孔雨晨 梁方檳 王曉丹 黃鵬 張苗苗 洪美玲 史海濤 丁利

摘要：為了探究全球氣候變化背景下淡水和沿岸土壤鹽化對龜類生存造成的威脅和挑戰(zhàn)，了解鹽度變化對龜類早期生活史的影響，以紅耳龜（Trachemys scripta elegans）為研究對象，設(shè)置淡水對照組（CK）、0.5鹽度組（S0.5）、2.5鹽度組（S2.5）和5鹽度組（S5），分析鹽度變化對其受精卵孵化、稚龜表型及行為特征的影響。結(jié)果顯示，隨著基質(zhì)中鹽度的升高，CK、S0.5、S2.5、S5組紅耳龜稚龜孵化率（80.00%、83.33%、60.00%、43.33%）基本呈下降趨勢，孵化時間（51、52、54、53 d）略有增加，稚龜在30 d時的存活率（95.83%、95.83%、94.44%、81.80%）逐漸下降，并導(dǎo)致孵出個體的畸形率增加，且以龜甲畸形占比最高（S5組為100%）。高鹽度（S5）基質(zhì)中孵出的稚龜，其體重極顯著低于對照組（P<0.01），背、腹甲的長度和寬度也顯著低于對照組（P<0.05）。稚龜?shù)倪\動速度及耐力受到顯著抑制，翻身速度變慢，攝食能力顯著降低（P<0.05）。研究表明，紅耳龜作為一種耐受性較強的淡水龜代表，上升的環(huán)境鹽度可直接影響其受精卵的孵化率、初生幼體的存活率及適合度，對紅耳龜卵孵化和稚龜行為具有顯著的負(fù)面效應(yīng)。由此推斷淡水咸化對其他淡水龜類的影響可能更為嚴(yán)重。

關(guān)鍵詞：紅耳龜；鹽度；孵化；形態(tài)表型；行為特征

中圖分類號：Q142 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? ?文章編號：1674-3075（2023）02-0128-08

淡水咸化是一個復(fù)雜的動態(tài)過程，受氣候變暖、海平面上升、地質(zhì)以及人類活動如農(nóng)業(yè)灌溉、工業(yè)生產(chǎn)、自然資源利用等諸多因素影響，內(nèi)陸淡水和沿海等處的鹽濃度正在持續(xù)增加（Ven?ncio et al，2019）。在全球氣候變暖的過程中，海洋變暖引起的熱膨脹以及冰蓋融化的加速，導(dǎo)致海平面加速上升（Frederikse et al，2020）。聯(lián)合國政府間氣候變化專門委員（IPCC）預(yù)測，至2100年，全球海平面將上升1.0～1.1 m （Levermann et al，2013），由此導(dǎo)致海（咸）水入侵加劇，全球50多個國家和地區(qū)均發(fā)現(xiàn)了海（咸）水入侵現(xiàn)象（Williams，2001）。

河岸、海岸是陸地和水生生態(tài)系統(tǒng)的交錯地帶，受徑流、潮流、鹽水入侵等共同影響，在水體鹽度上升的同時，河岸帶基質(zhì)、土壤中的鹽度也必然升高，且存在積累效應(yīng)，環(huán)境鹽度的升高對生物可產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面效應(yīng)，并影響其生存、繁殖等（Ca?edo-Argüelles et al，2016）。與恐龍同時代的龜類是生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分，在目前已知的約360種現(xiàn)存龜類中，大部分龜類是半水生或水生淡水龜，其中約240種沿著海岸線或河口延伸帶分布。在全球升溫的大環(huán)境下，許多現(xiàn)存的沿海分布龜類物種（約占90%）在某種程度上受到淡水生境鹽水入侵的影響（Agha et al，2018）；淡水鹽化環(huán)境中動物生態(tài)位、種群、生理調(diào)控等方面的研究也得到重視（Ven?ncio et al，2019）。

目前，關(guān)于鹽度對水生動物生命早期的影響研究主要集中在受精卵孵化、胚胎發(fā)育等方面。例如，奧尼羅非魚（Oreochromis niloticus × O.areus）受精卵隨著鹽度的增加，其孵化周期逐漸增加，當(dāng)胚胎破膜并發(fā)育一段時間后，鹽度越高、畸形率越高、死亡個體越多（強俊等，2009）。淡水龜類多沿河岸筑巢產(chǎn)卵，故隨著沿岸基質(zhì)中鹽度的增加，其孵化、幼體發(fā)育及行為等或?qū)⑹艿接绊?。紅耳龜（Trachemys scripta elegans）廣泛分布于世界各地淡水水域中，具有較強的代表性，被廣泛應(yīng)用于科研，如溫度決定性別機制、胚胎發(fā)育、生態(tài)環(huán)境的影響作用等（Koshiba-Takeuchi et al，2009;Weber et al，2020; Ding et al，2021）。本次實驗選取紅耳龜作為研究對象，探究鹽度對紅耳龜卵孵化及稚龜行為的影響，以期揭示淡水咸化對全球淡水龜類繁殖和稚龜行為的影響。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 實驗材料

實驗用紅耳龜受精卵購于海口市鴻旺龜鱉養(yǎng)殖場，所有龜卵均在產(chǎn)下后24 h內(nèi)收集。各組間卵重均值為（10.27±0.134）g，無顯著性差異（P>0.05，n=30）。龜卵從養(yǎng)殖場帶回實驗室，靜置12 h后進(jìn)行形態(tài)學(xué)指標(biāo)測定。隨機各選取30枚受精卵半埋于不同鹽度的孵化基質(zhì)中（由干蛭石分別與不同鹽度的水和淡水以質(zhì)量比1：1 配合而成，濕度為-220 kPa）。利用HEM-3D模型預(yù)測的鹽度變化，當(dāng)海平面上升0.5 m和1.0 m時，平均鹽度增加分別為2和4（Rice et al，2012）。本實驗將鹽度設(shè)定為低、中、高3個濃度組，即鹽度0.5、2.5、5（分別以S0.5、S2.5、S5表示），同時設(shè)置淡水對照組（CK），每組設(shè)置3個平行。將受精卵白斑面朝上，置于孵卵盒（32.5 cm×22.3 cm×10.0 cm）內(nèi)，放置于智能恒溫恒濕孵化箱內(nèi)，根據(jù)紅耳龜正常孵化條件，將溫度設(shè)定為29℃。每天查看一次蛭石濕度和鹽度并進(jìn)行調(diào)節(jié)，待稚龜出殼后開展相關(guān)形態(tài)學(xué)及行為學(xué)實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 ? 孵化率、存活率及畸形率統(tǒng)計 ? 臨近稚龜破殼，每日定時查看龜卵孵化情況，及時將剛破殼的稚龜進(jìn)行編號、拍照。稚龜自行破殼后，記錄其畸形情況，并記錄孵出30 d時稚龜?shù)拇婊盥省?/p>

1.2.2 ? 初生幼體形態(tài)指標(biāo)測量 ? 稚龜?shù)男螒B(tài)學(xué)指標(biāo)均使用精密電子天平（[±]0.1 mg）和電子游標(biāo)卡尺（[±]0.01 cm）進(jìn)行測量。在稚龜孵出的第1、3、7 天進(jìn)行卵黃囊直徑測量，稚龜孵出的第1、3、7、14、30 天進(jìn)行背甲長、背甲寬、腹甲長、腹甲寬及體重的測量。第1天和第3天的稚龜用軟毛刷輕輕刷去卵黃囊表面的蛭石，測量其卵黃囊直徑，測定完畢后放置于原孵化對應(yīng)鹽度的蛭石中。第7天稚龜卵黃囊基本吸收，測量其卵黃囊直徑（腹甲中間縫隙的寬度）后，將卵黃囊完全吸收的稚龜放入相對應(yīng)的鹽度水中。

1.2.3 ? 稚龜?shù)男袨閷W(xué)觀察 ? （1）稚龜翻身能力比較。取孵出7 d的稚龜，置于裝置盒（44.2 cm×37.5 cm×7.4 cm）中，并將其放至有透明玻璃板的29℃恒溫箱內(nèi)。測量之前，先將龜放入恒溫箱中適應(yīng)10 min，將需要測定的龜一次性放入盒中并開始攝像，依次將龜翻轉(zhuǎn)過來后，人迅速離開，每隔3～4 min隔著門上玻璃觀察其是否全都翻身成功。實驗設(shè)置最長翻身時間為10 min。10 min中內(nèi)如若有龜未翻身成功，終止實驗。每只稚龜重復(fù)測量3次。

（2）稚龜攝食能力比較。紅耳龜稚龜?shù)穆腰S可維持機體約1個月的能量供應(yīng)（盛成等，2017），故本研究于稚龜?shù)?8天時開始第1次喂食。各組中分別按照每只稚龜3粒飼料投喂足量的龜鱉養(yǎng)殖專用飼料（主要成分為魚粉、蝦粉等），2～3 h后將水中剩余飼料全部撈出，統(tǒng)計各組的進(jìn)食數(shù)量，計算出攝食率。

（3）稚龜運動能力比較。對孵出30 d的稚龜進(jìn)行運動能力測定。測定前，在其孵出第28天時飽食投喂1次。實驗跑道為長方形水槽（120 cm×40 cm×28 cm），水位5 cm，確保高于龜背甲；跑道底部放一卷尺作為距離參照物，并模擬外界環(huán)境鋪設(shè)一薄層細(xì)沙。在距離稚龜1～2 cm處用毛筆或小木棍使水產(chǎn)生波動，當(dāng)稚龜在水槽內(nèi)游一個來回后，結(jié)束實驗。若稚龜長時間（>5 min）不動，則放棄實驗。通過回放錄像記錄其疾跑速度（稚龜泳過25 cm的最大速度）、停頓次數(shù)（次/min）和最大持續(xù)運動距離（耿軍，2017）。

1.3 ? 數(shù)據(jù)處理

本實驗所有數(shù)據(jù)均使用Office 2010整理。行為實驗錄像通過視頻播放軟件（ACG player）處理，數(shù)據(jù)所用時間精度為0.1 s。所得數(shù)據(jù)采用（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）表示，使用SPSS 20進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。對稚龜?shù)男螒B(tài)學(xué)指標(biāo)和運動能力指標(biāo)進(jìn)行單因素ANOVA LSD和Duncan分析，并進(jìn)行雙變量Pearson相關(guān)性分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 ? 結(jié)果

2.1 ? 鹽度對孵化率和孵化時間的影響

隨著環(huán)境中鹽度的升高，CK、S0.5、S2.5、S5紅耳龜稚龜孵化率（80.00%、83.33%、60.00%、43.33%）基本呈下降趨勢（圖1-A），尤其是S5鹽度組的孵化率顯著降低（P<0.05）；此外，隨著鹽度的進(jìn)一步增加，孵化時間（51、52、54、53 d）略有增加，鹽度進(jìn)一步升高，孵化時間稍有縮短，但與對照組差異并不顯著（圖1-B）。

2.2 ? 環(huán)境鹽度對稚龜存活率的影響

CK、S0.5、S2.5、S5組稚龜在30 d時的存活率為95.83%、95.83%、94.44%、81.80%。由此可見孵化基質(zhì)鹽度及水體鹽度增加了孵出龜?shù)乃劳雎剩▓D2）。

2.3 環(huán)境鹽度對稚龜?shù)挠绊?/p>

2.3.1 ? 稚龜形態(tài)表型 ? 鹽度導(dǎo)致稚龜形態(tài)發(fā)育異常，主要表現(xiàn)在背腹甲畸形、眼球及尾部未發(fā)育或發(fā)育不完整等（圖3）。

隨著孵化基質(zhì)中的鹽度增加，孵出的稚龜形態(tài)異常個體呈上升趨勢，尤其是S5組，異常個體達(dá)到了60%（圖4-A）。在各形態(tài)表型中，以龜甲的畸形率最高，其中S5組龜甲的畸形率高達(dá)100%（圖4-B）。

2.3.2 ? 稚龜體指標(biāo) ? S5組中孵出的稚龜在1、3、7、14、30 d時體重極顯著低于對照組（P<0.01），與環(huán)境中鹽度大小呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）；稚龜腹甲長、背甲長、背甲寬在孵出后1、3、7、14 d時顯著低于對照組（P<0.05），但S0.5和S2.5組中孵出的稚龜體重、背腹甲指標(biāo)等與對照組無顯著差異（P>0.05）；稚龜卵黃囊直徑各組間差異不顯著（表1，圖5）。

2.4 ? 稚龜行為學(xué)觀察

2.4.1 ? 翻身能力 ? 稚龜孵出7 d時，其翻身速度與環(huán)境鹽度呈負(fù)相關(guān)（圖6）。對照組稚龜翻身所需平均時間為71.63 s，較低鹽度組稚龜翻身所需時間雖稍短，但與對照組差異不顯著（P>0.05）；而S5組稚龜翻身所需時間較對照組長，平均為82.5 s。

2.4.2 ? 攝食能力 ? 隨著環(huán)境鹽度的升高，稚龜?shù)臄z食率逐漸降低（圖7），尤其是高鹽度組（S5）稚龜?shù)臄z食率只有47.69%，與對照組相比差異顯著 （P<0.05）。

2.4.3 ? 運動能力 ?在孵出30 d時，稚龜?shù)募才芩俣燃白畲蟪掷m(xù)運動距離與鹽度呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。S0.5和S2.5組的稚龜疾跑速度雖有所下降，但與對照組（7.34±0.72）cm/s相比，差異并不顯著（P>0.05），S5組的稚龜疾跑速度明顯降低（圖8-A），下降約40%，且與對照組有顯著差異（P<0.05）；此外，S5組稚龜運動時的最大持續(xù)距離顯著縮短（圖8-B），由對照組的58.17 cm縮短至39.09 cm。

3 ? 討論

全球氣候變化背景下，淡水咸化對淡水生物的影響越來越受到保護(hù)生物學(xué)家的關(guān)注，尤其是對淡水生物早期生活史階段的影響日益受到重視（Ven?ncio et al，2019）。如高鹽導(dǎo)致了中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）卵中水分流失、卵體積減少，從而抑制胚胎發(fā)育（Wang et al，2019）；鹽度降低了帕達(dá)絢鯰（Ompok pabda）孵化率，幼體的發(fā)育速率下降等（Alam et al，2020）。作為生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分，淡水龜類的生存和繁殖等也面臨著嚴(yán)重威脅和挑戰(zhàn)。

3.1 ? 鹽度顯著影響龜卵孵化及稚龜形態(tài)表型

本研究發(fā)現(xiàn)，孵化基質(zhì)中一定范圍的鹽度對紅耳龜受精卵的孵化率、稚龜存活率和畸形率均產(chǎn)生較大影響，S5組中龜卵的孵化率僅為33.3%，而畸形率高達(dá)60%，由此推測較低的孵化率將顯著影響淡水龜類種群的數(shù)量；同時，鹽度對稚龜出生時體重影響較大，S5鹽度組的稚龜體重極顯著低于對照組（P<0.01），說明孵化環(huán)境中的鹽度可能導(dǎo)致受精卵脫水，盡管孵出了幼體，但稚龜?shù)恼w形態(tài)指標(biāo)明顯弱于淡水對照組，其后續(xù)生存可能會受到一定影響。畸形情況直接影響其適合度，如高鹽度下棘頰雀鯛（Premnas biaculeatus）胚胎出現(xiàn)了畸形，并導(dǎo)致其死亡率增加（王珊珊，2015）。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽度環(huán)境中稚龜形態(tài)表型出現(xiàn)異常，畸形率升高，其中龜甲、尾部、四肢等呈現(xiàn)異常發(fā)育，這些異常表型對于稚龜生存將產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。龜甲起著pH值緩沖和水、脂肪或廢物儲存庫的作用，對于龜類的物理保護(hù)具有環(huán)境適應(yīng)性價值（Gilbert et al，2001）。龜甲缺損可使其物理屏障功能減退，龜甲凹陷或凸起可能會影響其運動能力，龜甲畸形也可能干擾其交配；尾部不能彎曲也會影響其運動能力。由此推測，隨著環(huán)境鹽度的升高，淡水龜類子代將受到顯著影響，如子代數(shù)量減少、存活率及適合度下降等。

3.2 ? 鹽度顯著影響初生幼體的環(huán)境適合度

進(jìn)化生態(tài)學(xué)中常用綜合適合度來反映自然種群的適應(yīng)性和變異性，不同物種的綜合適合度指標(biāo)有所不同，對于淡水龜類來說，翻身行為、運動行為和攝食行為是反映其適合度的常用指標(biāo)（耿軍，2017）。翻身行為是當(dāng)龜類個體腹甲朝上后恢復(fù)至背甲朝上的反應(yīng)，該行為是反映幼龜生存很重要的性能表現(xiàn)特征，其能力大小反映了初生幼體在孵化基質(zhì)中能否迅速恢復(fù)自身最佳的姿勢，以降低被捕食的風(fēng)險（Delmas et al，2007）。對于剛從巢穴中孵化的幼體來說，其在岸邊所面臨的天敵更為廣泛，較強的翻身能力可使其以最快的速度調(diào)整到運動和逃跑狀態(tài)。高鹽度環(huán)境（S5）孵出的稚龜在7 d時，其翻身能力下降，說明鹽度可能增加了新生稚龜被捕食的風(fēng)險。運動能力對爬行動物逃避天敵、提高覓食成功率具有重要的作用，因而與其適應(yīng)性有密切的關(guān)系（潘志崇等，2003）；即便某些表型性狀和生存之間的關(guān)系仍然難以確定，但運動能力在一定程度上反映了個體的適合度，野外環(huán)境下運動能力較強的稚龜，更容易躲避天敵并存活下來（耿軍， 2017）。研究發(fā)現(xiàn)，體重會影響稚龜?shù)倪\動能力，較重新生幼體的運動能力顯著高于低體重個體（杜衛(wèi)國和鄭榮泉， 2004）。本研究中，鹽度較高基質(zhì)中孵化出的稚龜，在30 d時，其運動速度及耐力均受到顯著抑制（P<0.05），這可能與龜在高鹽環(huán)境中由于失水而導(dǎo)致的體重降低有關(guān)。

3.3 ? 稚龜應(yīng)對環(huán)境鹽度的行為策略

在環(huán)境應(yīng)激源的作用下，動物會對自身行為作出功能性調(diào)整，以適應(yīng)環(huán)境的變化（溫安祥和周定剛，2009）。稚龜在鹽度環(huán)境中運動力減弱，作為應(yīng)對高滲環(huán)境的一種選擇性策略，稚龜可能通過減少運動來避免能量的不必要消耗，進(jìn)而將更多能量用于維持體內(nèi)滲透壓的平衡。動物為了維持生命，必須從周圍環(huán)境中不斷攝取食物，但在鹽度環(huán)境中，機體為了避免攝入過多的鹽分，可能通過減少攝食以降低其攝入（Agha et al，2018）。研究發(fā)現(xiàn)，稚龜在高鹽度環(huán)境中攝食量顯著下降，與淡水組相比差異顯著，進(jìn)一步印證了該推斷。但淡水生物生活在鹽度環(huán)境中，為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定所進(jìn)行的滲透壓調(diào)節(jié)過程中，需要消耗大量能量（舒超華等，2012）。在鹽度環(huán)境中龜類攝食量減少，勢必會導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)缺少；若長期生活在鹽度環(huán)境中，機體能量供應(yīng)將嚴(yán)重不足。

3.4 ? 淡水咸化對水生生態(tài)系統(tǒng)的影響

IPCC報告指出，許多陸地、淡水和海洋物種已經(jīng)因氣候變化改變了其生活習(xí)性，以應(yīng)對正在進(jìn)行的氣候變化（IPCC，2021）。雖然有些物種因氣候變化而滅絕，但在過去的數(shù)百萬年里，由于人為干擾導(dǎo)致全球自然氣候變化，加速了生態(tài)系統(tǒng)的重大變化和物種滅絕（Frederikse et al，2020）。淡水生物對水體鹽度升高較為敏感，即使稍微增加也會對生物群落造成很大影響（Ca?edo-Argüelles et al，2016）。水體鹽化將直接導(dǎo)致非耐鹽動物逐漸消失，自然選擇出耐鹽的物種（Agha et al，2018）；但這種負(fù)效應(yīng)通過食物鏈和食物網(wǎng)擴散并放大，最終導(dǎo)致生物多樣性喪失，生態(tài)平衡遭到破壞（趙開拓，2017）。本研究所在對龜類進(jìn)行長達(dá)10多年的研究中發(fā)現(xiàn)，紅耳龜在奪食能力、生態(tài)幅寬度、耐受應(yīng)激環(huán)境等方面要強于其他淡水龜類，是一種耐受性較強的淡水龜（馬凱等，2013；趙龍輝等，2013；裘正元等，2015）；此外，紅耳龜成體和亞成體可通過生理調(diào)控耐受一定范圍的鹽度（Ding et al，2019;Hong et al，2019;Ding et al，2021）。盡管如此，研究依然發(fā)現(xiàn)紅耳龜?shù)脑缙谏钍冯A段對鹽度耐受力極低，其孵化及幼體的行為受到了嚴(yán)重影響，由此不難推斷，淡水咸化對其他淡水龜類的影響或許更為嚴(yán)重。因此，加強淡水咸化對淡水生物影響的研究，將有助于了解全球氣候變化下淡水生態(tài)系統(tǒng)所面臨的威脅，為生物保護(hù)提供理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 ? 萬月華）

Effects of Salinity on Hatching Rate， Morphological Phenotype and

Fitness of Juvenile Trachemys scripta elegans

KONG Yu‐chen， LIANG Fang‐bin， WANG Xiao‐dan， HUANG Peng，

ZHANG Miao‐miao， HONG Mei‐ling， SHI Hai‐tao， DING Li

（Key Laboratory of Tropical Island Ecology， Ministry of Education，

Hainan key Laboratory of Tropical Animal and Plant Ecology， College of Life Sciences，

Hainan Normal University， Haikou ? 571158， P.R. China）

Abstract： Freshwater turtles are an important part of freshwater ecosystems. Global climate change， salinization of freshwater and coastal soil will pose a serious threat and challenge the survival of turtles. However， little is known about the effects of salinity on the early life stage of freshwater turtles. In this research， we studied red-eared turtles （Trachemys scripta elegans）， and explored the effects of salinity on hatching rate， morphological phenotype， and fitness of juvenile T. scripta. elegans， aiming to reveal the effect of freshwater salinization on the reproduction and behavior of juvenile turtles around the world. Three salinity concentration groups （S0.5， S2.5， S5） and a control group （freshwater group， CK） were set in this study， with each trial in triplicate. For the treatments， CK， S0.5， S2.5， S5， the respective hatching rates were 80.00%， 83.33%， 60.00% and 43.33%， and the respective hatching times was 51， 52， 54 and 53 d. As salinity increased， the hatching rate tended to decrease while the hatching time increased. The survival rates of T. scripta elegans decreased gradually and， on day 30， the survival rates for treatments CK， S0.5， S2.5 and S5 were， respectively， 95.83%， 95.83%， 94.44% and 81.80%. The deformity rate of juvenile turtles increased with salinity and， among malformed individuals， carapace deformities accounted for the highest proportion （100% in the S5 treatment group）. In addition， the body weight of turtles in group S5 was significantly lower than that in group CK （P<0.01）， as were the length and width of carapace and plastron （P<0.05）. Further， the sprint speed and maximum duration distance of the turtles on day 30 in group S5 were significantly lower than in group CK. The time to turning over increased， and feeding significantly decreased in the high salinity S5 group. Although the red-eared turtle is a highly tolerant freshwater species， the hatching rate， fitness and survival rate all decreased significantly under saline conditions， and it can be inferred that the effects of freshwater salinization will be more serious on less tolerant freshwater turtles.

Key words： Trachemys scripta elegans; salinity; hatching; morphological phenotypes; fitness characteristics