王凡 劉雪琴 劉飛 冉娜娜 高曉楊 石亞男 朱娜娜 程惠敏 楊瑞

摘要：為了探討三氯生（TCS）對黃河鯉（Cyprinus carpio）幼魚性腺分化的分子機制，采用半靜態(tài)水體暴露法，將體長為7.8～9.9 cm的黃河鯉幼魚暴露于0（對照）、0.04、0.08、0.16 mg/L的三氯生溶液中42 d，利用RT-qPCR技術(shù)檢測黃河鯉性腺發(fā)育分化相關(guān)基因表達(dá)情況。結(jié)果顯示，雄魚精巢中，dax1和sox9a基因在0.04 mg/L和0.08 mg/L TCS處理組中均極顯著上升（P<0.01），0.08 mg/L處理組中sox9b、dmrt1和foxl2基因顯著或極顯著上升（P<0.01，P<0.05，P<0.01），nobox基因在0.04 mg/L和0.16 mg/L TCS處理組顯著和極顯著下降（P<0.05，P<0.01），zp2基因在各TCS處理組顯著或極顯著上升（P<0.05，P<0.01），ar和amh基因在各TCS處理組顯著和極顯著下降（P<0.05，P<0.01）；雌魚卵巢中，sox9b基因在0.04 mg/L和0.08 mg/L TCS處理組均極顯著上升（P<0.01），sox9a和dax1基因在0.04 mg/L TCS處理組顯著和極顯著上升（P<0.05，P<0.01），zp2基因在TCS處理組顯著或極顯著下降（P<0.05，P<0.01），foxl2基因在0.04 mg/L TCS處理組顯著下降（P<0.05），nobox基因在0.16 mg/L TCS處理組顯著下降（P<0.05）。研究表明，TCS影響了黃河鯉幼魚性腺發(fā)育分化相關(guān)基因的表達(dá)，可能進(jìn)一步影響其生殖腺的發(fā)育分化。

關(guān)鍵詞：三氯生；黃河鯉；性腺發(fā)育分化；基因表達(dá)

中圖分類號：Q503 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? ?文章編號：1674-3075（2023）02-0114-06

醫(yī)藥品與個人護(hù)理品（pharmaceuticals and personal care products， PPCPs）是近年來出現(xiàn)的一類新型化學(xué)污染物，該類污染物在自然環(huán)境中的半衰期短、濃度低。然而，由于其被廣泛應(yīng)用，環(huán)境中的PPCPs呈現(xiàn)“持續(xù)存在”狀態(tài)，也常被稱為“虛擬持久性化學(xué)污染物”（趙青青等，2016；葉芃顯等，2018）。三氯生（Triclosan， TCS）作為一種高效廣譜殺菌劑，應(yīng)用于各種護(hù)理用品、清潔用品和醫(yī)藥用品中（Chen et al， 2008），是一種典型PPCPs。已有研究報道，TCS本身具有低毒性和不易降解性，在生活中的大量應(yīng)用使其不可避免地釋放到水環(huán)境中，在污水處理廠的進(jìn)、出水濃度高達(dá)86.2 μg/L、2.7 μg/L，地表水和沉積物中高達(dá)2.3 μg/L和2.7 μg/kg（Zhao et al， 2013）。TCS還具有親脂性且容易被生物體富集，并沿食物鏈進(jìn)行毒性傳遞，也對水生生物的生長和繁殖等多方面產(chǎn)生影響（朱志廣等，2019）。因此，關(guān)于TCS對水生生物的毒性研究已引起廣泛關(guān)注。

TCS能對水生動物能產(chǎn)生急性致死、遺傳、生理、致畸、基因以及內(nèi)分泌干擾等毒性效應(yīng)（鄭欣等，2016；Wang et al， 2018;Wang et al， 2019）。在內(nèi)分泌干擾方面，不同研究者的結(jié)論有所不同，日本青鳉成魚（Ishibashi et al，2004）和食蚊魚（Raut & Angus，2010）的TCS表現(xiàn)為雌激素效應(yīng)；但也研究發(fā)現(xiàn)，TCS對青鳉魚仔魚具有弱的雄性激素作用（Foran et al，2000）；這些研究均表明TCS對魚類的性別分化產(chǎn)生了干擾。

近年來，已經(jīng)監(jiān)測到黃河受到不同程度的TCS污染，從而威脅到黃河水域生態(tài)系統(tǒng)平衡和人類健康（Zhao et al， 2013）。前期研究發(fā)現(xiàn)，TCS對黃河鯉（Cyprinus carpio）產(chǎn)生了雌激素效應(yīng)（Wang et al， 2017；2018），表明TCS對黃河鯉性別分化產(chǎn)生了影響。黃河鯉中的許多基因與性別分化有關(guān)，如ar、amh、dax1、 dmrt1、sox9a、sox9b基因參與精巢分化發(fā)育，cyp19a、 cyp19b、 foxl2、nobox、zp2基因參與卵巢分化發(fā)育（賈永芳等，2016）。為了進(jìn)一步揭示TCS對黃河鯉雌激素的效應(yīng)機制，本研究利用PCR技術(shù)測定不同濃度TCS對黃河鯉幼魚性腺發(fā)育分化相關(guān)基因的表達(dá)，以期探討TCS對黃河鯉性腺分化發(fā)育影響的分子機制，同時也為環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)制定和生態(tài)健康評價提供參考依據(jù)。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 實驗材料

實驗用黃河鯉取自河南省黃河鯉良種場，體長7.8～9.9 cm，暴露實驗前將其放入60 L去氯自來水的水族箱中，暫養(yǎng)7 d；挑選健康活潑、個體均勻且生長狀況良好的黃河鯉進(jìn)行正式實驗。

1.2 ? 實驗設(shè)計

根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果得出黃河鯉幼魚96 h LC50為0.8 mg/L，在此基礎(chǔ)上，參考污水處理廠進(jìn)水口TCS的最高濃度，然后按照96 h LC50的1/20、1/10和1/5（即0.04、0.08、0.16 mg/L）設(shè)置了3個TCS處理組和1個對照組（0 mg/L）共4個實驗組。每個實驗組隨機投放暫養(yǎng)后的黃河鯉幼魚，在裝有20 L TCS處理液的玻璃水族箱中進(jìn)行暴露實驗。設(shè)置實驗水溫為（16±3）℃，并保持水族箱持續(xù)增氧。每天定時定點投喂并及時處理殘餌和糞便，為使TCS濃度基本保持不變，每24 h更換50% TCS處理液，暴露時間為42 d。實驗期間，采用高效液相色譜儀檢測各實驗組的TCS，TCS保持在設(shè)定濃度的80%～110%，檢測方法參考Wang等（2017）。暴露實驗結(jié)束后，解剖鑒別雌雄，每個實驗組選取5個卵巢和5個精巢共計10個性腺樣本，保存于-80℃冰箱備用。

利用總RNA極速抽提試劑盒（上海飛捷生物技術(shù)有限公司）提取黃河鯉性腺RNA，將樣品用凝膠成像分析儀觀察并分析，同時用超微量分光光度計進(jìn)行吸光度測定。結(jié)果顯示，28S亮度和寬度是18S的2倍左右，且OD260/OD280在1.8～2.1，濃度適中，說明提取的RNA樣品質(zhì)量較好，都可用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。隨后采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（東洋紡生物科技有限公司），依照說明書配制20 μL反應(yīng)體系，混勻后放入PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，條件為37℃、15 min，98℃、5 min，4℃、5 s，得到的cDNA分裝保存在-20℃冰箱中。

1.4 ? 實時熒光定量PCR反應(yīng)

查閱相關(guān)文獻(xiàn)得到amh、dax1、dmrt1、foxl2、nobox、sox9a、sox9b、ar、zp2、β-actin（內(nèi)參）基因的引物序列（盧月嬌等，2009；賈永芳等，2016），用于實時熒光定量PCR擴增。引物由華大基因合成（表1）。

采用Bestar SybrGreen qPCR mastermix試劑盒（德國DBI生物科技有限公司），將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA配制成20 μL反應(yīng)體系，實時熒光定量PCR。反應(yīng)程序為95℃、2 min，95℃、10 s，55℃、30 s，72℃、30 s，共計40個循環(huán)；融解曲線為95℃、1 min，55℃、1 min，55～98℃（10 s/cycle， 0.5℃/cycle）86個循環(huán)。

1.5 ? 數(shù)據(jù)分析

實時熒光定量PCR反應(yīng)得到的數(shù)據(jù)通過2-ΔΔt法進(jìn)行處理，結(jié)果用（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示；采用SPSS對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，然后用LSD法進(jìn)行多重比較，分析對照組和處理組之間的差異。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? 黃河鯉雌魚性別分化基因表達(dá)

amh、dax1、dmrt1、sox9a和sox9b基因是與雄性化相關(guān)的基因，其在不同TCS雌魚實驗組的表達(dá)如圖1所示（n=5）。與對照組相比，amh基因在0.04 mg/L和0.16 mg/L TCS處理組表達(dá)水平呈下降趨勢，在濃度0.08 mg/L表達(dá)水平呈上升勢，但整體變化不顯著（P>0.05）。dax1基因在不同TCS處理組中的表達(dá)水平出現(xiàn)了下降趨勢，且在0.04 mg/L處理組極顯著下降（P<0.01），下降了73.6%。dmrt1基因在不同TCS處理組中的表達(dá)水平呈下降趨勢，但整體變化不顯著（P>0.05）。sox9a基因在0.04 mg/L和0.08 mg/L處理組表達(dá)水平呈上升趨勢，且0.04 mg/L處理組顯著上升了5.0倍（P<0.05），而在0.16 mg/L濃度組表達(dá)水平呈下降趨勢。sox9b基因在不同TCS處理組中的表達(dá)水平呈上升趨勢，且0.04 mg/L和0.08 mg/L處理組顯著（P<0.05）上升了5.9倍和6.8倍。

foxl2、nobox和zp2是與雌性性別分化相關(guān)的基因，其在不同TCS雌魚實驗組中的表達(dá)如圖2所示（n=5）。與對照組相比，foxl2基因在0.04 mg/L和0.08 mg/L TCS處理組的表達(dá)水平呈下降趨勢，且在0.04 mg/L濃度組顯著下降（P<0.05），下降了61.4%；而在0.16 mg/L處理組的表達(dá)水平呈上升趨勢。nobox基因在不同TCS處理組中的表達(dá)水平整體呈下降趨勢，且在0.16 mg/L濃度組顯著下降（P<0.05），下降了36.2%。zp2基因在不同TCS處理組中表達(dá)水平整體呈下降趨勢，在0.16 mg/L處理組顯著下降（P<0.05），下降了47.5%；且在0.04 mg/L和0.08 mg/L處理組的表達(dá)水平呈極顯著下降（P<0.01），分別下降了69.1%和62.5%。

2.2 ? 黃河鯉雄魚性別分化基因表達(dá)

雄性化相關(guān)基因在不同TCS雄魚實驗組的表達(dá)如圖3所示（n=5）。與對照組相比，amh基因在不同TCS處理組中的表達(dá)水平極顯著下降（P<0.01），在0.04 mg/L處理組下降了75.0%，在0.08 mg/L和0.16 mg/L處理組分別下降59.6%和89.5%。dax1基因在不同TCS處理組中的表達(dá)水平出現(xiàn)了上升趨勢，且在0.04 mg/L和0.08 mg/L處理組中極顯著上升（P<0.01），分別上升了2.9倍和5.9倍。dmrt1基因在0.04 mg/L和0.08 mg/L處理組表達(dá)水平呈上升趨勢，且在0.08 mg/L處理組顯著上升（P<0.05），上升了4.9倍；而在0.16 mg/L處理組表達(dá)水平呈下降趨勢。sox9a和sox9b在不同TCS處理組中的表達(dá)水平呈上升趨勢，sox9a在0.04 mg/L和0.08 mg/L處理組極顯著上升（P<0.01），分別上升了8.2倍和17.9倍；sox9b在0.08 mg/L處理組呈極顯著上升（P<0.01），上升了6.9倍。ar基因在不同TCS處理組中的表達(dá)水平出現(xiàn)下降趨勢，在0.04 mg/L和0.08 mg/L處理組顯著下降（P<0.05），下降69.0%和53.7%；而在0.16 mg/L處理組極顯著下降（P<0.01），下降了92.7%。

雌性化相關(guān)基因在不同TCS雄魚實驗組中的表達(dá)情況如圖4所示（n=5）。與對照組相比，nobox基因在不同TCS處理組中表達(dá)水平整體呈下降趨勢，且在0.04 mg/L和0.16 mg/L處理組顯著下降（P<0.05，P<0.01），分別下降了74.7%和83.6%。foxl2基因在不同TCS處理組中表達(dá)水平整體呈上升趨勢，且在0.08 mg/L處理組極顯著上升（P<0.01），上升了10.8倍。zp2基因在不同TCS處理組中的表達(dá)水平出現(xiàn)了上升趨勢，且在0.04 mg/L和0.16 mg/L處理組顯著上升（P<0.05），分別上升了5.3倍和5.5倍；而在0.08 mg/L處理組極顯著上升（P<0.01），上升了15.6倍。

3 ? 討論

魚類的性別發(fā)育以遺傳因素為基礎(chǔ)，同時容易受外界環(huán)境（溫度、鹽度、氧氣、環(huán)境污染物等）和自身內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的影響（盧月嬌等，2009）。因此，魚類的性別分化機制比較復(fù)雜。本次研究發(fā)現(xiàn)，TCS這種新型環(huán)境污染物影響了黃河鯉幼魚性腺性別分化相關(guān)基因的表達(dá)，但并沒表現(xiàn)出劑量-效應(yīng)反應(yīng)，可能與這種化合物本身的特性有關(guān)。Ishibashi等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，20 μg/L和100 μg/L的TCS對日本青鳉產(chǎn)生了顯著的雌激素效應(yīng)，而200 μg/L無顯著影響；作者前期研究也發(fā)現(xiàn)，TCS對黃河鯉生殖軸相關(guān)基因的表達(dá)影響也沒表現(xiàn)出劑量-效應(yīng)反應(yīng)（Wang et al， 2017;2018），與本次研究結(jié)果類似。

3.1 ? TCS對黃河鯉幼魚雄性化相關(guān)基因表達(dá)機制

amh、dax1、dmrt1、sox9a、sox9b和ar基因與雄性性別分化有關(guān)。在雄性性腺分化期，amh基因可抑制繆勒氏管的形成，阻止卵巢發(fā)育，使中腎管發(fā)育為精巢，主要在雄性幼魚中表達(dá)（龍雯晴和王偉民，2001）。哺乳類的dax1基因可抑制睪丸發(fā)育（王麗云等，2006）；其在80 d黃河鯉中的表達(dá)，雄性高于雌性（賈永芳等，2016）。dmrt1基因是一種下游性別決定基因，其在精巢中的表達(dá)量高于卵巢，參與了精巢功能維持（曹謹(jǐn)玲等，2011）。本研究發(fā)現(xiàn)，TCS對雌魚amh基因表達(dá)無顯著影響，而使雄魚表達(dá)量極顯著下降；dax1基因在低濃度TCS處理組雌魚中的表達(dá)量極顯著下降，而在低、中濃度組雄魚中極顯著上升；dmrt1基因在雌魚中無顯著影響，雄魚dmrt1基因在中濃度TCS處理組顯著上升。這表明TCS影響黃河鯉卵巢的發(fā)育過程是通過抑制dax1基因表達(dá)來促進(jìn)了卵巢的發(fā)育；而TCS影響黃河鯉精巢的發(fā)育過程是通過抑制amh基因表達(dá)來抑制精巢的發(fā)育，dmrt1和dax1表達(dá)升高可能與機體的反饋調(diào)節(jié)或其他因子的調(diào)節(jié)有關(guān)。這一結(jié)果也證實了項目組前期實驗TCS對黃河鯉的雌激素效應(yīng)這一結(jié)論（Wang et al， 2017；2018）。

sox9a和sox9b基因是與哺乳動物性別分化形成有關(guān)的重要基因，并與性別調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的因子相互作用，維持睪丸發(fā)育（廖冰等，2008）。有研究報道了青鳉的早期性別分化與sox9基因無關(guān)，而與后期的精巢發(fā)育有關(guān)（Nakamoto et al， 2005）。本研究中，雌魚sox9a基因在低TCS濃度組顯著上升，sox9b在低、中 濃度TCS處理組顯著上調(diào)；雄魚sox9a基因在低、中濃度TCS處理組中極顯著上升，sox9b在中濃度TCS處理組極顯著上升。表明TCS不僅通過影響sox9基因的表達(dá)來干擾黃河鯉的精巢發(fā)育分化，同時也影響了卵巢的發(fā)育分化，其具體機制還有待進(jìn)一步探討。ar基因是一種核受體超家族中的雄激素受體，屬于配體依賴型轉(zhuǎn)錄因子，是雄激素發(fā)揮作用的介導(dǎo)者，在生物體內(nèi)有著不可或缺的作用（黃寶鋒，2008）。本研究中，雄魚ar基因在TCS處理組顯著下降，說明TCS可能通過影響雄激素受體來對雄性黃河鯉產(chǎn)生雌性生殖內(nèi)分泌干擾。Filby等（2007）研究也發(fā)現(xiàn)，17α-乙炔基雌二醇能夠顯著降低黑頭呆魚精巢中ar基因的表達(dá)水平，從而抑制雄激素-受體復(fù)合物，引起雌激素效應(yīng)。

3.2 ? TCS對黃河鯉幼魚雌性化相關(guān)基因表達(dá)機制

foxl2、nobox、zp2基因與雌性性別分化相關(guān)。foxl2基因主要在垂體和卵巢中表達(dá)，是脊椎動物卵巢決定和分化的一個標(biāo)志性啟動基因（賈永芳等，2016）， foxl2對Sox9基因有抑制作用，進(jìn)而抑制精巢分化（Nef & Vassalli， 2009）。zp2基因在雌性體內(nèi)特異性表達(dá)，其編碼蛋白在卵細(xì)胞運輸中起支持及保護(hù)作用（鄭堯等，2016）。nobox基因在生殖細(xì)胞中特異性表達(dá)，是有關(guān)早期卵子發(fā)生的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（符梅等，2014）。本研究中，雌魚foxl2基因在低TCS濃度組顯著下降，zp2基因在各TCS處理組顯著下降，nobox基因在高濃度TCS處理組顯著下降，其原因可能由于TCS導(dǎo)致的sox9基因表達(dá)升高，然后又反饋抑制foxl2基因的表達(dá)所致；雄魚foxl2基因在中濃度TCS組顯著升高，zp2基因在各濃度TCS組顯著升高，項目組前期研究還發(fā)現(xiàn)，TCS使雄魚精巢cyp19a顯著升高（Wang et al， 2018），這些研究結(jié)果進(jìn)一步表明了TCS對雄性黃河鯉產(chǎn)生了雌激素效應(yīng)。Yang等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，雙酚F暴露抑制性別分化期斑馬魚的amh基因表達(dá)，誘導(dǎo)foxl2的表達(dá)，導(dǎo)致cyp19a1a表達(dá)增加，促進(jìn)了雌激素產(chǎn)生。該研究結(jié)果與本研究及項目組的前期研究結(jié)果一致。

綜上，TCS對黃河鯉的生殖腺發(fā)育分化相關(guān)基因產(chǎn)生一定影響。對于雌性黃河鯉，主要是通過抑制卵巢dax1基因表達(dá)來促進(jìn)其發(fā)育；對于雄性黃河鯉，主要是通過抑制精巢amh和ar基因表達(dá)，誘導(dǎo)foxl2和zp2基因表達(dá)對精巢發(fā)育產(chǎn)生干擾，致使產(chǎn)生雌激素效應(yīng)。由于性別分化及決定基因較多，且性腺分化發(fā)育受到的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)異常復(fù)雜。因此，TCS引起生殖內(nèi)分泌紊亂的詳細(xì)分子機制還有待進(jìn)一步探究，以準(zhǔn)確評估TCS所帶來的水生態(tài)環(huán)境風(fēng)險。

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（責(zé)任編輯 ? 萬月華）

Effects of Triclosan on Gene Expression Related to Gonadal Development and

Differentiation in Juvenile Yellow River Carp （Cyprinus carpio）

WANG Fan， LIU Xue‐qin， LIU Fei， RAN Na‐na， GAO Xiao‐yang，

SHI Ya‐nan， ZHU Na‐na， CHENG Hui‐min， YANG Rui

（Luoyang Normal University， Luoyang ? 471934， P. R. China）

Abstract：In recent years， monitoring has shown varying levels of triclosan （TCS） pollution in the Yellow River， high enough to threaten the aquatic ecosystem and human health along the Yellow River. Previous research has shown that TCS exposure affects the sexual differentiation of Yellow River carp （Cyprinus carpio）. In this study， we investigated gene expression related to gonadal development and differentiation in C. carpio using a semi-static water contamination method and RT-PCR， and the effect of TCS on the molecular mechanism of gonadal differentiation of juvenile Yellow River carp was analyzed. The study aimed to provide a reference for determining environmental standards and evaluating ecological health. Healthy C. carpio of body length 7.8-9.9 cm were acclimated for 7 d in aquaria， and then exposed to four TCS concentrations （0， 0.04， 0.08， and 0.16 mg/L） for 42 days. Half of the solution was changed every 24 hours. Then the expression levels were determined for the genes amh， dax1， dmrt1， foxl2， nobox， sox9a， sox9b， ar， zp2 and β-actin in C. carpio gonads by RT-PCR. Results were as follows： （1） In the sperm of male juveniles， expression of the genes dax1 and sox9a increased significantly in the 0.04 and 0.08 mg/L TCS treatments （P<0.01）; the expression of the genes sox9b， dmrt1 and foxl2 increased significantly in the 0.08 mg/L TCS group （P<0.01， P<0.05， P<0.01）; nobox gene expression significantly decreased in the 0.04 and 0.16 mg/L TCS groups （P<0.05， P<0.01）; zp2 gene expression significantly increased， and ar and amh gene expression significantly decreased in all TCS groups （P<0.05， P<0.01）. （2） In the ovaries of female juveniles， sox9b gene expression significantly increased in the 0.04 and 0.08 mg/L TCS groups （P<0.01）; sox9a and dax1 gene expression significantly increased （P<0.05，P<0.01） and foxl2 gene expression significantly decreased in the 0.04 mg/L TCS group （P<0.05）; nobox gene expression decreased significantly in the 0.16 mg/L TCS group （P<0.05）; and zp2 gene expression decreased significantly in all the TCS groups （P<0.05， P<0.01）. TCS has a significant effect on the expression of genes related to gonadal development and differentiation in C. carpio， which could then further affect sexual development and differentiation.

Key words：triclosan; Yellow River carp; gonadal development and differentiation; gene expression