? 430070， P.R. China）

Abstract：Schizothorax waltoni， the primary economic fish species of Tibet， is distributed only in the Yarlung Zangbo River basin. In recent decades， the S. waltoni resource has been threatened by invasive fish species， hydropower project construction， overfishing and habit degradation and it is urgent to carry out research to support S. waltoni conservation. In this study， we conducted an incubation test of S. Waltoni eggs at 8 water temperatures （5℃， 9℃， 12℃， 14℃， 16℃， 18℃， 20℃， 22℃）， to study the effect of water temperature on incubation time， fertilization rate， hatching rate， deformity rate and body indices of newly hatched larvae of S. Waltoni and determine the optimal incubation water temperature for embryo development. On April 12th 2019， approximately thirteen thousand fertilized eggs were obtained by artificially induced spawning and fertilization. The eggs were divided into 8 groups and one group was incubated at each water temperature. From fertilized eggs to newly hatched larvae， the development of S. waltoni embryos were observed every two hours， and the pertinent data were recorded for each group. With increasing water temperature， embryo development accelerated and incubation time decreased， while the accumulated incubation temperature gradually decreased. The relationship between the developmental period of S. waltoni embryo （incubation time） was described as a power function of incubation temperature. In the incubation temperature range of 9-18℃， the fertilization rate of eggs exceeded 90%. In the incubation temperature range of 12-16℃， the hatching rate exceeded 95%. In the temperature range of 9-16℃， the deformity rate of newly hatched larvae were less than 4%. The relationship between the total length of the newly hatched larvae and temperature was described by an quadratic function. In the temperature range of 9-22℃， differences in larvae body height were not large， and the yolk sac volume increased initially， then decreased and again increased. The relationship of yolk sac volume and temperature was expressed by a cubic function. In conclusion， increasing the incubation water temperature appropriately can reduce the incubation period. However， a water temperature that is too high adversely affects the hatching rate， the deformity rate， the absorption and utilization of nutrients， organ development and differentiation of the larvae. Considering the hatching cycle， hatching rate， deformity rate and body indices of the newly hatched larvae， the optimal temperature range for hatching S. waltoni embryo is 12-16℃.

Key words：Schizothorax waltoni; embryo development; fertilization rate; hatching rate; deformity rate; water temperature