譚勝連 周從鷹 張旭途 劉佳

摘要：目的 對注射用頭孢呋辛鈉中4個未公開報道的降解雜質(zhì)進(jìn)行研究，并推導(dǎo)其化合物結(jié)構(gòu)。方法 采用YMC C8色譜柱（4.6 mm×50 mm， 3 μm）；以0.005 mol/L醋酸銨溶液-乙腈為流動相梯度洗脫，流速0.5 mL/min。離子源：電噴霧離子（ESI）源。結(jié)果 注射用頭孢呋辛鈉中4個未知雜質(zhì)得到有效分離，使用Q EXACTIVE高分辨質(zhì)譜確定了雜質(zhì)的分子量，并依據(jù)頭孢類化合物的裂解及降解理論推測出其結(jié)構(gòu)與形成機理，與頭孢類已知雜質(zhì)相異，雜質(zhì)Ⅳ為本品特有的氨降解雜質(zhì)。結(jié)論 本方法操作簡便，靈敏度高，可用于評價注射用頭孢呋辛鈉中的未知雜質(zhì)，同時，研究結(jié)果為注射用頭孢呋辛鈉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂和質(zhì)量控制提供了重要的參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：LC-MS/MS；頭孢呋辛；降解雜質(zhì)

中圖分類號：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Abstract Objective Research of four degradation impurities in cefuroxime sodium for injection which have not been reported publicly， and speculate their structures. Methods Chromatographic separation was performed on a YMC C8 column （4.6 mm×50 mm， 3 μm）. The mobile phase consisted of 0.005 mol/L ammonium acetate solution-acetonitrile with the linear gradient elution at a flow rate of 0.5 mL/min. The detection was ESI in the positive mode. Results Four unknown products were effectively separated. The molecular weight of the impurities were exactly determined by Q EXACTIVE HRMS. The structures and the generation mechanism of the four products were preliminarily confirmed according to the cracking and degradation theory of cephalosporins. Unlike normal impurities in cephalosporin， impurity IV is the special ammonia degradation impurity of this product. Conclusion The established LC-MS/MS method is simple and sensitive， and can be used to evaluate unknown impurities in cefuroxime sodium for injection. At the same time， the research results provide an important reference for the quality standards and quality control of cefuroxime sodium for injection.

Key words LC-MS/MS; Cefuroxime; Degradation impurities

我國為藥品生產(chǎn)與使用大國，藥品的質(zhì)量及安全情況不僅是監(jiān)管機構(gòu)和藥企的重點關(guān)注領(lǐng)域，也是人民群眾普遍關(guān)心的熱點問題。藥品質(zhì)量的優(yōu)劣與臨床用藥的不良反應(yīng)息息相關(guān)，而對藥品中雜質(zhì)的控制更是保證藥品質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

頭孢呋辛鈉由英國葛蘭素公司研發(fā)，屬于第二代半合成頭孢菌素抗生素，在體外具有出色的活性，對腸桿菌β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性增強，并且具有良好的藥動學(xué)特性，可用于對頭孢呋辛敏感的細(xì)菌引起的呼吸道感染、耳鼻喉科感染、泌尿道感染、皮膚和軟組織感染等，且可用于術(shù)前或術(shù)中防止敏感致病菌的生長，減少術(shù)中及術(shù)后因污染引起的感染[1-2]?，F(xiàn)階段，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS）在藥物的雜質(zhì)研究中已得到廣泛的應(yīng)用，尤其是多級質(zhì)譜和高分辨質(zhì)譜更是近年研究的熱點技術(shù)。研究通過質(zhì)譜信息確定化合物的分子量進(jìn)而推測出其可能的分子結(jié)構(gòu)[3-4]。在質(zhì)譜裂解規(guī)律分析中，β-內(nèi)酰胺類抗生素共有的裂解反應(yīng)是β-內(nèi)酰胺環(huán)開裂，3位碳上的側(cè)鏈斷裂等[5]。

目前，對注射用頭孢呋辛鈉的雜質(zhì)研究大多集中在現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的已知雜質(zhì)或頭孢菌素的常見降解雜質(zhì)，而對其他降解雜質(zhì)的研究筆者則未見報道。在注射用頭孢呋辛鈉一致性評價過程中發(fā)現(xiàn)4個未知降解雜質(zhì)，本文分別對其命名為雜質(zhì)I、雜質(zhì)Ⅱ、雜質(zhì)Ⅲ和雜質(zhì)Ⅳ。4個雜質(zhì)在參比制劑及自研產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究過程中略有增長。本研究通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法對葛蘭素公司及本廠的注射用頭孢呋辛鈉中4個未知降解雜質(zhì)進(jìn)行分析，并對其結(jié)構(gòu)及生成機理進(jìn)行推導(dǎo)。旨在為注射用頭孢呋辛鈉產(chǎn)品中的雜質(zhì)控制及質(zhì)量研究提供參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 藥品與試劑

注射用頭孢呋辛鈉（規(guī)格0.25 g，批號2G9F）購自Glaso UK公司；注射用頭孢呋辛鈉（規(guī)格1.5 g，批號190002）來自廣州白云山天心制藥股份有限公司。色譜級乙腈購自美國Tedia公司；分析級冰醋酸購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；分析級醋酸鈉、醋酸銨和磷酸購自廣州化學(xué)試劑廠；超純水由Millipore純水儀制備。

1.2 儀器

Q EXACTIVE型四極桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜儀（美國ThermoFisher Scientific公司）；UltiMate 3000 UHPLC液相色譜儀（美國ThermoFisher Scientific公司），包括UltiMate 3000泵、UltiMate 3000二極管陣列檢測器、UltiMate 3000自動進(jìn)樣器；工作站：Thermo Xcalibur Qual Browser；分析天平AB-135S（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 LC-MS/MS系統(tǒng)條件

色譜柱：YMC C8（4.6 mm×50 mm， 3 μm）；檢測波長：273 nm；柱溫：30℃；流速：0.5 mL/min ；進(jìn)樣量：20 μL；流動相A：0.005 mol/L醋酸銨鹽緩沖液（取0.38 g醋酸銨，加水溶解并稀釋成1000 mL，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至3.4）；流動相B：乙腈，按表1梯度洗脫。

質(zhì)譜條件：離子化方式ESI（+），ddMS2；一級分辨率70000；二級分辨率17500；數(shù)據(jù)采集范圍 120～1800 m/z；噴霧電壓：3.8 kV；噴霧溫度280℃，離子傳輸管溫度320℃，鞘氣壓力60 arb；輔助氣壓力10 arb；S-lens RF level：50；二級碰撞能量：nce 15 40 60。

1.3.2 供試品溶液的配制

取注射用頭孢呋辛鈉適量，加水溶解并稀釋制成0.5 mg/mL的溶液。

2 結(jié)果

2.1 兩廠家的雜質(zhì)譜對比

參比制劑與自研制劑的雜質(zhì)個數(shù)均為11個，自研制劑的各未知雜質(zhì)的含量均小于0.1%，參比制劑雜質(zhì)量稍高，其中雜質(zhì)I接近0.15%，色譜圖見圖1。在一致性評價過程中，雜質(zhì)I、雜質(zhì)Ⅱ、雜質(zhì)Ⅲ和雜質(zhì)Ⅳ為未知降解產(chǎn)物，在留樣過程中有增加趨勢，需進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.2 雜質(zhì)I、雜質(zhì)Ⅱ、雜質(zhì)Ⅲ和雜質(zhì)Ⅳ的結(jié)構(gòu)推測

2.2.1 雜質(zhì)I的結(jié)構(gòu)推測

參考《中國藥典》青霉素鈉雜質(zhì)D結(jié)構(gòu)及文獻(xiàn)資料[6-9]。推測其為頭孢呋辛去氨基甲酰基異構(gòu)化后形成的雜質(zhì)，見圖2。m/z 382為[M+H]+離子峰，m/z 338、m/z 320、m/z 124、m/z 112、m/z 94均為二級離子峰，見圖3～4。

2.2.2 雜質(zhì)Ⅱ的結(jié)構(gòu)推測

參考《美國藥典》頭孢地尼雜質(zhì)b結(jié)構(gòu)及頭孢唑林雜質(zhì)b結(jié)構(gòu)，頭孢類易形成雙羥基結(jié)構(gòu)的降解產(chǎn)物[10-15]。根據(jù)一級質(zhì)譜的碎片離子峰推測，m/z 267為[M1+K]+離子峰，m/z 249為[M2+K]+離子峰，m/z 211為[M2+H]+離子峰。m/z 124和m/z 94均為m/z 211的二級離子峰。推測雜質(zhì)Ⅱ為M1與M2。為水合醛與醛的互變體。見圖5～7。M1的雜質(zhì)量較低未能獲取二級質(zhì)譜。

2.2.3 雜質(zhì)Ⅲ的結(jié)構(gòu)推測

根據(jù)雜質(zhì)Ⅲ的一級質(zhì)譜m/z 364為[M+H]+離子峰， m/z 336、m/z 318、m/z 211、m/z 179、m/z 165、m/z 137、m/z 124、m/z 94均為二級離子峰。雜質(zhì)Ⅲ與雜質(zhì)I的分子量相差18，推測雜質(zhì)Ⅲ為雜質(zhì)I的內(nèi)酯。見圖8～10。

2.2.4 雜質(zhì)Ⅳ的結(jié)構(gòu)推測

根據(jù)雜質(zhì)Ⅳ的一級質(zhì)譜m/z 419為[M+K]+離子峰，m/z 381為[M+H]+離子峰，m/z 364、m/z 239、m/z 193、m/z 149、m/z 94均為二級離子峰。結(jié)合頭孢呋辛雜質(zhì)降解規(guī)律，推測其為去氨甲酰頭孢呋辛的酰胺化物，見圖11～13。

2.2.5 測定結(jié)果

高分辨質(zhì)譜所測定的4個雜質(zhì)的質(zhì)荷比與推測結(jié)構(gòu)的質(zhì)荷比理論值相當(dāng)，見表2。

2.3 雜質(zhì)的形成機理推測

頭孢呋辛（圖14）雜質(zhì)I、雜質(zhì)Ⅱ、雜質(zhì)Ⅲ和雜質(zhì)Ⅳ的形成機理見圖15。

參考青霉素鈉雜質(zhì)D的形成機理[16]，頭孢呋辛的β-內(nèi)酰胺環(huán)水解開環(huán)，5位N對質(zhì)子化的酰胺羰基（16位C）進(jìn)行親核取代，成五元環(huán)，所得的醇胺脫水形成雜質(zhì)I。雜質(zhì)I脫水，成五元環(huán)內(nèi)酯，形成雜質(zhì)Ⅲ。

頭孢呋辛的β-內(nèi)酰胺環(huán)水解開環(huán)，脫羧，6位鍵水解斷裂，形成雜質(zhì)Ⅱ（M1/M2）。M1與M2為水合醛與醛的互變體。

頭孢呋辛9位C上的氨基甲酸酯水解，形成氨基甲酸，氨基甲酸不穩(wěn)定，進(jìn)一步分解為氨，氨與頭孢呋辛鈉中的雜質(zhì)頭孢呋辛內(nèi)酯發(fā)生氨解反應(yīng)，形成雜質(zhì)Ⅳ。

3 討論

《中國藥典》2020年版和《英國藥典》2021年版中注射用頭孢呋辛鈉項下均收載有關(guān)物質(zhì)測定方法，流動相同為醋酸鈉-冰醋酸緩沖體系。與《英國藥典》等度洗脫相比，《中國藥典》的梯度洗脫法能檢出更多雜質(zhì)。然而，含有不揮發(fā)性鹽的流動相嚴(yán)格限制其與質(zhì)譜的聯(lián)用，需對流動相進(jìn)行調(diào)整，以可揮發(fā)的醋酸銨替代醋酸鈉。

近年來，采用二維色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行雜質(zhì)研究的技術(shù)已被廣泛應(yīng)用[17]。其原理是在含不揮發(fā)性鹽流動相的一維色譜上收集特定時段的餾分（雜質(zhì)峰），經(jīng)閥切換技術(shù)導(dǎo)入第二維色譜脫鹽處理，把含不揮發(fā)性鹽的流動相置換成適合質(zhì)譜使用的流動相并與質(zhì)譜聯(lián)用。該方法優(yōu)勢明顯，但背后仍存在限制。如，面對多組分樣品，難以一次連貫分析所有成分，畢竟閥切換及二維洗脫需要時間。而洗脫時間的增加會導(dǎo)致一些含量少，穩(wěn)定性差的雜質(zhì)發(fā)生降解，靈敏度下降。故本研究采用傳統(tǒng)方法對注射用頭孢呋辛鈉的雜質(zhì)進(jìn)行研究。即參考《中國藥典》方法并優(yōu)化使其兼容質(zhì)譜，聯(lián)合雜質(zhì)峰的洗脫順序及雜質(zhì)量總體分析。

根據(jù)EMA的Guideline on setting specifications for related impurities in antibiotics （EMA/CHMP/CVMP/ QWP/199250/2009），半合成抗生素制劑的鑒定限為0.20%。研究注射用頭孢呋辛鈉在穩(wěn)定性放置過程中的變化，發(fā)現(xiàn)4個未知降解雜質(zhì)均有增加趨勢，為完善注射用頭孢呋辛鈉的評價，對其進(jìn)行探索性研究。本文所述的LC-MS/MS分析方法操作簡便，能有效鑒定含量約0.01%～0.1%的未知雜質(zhì)，滿足研究需求。

4 結(jié)論

本研究通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對注射用頭孢呋辛鈉中4個未知降解雜質(zhì)進(jìn)行分析，推導(dǎo)其結(jié)構(gòu)及生成機理，可為注射用頭孢呋辛鈉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂和質(zhì)量控制提供一定的借鑒意義。

參 考 文 獻(xiàn)

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作者簡介：譚勝連，男，生于1964年，碩士，高級工程師，主要從事化學(xué)藥開發(fā)工作，E-mail： TSL801@163.com