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養(yǎng)殖尾水處理系統(tǒng)填料生物膜氮循環(huán)微生物功能特征

2023-04-29 10:17:33曲疆奇張清靖楊浩辰趙萌朱華
水生態(tài)學(xué)雜志 2023年2期

曲疆奇 張清靖 楊浩辰 趙萌 朱華

摘要:為探討填料生物膜在養(yǎng)殖尾水處理中對(duì)水體氮循環(huán)的影響機(jī)制,采用16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序和宏基因組測(cè)序技術(shù),對(duì)填料生物膜、水體細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)及其與氮循環(huán)相關(guān)的功能基因豐度差異特征進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,填料生物膜微生物主要參與氮代謝活動(dòng)。在屬水平上,Pseudomonas、Spirochaeta、Opitutus和Syntrophus是填料生物膜氮素轉(zhuǎn)化過程的重要功能微生物類群。與水體相比,填料生物膜的碳代謝活動(dòng)能力較強(qiáng)(P<0.05);填料生物膜上固氮功能基因nifH、硝化功能基因hao、反硝化和異化硝酸鹽功能基因napA、nirS、norB、norC、nrfA、nirB和氮代謝調(diào)控基因ntrC及其相應(yīng)的關(guān)鍵酶均顯著高于周圍水體(P<0.05),且對(duì)含氮污染物有顯著去除效果。研究表明,養(yǎng)殖尾水處理系統(tǒng)內(nèi)復(fù)合填料生物膜具有比周圍水環(huán)境更強(qiáng)的氮周轉(zhuǎn)能力,主要通過關(guān)鍵功能物種介導(dǎo)的固氮和反硝化作用實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖尾水氮素的轉(zhuǎn)化和遷移。研究結(jié)果作為野外實(shí)驗(yàn)證據(jù),可為復(fù)合填料生物膜系統(tǒng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水治理中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞:養(yǎng)殖尾水;填料生物膜;氮循環(huán);功能微生物

中圖分類號(hào):X506 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A ? ? ? ?文章編號(hào):1674-3075(2023)02-0104-10

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)作為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要組成部分,水資源短缺和水污染已成為制約水產(chǎn)行業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵問題。傳統(tǒng)養(yǎng)殖池塘中高濃度的氨氮不僅會(huì)嚴(yán)重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物機(jī)體組織、酶活性、代謝以及攝食活動(dòng),甚至造成死亡(王夢(mèng)杰等, 2019);同時(shí),氮素的累積也是池塘水體富營(yíng)養(yǎng)化形成的重要因子(薛飛等, 2005)。因此,探索水產(chǎn)養(yǎng)殖綠色發(fā)展模式,加強(qiáng)池塘尾水處理與循環(huán)再利用,對(duì)于養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控和水生動(dòng)物健康至關(guān)重要。填料生物膜水質(zhì)凈化技術(shù)是近年來發(fā)展的一種用于淡水養(yǎng)殖池塘尾水處理、養(yǎng)分循環(huán)再利用的可持續(xù)漁業(yè)生產(chǎn)新興技術(shù)。相比于傳統(tǒng)的理化方法,生物膜法在水體修復(fù)過程中具有清潔污染物效率高和經(jīng)濟(jì)成本低等優(yōu)點(diǎn)(Zhao et al,2019)。在養(yǎng)殖池塘中,主要在池塘尾水端設(shè)置生物屬性的載體填料,附著在載體上的生物膜主要由微生物及其胞外聚合物混合組成(Arunkumar et al,2020);生物膜在水體中具有較大的比表面積,從而為微生物生長(zhǎng)和生物膜形成提供了良好的環(huán)境,同時(shí)增加空間異質(zhì)性,加速氮污染物的去除效率(Ruiz ?et al,2020)。

微生物在水體氮循環(huán)過程中發(fā)揮重要作用,氮循環(huán)核心過程主要包括固氮作用、硝化作用、同化硝態(tài)氮還原(ANRA)、反硝化作用、異化硝態(tài)氮還原為銨(DNRA)等(Sun et al, 2019);其功能基因(如固氮nifH、反硝化narG、nirS和nosZ、硝化amoA)參與了不同的氮素轉(zhuǎn)化過程(Zhang et al, 2020)。目前,隨著宏基因組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展,不僅能夠快速獲取目標(biāo)微生物整個(gè)基因組信息(Zaheer et al, 2018),而且可以通過掌握微生物群落結(jié)構(gòu)演替和與氮代謝相關(guān)編碼酶及功能基因變化特征,解析微生物群落的物種間以及與環(huán)境間的相互作用機(jī)制,并將可能的基因表達(dá)功能變化歸因于微生物群落中的某種特定物種(Chen et al, 2022a)。

研究表明,填料生物膜通過吸附、解吸、積累和降解等機(jī)制,影響污染物的遷移和分布(Morgan-Sagastume, 2018),并顯著消減養(yǎng)殖水體中的氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽等有害物質(zhì)(Sun et al, 2019),從而實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖尾水原位脫氮修復(fù),達(dá)到水質(zhì)凈化與環(huán)境修復(fù)目的。然而,目前關(guān)于養(yǎng)殖尾水處理過程中填料生物膜微生物在氮素遷移轉(zhuǎn)化中功能特征(包括功能基因,功能微生物等)機(jī)理研究明顯不足。為此,本研究利用宏基因組技術(shù)和16S擴(kuò)增子高通量測(cè)序技術(shù),聯(lián)合研究填料生物膜在尾水處理過程中的微生物群落多樣性特征、主要代謝活動(dòng)以及氮循環(huán)功能基因和關(guān)鍵酶的變化特征,探討核心功能微生物在氮素轉(zhuǎn)化過程中的潛在驅(qū)動(dòng)機(jī)制,以期為淡水養(yǎng)殖池塘尾水處理填料生物膜脫氮處理技術(shù)的發(fā)展提供野外試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2020年在北京市農(nóng)林科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所示范基地進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)選用復(fù)合填料購(gòu)自江蘇華賽環(huán)保填料有限公司(圖1)。填料參數(shù)規(guī)格為單元直徑120 mm、塑料環(huán)片、密度為0.93 g/cm3的維綸醛化絲、套管、中心繩組成,每組填料間距100 mm,每根截成長(zhǎng)度150 cm懸掛在鋼架上,下端墜重物使生物填料能在水體中處于垂直狀態(tài),下端距池塘底部5 cm。在長(zhǎng)×寬×深=65 m×55 m×2 m的池塘中鋪設(shè)復(fù)合填料生物膜養(yǎng)殖尾水處理系統(tǒng)。當(dāng)填料材料自然掛膜穩(wěn)定后,在養(yǎng)殖高峰期的5-8月進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 ? 樣本采集

每月分別采集池塘復(fù)合填料生物膜(Bioflm)養(yǎng)殖尾水處理系統(tǒng)填料樣本(B組)300 g及搭載生物膜浮床系統(tǒng)(Floating-bed water)的周圍水樣(FW組)500 mL,每次均采集3個(gè)平行樣,分別位于系統(tǒng)前端、中部和尾部,共采集24個(gè)樣本用于16S rRNA高通量測(cè)序和宏基因組高通量測(cè)序分析,試驗(yàn)期間池塘養(yǎng)殖管理措施基本保持一致。分別在該系統(tǒng)進(jìn)水口和出水后處使用英國(guó)Aquaread AP-700多參數(shù)便攜式水質(zhì)分析儀,現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定水溫(WT)、溶解氧(DO)、pH 和總固定懸浮物(TDS)等常規(guī)水質(zhì)指標(biāo);同時(shí),分別取等量的500 mL水樣帶回實(shí)驗(yàn)室,參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》測(cè)定總氮(TN)、氨氮(NH4+-N)、硝態(tài)氮(NO3--N)、亞硝態(tài)氮(NO2--N)和總磷(TP)等水化指標(biāo)。

1.3 ? 微生物DNA提取和宏基因組測(cè)序

參考前人實(shí)驗(yàn)操作方法(Chen et al, 2022b),首先將填料生物膜樣本剪碎后置于50 mL離心管中,并向離心管中注入適量的PBS緩沖液;然后在振蕩器上震蕩5 min,重復(fù)操作6次后收集水樣,在低溫環(huán)境下12 000 r/min下離心10 min,收集到的沉淀樣本使用Fast DNATM Spin Kit for Soil(MP Biomedicals 美國(guó))試劑盒抽提樣本DNA;同時(shí)提取水環(huán)境樣本DNA,待所有24個(gè)樣本DNA濃度和純度檢驗(yàn)合格后,干冰保存寄送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。

以細(xì)菌特異性引物338F: 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3', 806R: 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'擴(kuò)增16S rRNA基因V3-V4高變區(qū),構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)后,基于illumina Miseq PE300高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)填料生物膜尾水處理系統(tǒng)內(nèi)的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性特征(其中α多樣性指數(shù)包括香濃多樣性指數(shù)、辛普森多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù))進(jìn)行研究;此外,利用NEXT flexTM Rapid DNA-Seq(Bio Scientific,美國(guó))構(gòu)建PE文庫(kù),使用Hiseq Xten(Illumina,美國(guó))測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行宏基因組測(cè)序,使用fastp(https://github.com/OpenGene/fastp,version 0.20.0)對(duì)原始數(shù)據(jù)reads進(jìn)行質(zhì)量剪切,對(duì)優(yōu)化的reads進(jìn)行拼接組裝。使用Meta Gene(http://metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/)對(duì)拼接結(jié)果中的contigs進(jìn)行開放閱讀框ORF預(yù)測(cè),利用CD-HIT(http://www.bioinformatics.org/cd-hit/,version 4.6.1)構(gòu)建非冗余基因集。最后,使用SOAP align軟件(http://soap.genomics.org.cn/,version 2.21),分別將每個(gè)樣品的高質(zhì)量reads與非冗余基因集進(jìn)行比對(duì)(95% identity),統(tǒng)計(jì)基因在對(duì)應(yīng)樣品中的豐度信息,對(duì)得到的基因進(jìn)行NR(Amino acid sequence of non-redundant protein)物種注釋和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)功能注釋,篩選得到與氮循環(huán)代謝相關(guān)的基因類群及其相對(duì)豐度信息。

1.4 ? 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2007和R軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖。采用STAMP對(duì)填料生物膜微生物主要代謝功能差異進(jìn)行單因素Welch方差分析;利用R語(yǔ)言scale函數(shù)將不同量級(jí)的基因拷貝數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)離差標(biāo)準(zhǔn)化處理后,計(jì)算出相對(duì)豐度值;采用單因素(One-way ANOVA)分析填料生物膜上不同氮循環(huán)功能基因拷貝數(shù)的差異,其中*代表P<0.05,**代表P<0.01,***代表P<0.001。

[Ai ?= Xi-XminXmax-Xmin] ? ①

[φ = Ai i=0nA] ? ?②

式中:Ai為樣本i功能基因數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化值,Xi為樣本i實(shí)際值,Xmax為樣本數(shù)據(jù)的最大值,Xmin為樣本數(shù)據(jù)的最小值,φ為樣本相對(duì)豐度。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? 填料生物膜微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)特征

通過16S rDNA高通量測(cè)序共獲得1 061 657條有效16S rRNA基因序列,可劃分為15 294個(gè)OTUs。據(jù)表1可知,B組微生物群落Shannon多樣性指數(shù)和Chao豐富度指數(shù)均顯著高于FW組(P<0.05),說明填料生物膜微生物多樣性更為豐富。PCoA分析表明,B組微生物群落結(jié)構(gòu)與FW組存在明顯差異(P=0.001<0.05),但組內(nèi)不同月份間具有較高的相似性(圖2-a)。變形菌門(Proteobacteria)是填料生物膜和水體微生物的主要優(yōu)勢(shì)種類(圖2-b)。填料生物膜上擬桿菌門(Bacteroidota)、Patescibacteria菌、厚壁菌門(Firmicutes)等菌群相對(duì)豐度顯著高于水體環(huán)境(P<0.05);而在該系統(tǒng)水體中,藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)和放線菌(Actinobacteriota)為主要優(yōu)勢(shì)門類,相對(duì)豐度較高。如圖2-c所示,排名前10的優(yōu)勢(shì)屬中,填料生物膜上芽孢桿菌(Bacillus)相對(duì)豐度顯著高于水體環(huán)境(P<0.05),而水體中顯著富集了藍(lán)細(xì)菌(Cyanobium_PCC-6307)、棲湖菌(Limnohabitans)、多核桿菌(Polynucleobacter)、腸桿菌(Enterobacter)、類芽孢桿菌(Paenibacillus)、黃桿菌(Flavobacterium)和噬氫菌屬(Hydrogenophaga)等微生物。

2.2 ? 填料生物膜微生物主要代謝功能

根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)微生物的三級(jí)功能分類(圖3),相對(duì)豐度排名前5的分別是氮代謝、丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝、氨基酸生物合成、精氨酸生物合成、細(xì)菌雙組分系統(tǒng)等代謝功能途徑。結(jié)果表明,在養(yǎng)殖尾水處理系統(tǒng)中填料生物膜和水體微生物主要參與氮代謝和氨基酸代謝活動(dòng);其中,填料生物膜在細(xì)菌雙組分系統(tǒng)功能途徑上與周圍水環(huán)境呈極顯著性差異(P=0.008<0.01),說明填料生物膜微生物雙組分系統(tǒng)能夠快速響應(yīng)周圍水環(huán)境變化,并通過調(diào)控相關(guān)生理活動(dòng)維持細(xì)胞體內(nèi)碳氮代謝平衡。與水體相比,填料生物膜微生物在碳代謝和嘌呤代謝等代謝過程表現(xiàn)得更為活躍(P<0.05);此外,填料生物膜上氯代烷烴和氯代烯烴降解途徑也顯著增強(qiáng)(P=0.008<0.01),說明填料生物膜微生物可能對(duì)鹵代烴污染物也有具有潛在的生物降解能力。

2.3 ? 填料生物膜微生物氮循環(huán)功能基因和關(guān)鍵酶

填料生物膜和水體微生物參與的氮循環(huán)過程主要包括氮固定、硝化作用、反硝化作用、異化硝酸鹽和同化硝酸鹽還原作用5個(gè)主要途徑(圖4)。結(jié)果表明,參與氮循環(huán)的關(guān)鍵功能基因豐度發(fā)生了明顯變化;其中,填料生物膜上有9個(gè)關(guān)鍵功能基因相對(duì)豐度顯著高于周圍水體(P<0.05)。主要包括氮循環(huán)固氮功能基因nifH、硝化作用功能基因hao、反硝化和異化硝酸鹽還原作用功能基因napA、nirS、norB、norC、nrfA和nirB以及氮代謝調(diào)控基因ntrC。而在水體中,硝化作用功能基因amoA相對(duì)豐度較高(P<0.05),其他功能基因在2組中無(wú)顯著性差異(P>0.05);此外,共檢測(cè)到27個(gè)與氮代謝通路相關(guān)的關(guān)鍵編碼酶信息。與水體相比,填料生物膜上固氮酶(nitrogenase,EC1.18.6.1)、羥胺還原酶(hydroxylamine reductase,1.7.99.1)和氧化亞氮還原酶(nitrous-oxide reductase,EC1.7.2.4)和一氧化氮還原酶(nitric oxide reductase,EC1.7.2.5)、細(xì)胞色素C亞硝酸鹽還原酶(nitrite reductase (cytochrome),EC1.7.2.2)的相對(duì)豐度較高(P<0.05)(圖5)。這些關(guān)鍵酶主要催化氮循環(huán)中的固氮反應(yīng)、硝化反應(yīng)、反硝化反應(yīng)和DNRA過程。由此可見,填料生物膜上是養(yǎng)殖尾水處理系統(tǒng)內(nèi)生物固氮和生物脫氮過程的主要場(chǎng)所。

2.4 ? 填料生物膜核心功能微生物

物種與功能貢獻(xiàn)度關(guān)聯(lián)分析(圖6-a)結(jié)果表明,在屬水平上共篩選出16個(gè)填料生物膜核心功能物種,分別在固氮、反硝化作用和異化硝酸鹽還原途徑貢獻(xiàn)比例較高。其中,固氮假單胞菌(Pseudomonas)在固氮途徑所占豐度最大(>50%),其他貢獻(xiàn)度較高的分別是甲基桿菌(Methylobacter)、地桿菌(Geobacter)和莢硫菌(Thiocapsa);螺旋菌(Spirochaeta)完全與反硝化作用有關(guān),每個(gè)月的貢獻(xiàn)度均為100%;而豐佑菌(Opitutus)和互營(yíng)菌(Syntrophus)完全參與異化硝酸鹽還原途徑,每個(gè)月的貢獻(xiàn)度也為100%,其他均菌屬均同時(shí)參與反硝化和異化硝酸鹽還原途徑。從圖6-b可以看出,上述核心功能微生物中,Spirochaeta、Syntrophus、Methylobacter等微生物主要富集在填料生物膜上,并在氮循環(huán)過程中發(fā)揮了重要作用。

2.5 ? 填料生物膜養(yǎng)殖尾水處理系統(tǒng)的水質(zhì)變化

試驗(yàn)期間,溫度、溶解氧濃度、總固體懸浮物和 pH 值等常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)在養(yǎng)殖尾水凈化前后均無(wú)顯著性差異(P>0.05);而養(yǎng)殖尾水經(jīng)填料生物膜養(yǎng)殖尾水系統(tǒng)處理后,水體中的總氮、氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮濃度均顯著降低(P<0.05)(表2),說明鋪設(shè)填料生物膜系統(tǒng)后可以有效去除養(yǎng)殖尾水中含氮污染物。

3 ? 討論

3.1 ? 填料表面微生物顯著增強(qiáng)生物膜氮代謝功能

填料表面微生物群落通過聚集及其代謝產(chǎn)物共同形成生物膜結(jié)構(gòu),占據(jù)了膜系統(tǒng)微生態(tài)環(huán)境的主要生態(tài)位(Mahto & Das, 2022)。本研究結(jié)果表明,在尾水處理過程中氮代謝是填料生物膜參與最主要的代謝活動(dòng),同時(shí)會(huì)耦聯(lián)細(xì)菌雙組分系統(tǒng)、碳代謝和氨基酸合成與代謝等生理活動(dòng)(圖3)。細(xì)菌雙組分系統(tǒng)是存在于細(xì)菌內(nèi)的一種信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng),通過參與和調(diào)控多個(gè)生理代謝過程,維持自身細(xì)胞碳氮平衡(Li & Lu,2007)。研究發(fā)現(xiàn),氮代謝調(diào)控蛋白NtrC普遍存在于細(xì)菌中,是微生物氮代謝調(diào)控系統(tǒng)中雙組分系統(tǒng);NrtC蛋白由ntrC基因編碼,主要參與固氮微生物的一般氮代謝和固氮過程。本研究結(jié)果顯示(圖4),填料生物膜ntrC基因相對(duì)豐度高于水體,說明填料生物膜能夠快速響應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)水環(huán)境變化。研究表明,NrtC蛋白能夠與碳代謝調(diào)控蛋白CbrB發(fā)生偶聯(lián)作用(李琴等, 2013);在微生物胞外聚合物(EPS)的作用下,可將大分子有機(jī)污染物降解成水溶性低分子的氨基酸、單糖和無(wú)機(jī)酸等,從而使污染物得到降解(林治岐等, 2018);此外,吸附在載體上的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含有大量氨基酸,會(huì)增強(qiáng)生物膜上嗜氨基酸類細(xì)菌活性,從而微生物更容易利用氨基酸類和羧酸類等碳源物質(zhì)強(qiáng)化生物膜形成(車建鋒等, 2017)。研究發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌、假單胞菌、硫桿菌等微生物均可利用氨基酸和羧酸類作為營(yíng)養(yǎng)源(莊康等,2020),這些微生物也是本研究中填料生物膜的主要功能類群;其中,芽孢桿菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖水環(huán)境中一種主要的嗜氨基酸類細(xì)菌,能夠顯著提高水體微生物群落代謝的多樣性(楊鶯鶯等,2009)。本研究結(jié)果表明,芽孢桿菌顯著富集在填料生物膜上(圖2-c),不僅可以提高微生物代謝活性,而且有利于降解有機(jī)物并改善養(yǎng)殖水體環(huán)境(李卓佳等,2007)。

3.2 ? 填料生物膜有利于固氮微生物富集

微生物介導(dǎo)的固氮過程在生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)和平衡中具有極為重要的作用。微生物固氮作用由高度保守負(fù)責(zé)編碼鉬鐵固氮酶nif基因(包括nifH、nifD、nifK基因)催化完成(馬貴興和井申榮, 2013),其中nifH被廣泛用于檢測(cè)環(huán)境樣本中固氮微生物多樣性(Baskaran & Prabavath, 2022)。本研究中,填料生物膜上nifH基因微生物種群的豐度較高 (圖4),說明填料生物膜上富集了大量的固氮微生物。固氮假單胞菌(Pseudomonas)對(duì)固氮途徑貢獻(xiàn)度最大,其次是甲基桿菌(Methylobacter)和地桿菌(Geobacter)(圖6-a),這些核心微生物主要富集在填料生物膜上(圖6-b)。研究發(fā)現(xiàn),假單胞菌中Gac/Rsm系統(tǒng)主要參與固氮和生物膜形成(張譯兮等,2019)。通過調(diào)控生物膜形成關(guān)鍵蛋白R(shí)poN(Shang et al, 2021)在轉(zhuǎn)錄水平上激活nifH基因,從而觸發(fā)Gac/Rsm系統(tǒng)中的RsmZ,并在RpoS蛋白制動(dòng)作用下調(diào)控假單胞菌固氮生物膜的形成(Zhang et al, 2021);而在生物膜上,富集的Geobacter菌不僅是關(guān)鍵固氮微生物類群,而且其還是一種具有產(chǎn)電、吸電功能的電活性微生物(Ye et al, 2022);電活性微生物是生物膜重要組成部分,可在EPS介導(dǎo)下通過胞外電子傳遞實(shí)現(xiàn)污水處理、生物固氮與清潔電能生產(chǎn)的三重功效(Jing et al, 2022),因此也是當(dāng)前廢水處理和其他污染控制措施中最有前途的生物膜類型之一(Li et al, 2021a);與此同時(shí),具有固氮生理活性的好氧甲烷氧化菌Methylobacter更傾向消耗中生物膜內(nèi)部的氧氣(Costa et al, 2022),從而增強(qiáng)甲烷氧化過程,并為反硝化作用創(chuàng)造厭氧微環(huán)境(Cao et al, 2021)。由此可見,Pseudomonas、Methylobacter和Geobacter等核心功能微生物主要通過自身不同的氮代謝調(diào)控途徑和生理功能特征,促進(jìn)填料生物膜的形成,提高生物膜的固氮能力,同時(shí)也為反硝化過程提供了缺氧環(huán)境條件。

3.3 ? 功能菌群促進(jìn)填料生物膜反硝化脫氮過程

反硝化和異化硝酸鹽還原作用均可還原硝酸鹽氮,是廢水處理中生物脫氮的關(guān)鍵途徑(張博雅和余珂, 2020)。本研究中,填料生物膜微生物反硝化和異化硝酸鹽還原作用的功能基因(圖4)和關(guān)鍵酶的豐度(圖5)明顯增加;其中,功能基因norB和nosZ分別是編碼一氧化氮還原酶 Nor 和一氧化二氮酶Nos的關(guān)鍵反硝化菌群結(jié)構(gòu)的分子標(biāo)記(梁麗華和左劍惡, 2009);兩者豐度的顯著增加,說明填料生物膜微生物能夠促進(jìn)氮素一氧化氮向氮?dú)馔瓿赊D(zhuǎn)化,從而完成脫氮過程。試驗(yàn)結(jié)果表明,中空纖維膜生物反應(yīng)器中的優(yōu)勢(shì)菌Spirochaeta能夠利用反硝化去除一氧化氮(Razaviarani et al, 2019)。本研究中,Spirochaeta菌具有完全參與反硝化過程的能力(圖6-a);此外,異化硝酸鹽還原途徑是廢水處理中維持厭氧氨氧化過程強(qiáng)化脫氮的關(guān)鍵步驟,其中nrfA功能基因是造成DNRA差異的關(guān)鍵生物因子,填料生物膜上高nrfA功能基因豐度說明,填料生物膜DNRA群落占據(jù)主要了主要生態(tài)位。有研究發(fā)現(xiàn),A2/O 生物反應(yīng)器(FBBR)中厭氧氨氧化細(xì)菌對(duì)缺氧填料生物膜具有顯著的生態(tài)位偏好(Li et al, 2021b)。在本研究中,填料生物膜上Syntrophus菌和Opitutus菌完全參與異化硝酸鹽還原途徑。Syntrophus菌是一種極端厭氧氨氧化細(xì)菌,也是為數(shù)不多能夠降解有機(jī)物脂肪酸的生命形式,在全球碳循環(huán)中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Mcinerney et al, 2007);此外,Opitutus菌是厭氧消化反應(yīng)器中有機(jī)物厭氧降解產(chǎn)二氧化碳和甲烷過程中的關(guān)鍵功能類群(張雪等,2019)。研究發(fā)現(xiàn),Opitutus菌株P(guān)B90-1擁有編碼反硝化和異化硝酸鹽還原途徑的完整功能基因(Sanford et al,2012)。因此,填料生物膜上的功能菌群在異化硝酸鹽還原成銨和反硝化脫氮過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。然而,有關(guān)填料生物膜微生物復(fù)雜群落中種間的異質(zhì)相互作用非常復(fù)雜,其參與氮素轉(zhuǎn)化機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究加以證實(shí),這也是未來生物膜技術(shù)在廢水生物處理應(yīng)用中的重要研究方向之一。

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(責(zé)任編輯 ? 萬(wàn)月華)

Functional Characteristics of Nitrogen Cycling Microbes in the Biofilm Carrier

of an Aquaculture Tailwater Treatment System

QU Jiang‐qi1, ZHANG Qing‐jing1, YANG Hao‐chen1,2, ZHAO Meng1, ZHU Hua1

(1. Beijing Key Laboratory of fishery Biotechnology, Fisheries Science Institute,

Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing ? 100068, P.R. China;

2. Dalian Ocean University, Dalian ? 116023, P.R. China)

Abstract: In this study, we explored the differences in bacterial community structure and abundance in the functional genes related to nitrogen cycling between the biofilm carrier and pond water of an aquaculture tailwater treatment system. Our objective was to better understand the mechanism by which the biofilm carrier effects nitrogen cycling during tailwater treatment. The study was carried out from May to August of 2020 in an aquaculture pond (65 m×55 m×2 m) with a biofilm carrier treatment system. After the biofilm stabilized on the carrier, samples of the biofilm and pond water were collected monthly for microbial analysis by 16S rRNA gene amplicon sequencing and metagenomic sequencing. As samples were collected, some water quality parameters were determined in situ and others by laboratory analysis. Results show that nitrogen metabolism was carried out primarily by biofilm microbes and, at the genus level, the primary bacterial groups involved with nitrogen transformations included Pseudomonas, Spirochaeta, Opitutus and Syntrophus. Compared with the pond water, carbon metabolic activity in the biofilm carrier was significantly stronger (P<0.05). The relative abundance of the functional gene nifH (nitrogen fixation), hao (nitrification), napA, nirS, norB, norC, nrfA and nirB (denitrification) and ntrC (nitrogen metabolism regulation) and their corresponding key enzymes were significantly higher than those in the surrounding water (P<0.05). Further, the biofilm carrier system significantly decreased nitrogen concentration, indicating that the biofilm microbes had a stronger nitrogen turnover rate than the surrounding water environment. Our results show that biofilm microbes in the aquaculture tailwater treatment system were primarily involved in the transformation and migration of nitrogen through nitrogen fixation and denitrification. The field data from this study provide a theoretical basis for implementing biofilm carrier systems for treating aquaculture tailwater.

Key words:aquaculture tailwater; biofilm carrier; nitrogen cycle; functional microorganisms

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