朱慧 徐建 郭少晨 陳曦 陸宇

摘要：研發(fā)新型抗結(jié)核藥物極具挑戰(zhàn)性，難度大，周期長(zhǎng)，非臨床研究的數(shù)據(jù)是開展臨床試驗(yàn)的前提。全面充分的結(jié)核分枝桿菌體外和在動(dòng)物體內(nèi)的藥效學(xué)評(píng)價(jià)是臨床試驗(yàn)前的重要步驟和關(guān)鍵內(nèi)容。本技術(shù)指南主要適用于治療由結(jié)核分枝桿菌引起的肺結(jié)核病藥物的研發(fā)，旨在為創(chuàng)新抗結(jié)核藥物的臨床前藥效學(xué)研究提供參考。

關(guān)鍵詞：抗結(jié)核藥物；藥效學(xué)；技術(shù)指南

中圖分類號(hào)：R978.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Abstract? ? The development of new anti-tuberculosis drugs is extremely challenging， difficult and time-consuming. Non-clinical research data is the basis for conducting clinical trials. Comprehensive and adequate pharmacodynamic evaluation of Mycobacterium tuberculosis in vitro and in animals is an important step and key content before clinical trials. This technical essentials are mainly applicable to the research and development of drugs for the treatment of pulmonary tuberculosis caused by Mycobacterium tuberculosis， and aims to provide a reference for the preclinical pharmacodynamic research of innovative anti-tuberculosis drugs.

Key words? ? Antituberculosis agents; Pharmacodynamic; Technical guidelines

肺結(jié)核病的傳染源是結(jié)核分枝桿菌，據(jù)WHO估算，全球有接近20億的結(jié)核潛伏感染人群。多藥組合的化學(xué)治療是人類控制結(jié)核病的主要手段，抗結(jié)核治療需要新作用機(jī)制的藥物和有效的聯(lián)合治療方案。隨著耐多藥結(jié)核?。╩ultidrug-resistant tuberculosis， MDR-TB），廣泛耐藥結(jié)核?。╡xtensively drug-resistant tuberculosis， XDR-TB）的日益增多，有效的新藥及新方案亟待研發(fā)。研發(fā)新型抗結(jié)核藥物極具挑戰(zhàn)性，難度大，周期長(zhǎng)。臨床試驗(yàn)開始前應(yīng)進(jìn)行非臨床研究，全面充分的結(jié)核分枝桿菌體外和在動(dòng)物體內(nèi)的藥效學(xué)評(píng)價(jià)是臨床試驗(yàn)前的重要步驟和關(guān)鍵內(nèi)容。目前國(guó)際上還沒(méi)有統(tǒng)一的抗結(jié)核新藥的藥效學(xué)評(píng)價(jià)方法和標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)尚缺乏系統(tǒng)、科學(xué)、規(guī)范的藥效評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則。隨著我國(guó)抗結(jié)核新藥研發(fā)的不斷增加以及抗結(jié)核藥物藥效學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)的不斷成熟和完善，為我國(guó)抗結(jié)核新藥研發(fā)臨床前藥效學(xué)研究提供更加精準(zhǔn)的技術(shù)指導(dǎo)，解決藥效學(xué)評(píng)價(jià)中的重點(diǎn)問(wèn)題，保證數(shù)據(jù)完整性，中國(guó)藥理學(xué)會(huì)化療藥理專業(yè)委員會(huì)和首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院組織國(guó)內(nèi)專家制定了《抗結(jié)核藥物藥效學(xué)非臨床研究技術(shù)指南》，為注冊(cè)申請(qǐng)人、研究者在規(guī)劃、設(shè)計(jì)、實(shí)施藥效學(xué)非臨床研究提供技術(shù)指導(dǎo)。

本技術(shù)指南適用于單一抗結(jié)核藥物的研發(fā)，且主要針對(duì)肺結(jié)核病用藥，肺外結(jié)核、潛伏感染、預(yù)防性用藥等并不在本指南適用范圍內(nèi)。尤其關(guān)注可以減少敏感結(jié)核療程的，對(duì)耐藥結(jié)核病有效的藥物。對(duì)于兩藥組合的方案以及固定劑量復(fù)合制劑，可作為參考。

所有與結(jié)核分枝桿菌菌株接觸的實(shí)驗(yàn)操作必須在生物安全實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行?？菇Y(jié)核藥物的臨床前藥效學(xué)研究分為體外活性評(píng)價(jià)和體內(nèi)活性評(píng)價(jià)。

1 體外研究[1-4]

1.1 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定

體外研究首先需要測(cè)定藥物的抗菌活性，包括殺菌、滅菌活性。結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)包括對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（復(fù)制期）和休眠靜止期（非復(fù)制期）。研究藥物對(duì)復(fù)制期細(xì)菌的活性稱為殺菌活性;對(duì)非復(fù)制期細(xì)菌的活性則為滅菌活性。描述抗菌活性的重要指標(biāo)之一是最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），MIC測(cè)定應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)化方法，有液體培養(yǎng)基中結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)、代謝反應(yīng)檢測(cè)方法和傳統(tǒng)固體培養(yǎng)基表型檢測(cè)方法。觀察結(jié)核分枝桿菌生存情況可以通過(guò)菌落計(jì)數(shù)或熒光檢測(cè)的方法，應(yīng)用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)7～10 d后添加指示劑，添加指示劑后避光培養(yǎng)過(guò)夜，通過(guò)檢測(cè)吸光度來(lái)判斷菌株生長(zhǎng)情況。應(yīng)用含藥瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行MIC測(cè)定的，需要培養(yǎng)3～4周，3～4周后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。菌株應(yīng)具有地區(qū)代表性，并應(yīng)包含有代表性的不同耐藥情況的樣本， 一般應(yīng)選擇近2～3年的臨床分離菌，一些收集困難的菌種可考慮5年內(nèi)的臨床分離株。

1.2 最低殺菌濃度（MBC）測(cè)定

最低殺菌濃度（minimal bactericidal concentration， MBC），指在給定條件下培養(yǎng)一定時(shí)間能殺死大部分（≥99.9%）接種受試活菌數(shù)的最低藥物濃度。最低殺菌濃度的檢測(cè)方法可以通過(guò)將MIC實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)菌液原液或稀釋液涂布至不含抗結(jié)核藥物的瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3～4周觀察能夠殺死結(jié)核分枝桿菌的最低藥物濃度，即MBC。

MIC和MBC均為靜態(tài)觀察藥物或化合物與菌株之間相互作用的評(píng)價(jià)指標(biāo)，可以作為初步評(píng)價(jià)化合物的抗結(jié)核活性的指標(biāo)。作為評(píng)價(jià)抗結(jié)核活性的重要指標(biāo)，MIC和MBC只能提供一個(gè)時(shí)間點(diǎn)化合物的抗結(jié)核活性，不能全面評(píng)價(jià)化合物對(duì)結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)的作用，具有一定局限性。

1.3 殺菌曲線（time-killing curves）

殺菌曲線可以動(dòng)態(tài)觀察藥物（化合物）與結(jié)核分枝桿菌相互作用的情況，能夠比較不同濃度化合物在不同作用時(shí)間下對(duì)結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)的影響，為評(píng)價(jià)化合物的抗結(jié)核活性提供更多依據(jù)。通過(guò)繪制殺菌曲線可以判斷化合物抗結(jié)核活性為時(shí)間依賴性或濃度依賴性，為后續(xù)藥動(dòng)學(xué)（PK）研究和藥動(dòng)學(xué)/藥效學(xué)（PK/PD）研究提供依據(jù)。菌株可以是結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株或臨床株。初始菌液濃度約為5×105 CFU/mL。當(dāng)評(píng)價(jià)單一化合物的抗結(jié)核活性時(shí)，實(shí)驗(yàn)組中待測(cè)化合物濃度需要參考該化合物MIC值進(jìn)行設(shè)定，從低濃度至高濃度，藥物濃度通常為1/2×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC，結(jié)核分枝桿菌在含藥培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14 d，期間每隔3～4 d取部分菌液在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)3～4周后進(jìn)行計(jì)數(shù)。菌落數(shù)取對(duì)數(shù)值作為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制曲線即殺菌曲線。與初始接種量相比，如果藥物可導(dǎo)致菌落計(jì)數(shù)降低3個(gè)log值及以上（相當(dāng)于殺死99.9%以上的初始接種菌），則可判斷藥物具有殺菌活性。殺菌曲線也用于在體外評(píng)價(jià)藥物組合中各藥物間的相互作用。

1.4 巨噬細(xì)胞內(nèi)抗結(jié)核活性檢測(cè)

結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活，需要評(píng)價(jià)研究藥物的胞內(nèi)殺菌活性。用于結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞系常選用RAW264.7和J774.1兩種。細(xì)胞培養(yǎng)后將結(jié)核分枝桿菌感染，加入藥物處理一般72 h，裂解細(xì)胞；進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌活菌計(jì)數(shù)，比較化合物處理組與未經(jīng)化合物處理組及陽(yáng)性對(duì)照藥處理組中巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量。由于測(cè)定巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)數(shù)量的方法需要裂解細(xì)胞并將裂解液進(jìn)行培養(yǎng)及計(jì)算菌落的個(gè)數(shù)，因此此方法缺點(diǎn)在于耗時(shí)較長(zhǎng)。

1.5 結(jié)核分枝桿菌自發(fā)突變率的檢測(cè)

在體外研究中，可使用自發(fā)突變率（野生型菌株暴露于藥物下發(fā)生突變的頻率）來(lái)評(píng)估菌株耐藥的風(fēng)險(xiǎn)，但這一方法對(duì)體內(nèi)試驗(yàn)時(shí)聯(lián)合用藥的耐藥風(fēng)險(xiǎn)可能無(wú)法預(yù)測(cè)。若使用耐藥菌株評(píng)估，風(fēng)險(xiǎn)較高且可能對(duì)臨床試驗(yàn)中單藥的設(shè)計(jì)產(chǎn)生影響。此方法是將結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后濃縮至108 CFU/mL，取100 μL分別涂布至含藥（含4×MIC藥物濃度）及不含藥7H10固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)4周后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。計(jì)算突變率。

1.6 體外藥效學(xué)相互作用

體外藥效學(xué)相互作用（pharmacodynamic interactions）是指對(duì)研究藥物的相互作用、有效劑量進(jìn)行評(píng)估，從而確定其進(jìn)一步研發(fā)為肺結(jié)核治療方案藥物的可行性。目前常用的定量方法是棋盤稀釋法。以兩種藥物的相互作用為例，首先分別測(cè)定兩個(gè)研究藥物對(duì)結(jié)核分枝桿菌的MIC，根據(jù)MIC值，設(shè)定最高濃度為單藥的2×MIC，再逐一進(jìn)行2倍稀釋（分別在方陣的縱列和橫列進(jìn)行），每管（孔）中分別是兩種藥物不同濃度組合的混合液，一般設(shè)計(jì)6～8個(gè)稀釋度。初始接種菌量為5×105CFU/mL，在37℃孵育7 d，觀察結(jié)果并計(jì)算部分抑菌指數(shù)（fractional inhibitory concentration， FIC）。FIC指數(shù)計(jì)算公式（A藥聯(lián)用時(shí)的MIC/A藥單測(cè)時(shí)的MIC）+（B藥聯(lián)用時(shí)的MIC/B藥單測(cè)時(shí)的MIC）。根據(jù)FIC值判斷為協(xié)同作用（＜0.5）、相加作用（0.5～1）、無(wú)關(guān)作用（1～2）和拮抗作用（＞2）。

1.7 作用機(jī)制

需要對(duì)抗結(jié)核藥物的作用機(jī)制進(jìn)行研究，從而為其組成有效治療方案提供依據(jù)。作用機(jī)制研究方法可參考一般抗菌藥物。

1.8 耐藥性及其機(jī)制

結(jié)核分枝桿菌分離株對(duì)研究藥物可能產(chǎn)生耐藥性，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)捏w外和/或體內(nèi)模型進(jìn)行評(píng)估。同時(shí)，還應(yīng)關(guān)注交叉耐藥（同類藥物間、與其他類藥物間）。若細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，需要進(jìn)一步研究耐藥機(jī)制。在非臨床研究中，如發(fā)現(xiàn)表觀型/基因型的變化，可對(duì)其臨床意義嘗試評(píng)估，例如體外藥敏。

2 體內(nèi)研究[4-15]

動(dòng)物模型是研究藥物體外抗結(jié)核分枝桿菌活性和人體臨床試驗(yàn)之間的一個(gè)重要橋梁。小鼠最常用于抗結(jié)核藥物體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)，其次是豚鼠， 非人靈長(zhǎng)類；感染途徑一般包括氣溶膠、氣管、鼻腔、靜脈、腹腔等；分析、評(píng)價(jià)手段可通過(guò)對(duì)動(dòng)物肺、脾進(jìn)行臟器菌落計(jì)數(shù)，臟器病理和抗酸染色等方法。

2.1 小鼠

是抗結(jié)核評(píng)價(jià)使用最廣泛的動(dòng)物，具有易于操作、價(jià)格便宜、所需化合物量少的優(yōu)點(diǎn)。小鼠品系有BALB/c、C57BL/6、C3HeB/FeJ等，一般可采用氣溶膠霧化感染、滴鼻感染或尾靜脈注射等方法。小鼠結(jié)核病模型不形成干酪樣肺病變和空洞，只形成非壞死性細(xì)胞肉芽腫，主要由淋巴細(xì)胞、上皮樣巨噬細(xì)胞和泡沫巨噬細(xì)胞組成。幾乎所有結(jié)核分枝桿菌都在巨噬細(xì)胞中，因此主要反映化合物的胞內(nèi)抗結(jié)核活性。高劑量感染（肺中定植5000CFU或更高）結(jié)核分枝桿菌的小鼠可以在感染后4～6周死亡，低劑量感染免疫缺陷小鼠（例如無(wú)胸腺裸鼠或γ干擾素敲除小鼠）也會(huì)產(chǎn)生同樣的結(jié)果。低劑量感染（肺定植10～500CFU）免疫健全小鼠如BALB/c和C57BL/6，獲得性免疫反應(yīng)可以限制感染的進(jìn)展，感染后4周肺荷菌量進(jìn)入平臺(tái)期，形成長(zhǎng)期存活的慢性感染。

小鼠急性感染模型：模擬人體急性感染狀態(tài)，是在小鼠體內(nèi)免疫反應(yīng)未完全建立，肺中的結(jié)核分枝桿菌活躍生長(zhǎng)時(shí)，開始藥物治療，評(píng)價(jià)藥物對(duì)增殖期細(xì)菌的抑制/殺滅能力，時(shí)間一般在2周內(nèi)。一般可采用氣溶膠霧化感染、滴鼻感染或尾靜脈注射等方法進(jìn)行大劑量結(jié)核分枝桿菌的感染，感染后1～2周開始治療，藥物對(duì)復(fù)制期的結(jié)核分枝桿菌治療1～4周。停藥后，安樂(lè)處死小鼠，無(wú)菌操作下解剖，組織勻漿，10倍稀釋后涂在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行37℃培養(yǎng)和活菌計(jì)數(shù)。評(píng)價(jià)指標(biāo)： 肺、脾的活菌計(jì)數(shù)，小鼠存活率，體重變化，組織病理學(xué)檢查等。

小鼠慢性感染模型：慢性模型是模擬人體感染的持留狀態(tài)，在小鼠免疫反應(yīng)已建立，肺中的結(jié)核分枝桿菌緩慢生長(zhǎng)或進(jìn)入平臺(tái)期時(shí)，才開始治療。此模型中具有良好活性的藥物，在臨床治療中有可能縮短療程。慢性感染模型通常使用低劑量菌感染小鼠（30～100CFU/肺），小鼠有充足的免疫反應(yīng)，感染后可存活數(shù)月至1年以上，且肺臟荷菌量不會(huì)超過(guò)6～6.5 log10CFU。感染結(jié)核分枝桿菌3周后開始治療。在治療相應(yīng)時(shí)間后（通常以1個(gè)月、2個(gè)月治療多見），解剖小鼠，取出肺、脾等組織，研磨均勻后，接種用于CFU計(jì)數(shù)。最后統(tǒng)計(jì)分析各組數(shù)據(jù)，對(duì)化合物作出評(píng)價(jià)。

C3HeB/FeJ小鼠模型：C3HeB/FeJ小鼠在合適的條件下感染結(jié)核分枝桿菌后能形成干酪樣病灶。C3HeB/FeJ小鼠的肺病理存在異質(zhì)性，因此實(shí)驗(yàn)需要小鼠的數(shù)量比BALB/c小鼠數(shù)量多。氣溶膠感染結(jié)核分枝桿菌50～75個(gè)CFU后，形成3種典型的肺病灶：爆發(fā)性壞死性肺泡炎、組織有序的干酪樣肉芽腫和細(xì)胞肉芽腫。一般感染5～6周后，可以形成干酪樣壞死。1/3至2/3的小鼠形成結(jié)構(gòu)有序的干酪樣肉芽腫，中間干酪化，周邊纖維化和類似大型種屬包括人的無(wú)氧特性。大的干酪樣肉芽腫會(huì)隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)形成空洞病灶，空洞可以通過(guò)計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）發(fā)現(xiàn)?？斩床≡钤谌烁腥窘Y(jié)核分枝桿菌后也會(huì)形成。該模型可以評(píng)價(jià)化合物進(jìn)入空洞病灶的殺菌活性?？紤]到干酪樣病灶對(duì)結(jié)核藥物的PK/PD影響，C3HeB/FeJ小鼠的組織病理學(xué)的改變能較好地用該種小鼠反應(yīng)藥物對(duì)患者的活性。

2.2 豚鼠

相對(duì)于小鼠，豚鼠對(duì)結(jié)核分枝桿菌更易感，通常極少量的活菌（20～30個(gè)CFU）的氣溶膠感染就可在豚鼠體內(nèi)形成感染。豚鼠感染后，可在肺部形成典型的肉芽腫結(jié)構(gòu)，且可發(fā)展為干酪樣壞死，其肺部壞死灶、淋巴結(jié)結(jié)核和結(jié)核病的播散情況，使得豚鼠模型可以更好地模擬人類結(jié)核病的特征。但相對(duì)于小鼠，豚鼠價(jià)格較貴，操作較麻煩，而且豚鼠對(duì)結(jié)核分枝桿菌高度易感，具有強(qiáng)抗結(jié)核活性的研究藥物才能在豚鼠模型得到較好的評(píng)價(jià)。豚鼠模型更多地用于抗結(jié)核活性確證及治療方案的評(píng)價(jià)，一般較少用于抗結(jié)核新藥的初篩。在近似菌量負(fù)載下，相比于BALB/c小鼠，豚鼠的治療效果更顯著。對(duì)于再次確定或修正小鼠體內(nèi)得到的結(jié)果，尤其是缺氧的微環(huán)境模擬，豚鼠是比小鼠更優(yōu)的選擇。在涉及這方面的研究時(shí)，需要提供豚鼠模型的結(jié)果。其研究策略包括但不限于如下內(nèi)容：

（1） 選擇無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)4～6周齡豚鼠（Hartley品系），體質(zhì)量為300～350 g；將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組，各組動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水，飼養(yǎng)條件保持恒溫恒濕，并定期通風(fēng)消毒。

（2）利用加入0.05%的Tween 80的7H9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并利用H37Rv菌株的生長(zhǎng)曲線或A570/600測(cè)定菌液的濃度。

（3）利用微生物氣溶膠發(fā)生器制備感染物的氣溶膠懸液，以氣溶膠方式感染豚鼠：5×106 CFU/mL的菌懸液，置于霧化器中，氣溶膠裝置感染，感染10天后，可解剖基線豚鼠檢測(cè)感染是否成功（肺臟荷菌量達(dá)到103～104/105CFU），3～4周后可開始治療。

（4）根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)各治療組使用彎頭灌胃針進(jìn)行灌胃給藥，通常治療4～8周，期間根據(jù)動(dòng)物體重增長(zhǎng)及時(shí)調(diào)整藥物劑量。

（5）在預(yù)定的治療結(jié)束時(shí)間點(diǎn)解剖豚鼠，取臟器（通常為肺、脾），加入無(wú)菌生理鹽水/PBS研磨臟器組織。

（6） 活菌計(jì)數(shù)：稀釋度根據(jù)臟器病變程度確定，進(jìn)行10倍梯度稀釋，取適當(dāng)體積的不同稀釋度菌液，接種于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)基，37℃恒溫箱培養(yǎng)，3～4周后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并計(jì)算每只豚鼠肺臟和脾臟的活菌數(shù)，以對(duì)數(shù)形式表示。

（7）比較各組間差異，評(píng)價(jià)不同化合物或組合方案的效果。評(píng)價(jià)指標(biāo)包括但不限于：豚鼠體重，臟器重量變化，臟器活菌計(jì)數(shù)結(jié)果，病理結(jié)果。

2.3? ? 非人靈長(zhǎng)類

主要是犬齒獼猴、恒河獼猴被用于臨床前抗結(jié)核藥物評(píng)價(jià)。通過(guò)支氣管滴入大約25個(gè)CFU的結(jié)核分枝桿菌，可以在隨后6～8個(gè)月形成近似等比例的活動(dòng)性結(jié)核病或亞臨床/潛伏感染。正電子斷層掃描顯像（PET-CT）在感染后3周可以鑒定動(dòng)物是否會(huì)發(fā)展為活動(dòng)性或潛伏結(jié)核。大劑量滴注（1000個(gè)CFU）會(huì)在較短時(shí)間獲得高比例的活動(dòng)性結(jié)核?；顒?dòng)性結(jié)核病可以通過(guò)以下特點(diǎn)鑒別：癥狀例如咳嗽、體重降低等，紅細(xì)胞沉降率升高，胸片異常，胃吸入和支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)陽(yáng)性。藥物療效評(píng)價(jià)的治療終點(diǎn)包括胃吸入或支氣管肺泡灌洗液活菌計(jì)數(shù)、系列PET-CT成像終點(diǎn)、器官CFU評(píng)分和病理學(xué)評(píng)分等。獼猴用于臨床前藥效評(píng)價(jià)面臨許多挑戰(zhàn)，例如不容易獲得，價(jià)格非常昂貴，需要特殊的飼養(yǎng)條件和倫理問(wèn)題等。

3? ? 總結(jié)

綜上，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自身?xiàng)l件，采用多種不同的小鼠模型用于抗結(jié)核新藥篩選與評(píng)價(jià)，而不限于采用同一種模型，但一般應(yīng)包括小鼠急性與慢性感染模型。同時(shí)，考慮到對(duì)結(jié)核感染多方面活性的評(píng)估，可以使用不同的結(jié)核分枝桿菌菌株/動(dòng)物模型，來(lái)評(píng)價(jià)單個(gè)藥物/治療方案。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部應(yīng)具備統(tǒng)一、規(guī)范的方案和方法，包括但不限于標(biāo)準(zhǔn)菌株、感染菌量、感染方式、對(duì)照藥物以及治療時(shí)間等。菌株的選擇，可能是影響頭對(duì)頭（head to head）試驗(yàn)結(jié)果比對(duì)的最重要條件。推薦使用不同菌株，如能獲得臨床分離菌株，也可使用。所使用的結(jié)核菌株應(yīng)具有良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，較少的傳代次數(shù)，毒力保持良好且背景清楚。

評(píng)價(jià)研究藥物的治療效果，其在聯(lián)合治療方案中的作用，確定研究藥物在臨床試驗(yàn)中使用的劑量、治療方案等，都可以通過(guò)動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)行。如果結(jié)核分枝桿菌菌株表現(xiàn)出對(duì)某一藥物的敏感性降低，也可以在相應(yīng)的動(dòng)物模型中評(píng)估其是否適合產(chǎn)生和維持臨床上明顯的感染癥狀。通過(guò)體外數(shù)據(jù)與動(dòng)物模型，可推論聯(lián)合試驗(yàn)方案是否對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的其他菌株有效。

參 考 文 獻(xiàn)

Nuermberger E L. Preclinical efficacy testing of new drug candidates[J]. Microbiol Spectr， 2017， 5（3）. doi： 10.1128/microbiolspec.TBTB2-0034-2017.

Franzblau S G， DeGroote M A， Cho S H， et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis[J]. Tuberculosis， 2012， 92（6）： 453-488.

Gill W P， Harik N S， Whiddon M R， et al. A replication clock for Mycobacterium tuberculosis[J]. Nat Med， 2009， 15（2）： 211-214.

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局. 抗肺結(jié)核藥物臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則[S]. 2017.

Nuermberger E. Using animal models to develop new treatments for tuberculosis[J]. Semin Respir Crit Care Med， 2008， 29（5）： 542-551.

Driver E R， Ryan G J， Hoff D R， et al. Evaluation of a mouse model of necrotic granuloma formation using C3HeB/FeJ mice for testing of drugs against Mycobacterium tuberculosis[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2012， 56（6）： 3181-3195.

Irwin S M， Driver E， Lyon E， et al. Presence of multiple lesion types with vastly different microenvironments in C3HeB/FeJ mice following aerosol infection with Mycobacterium tuberculosis[J]. Dis Model Mech， 2015， 8（6）： 591-602.

Harper J， Skerry C， Davis S L， et al. Mouse model of necrotic tuberculosis granulomas develops hypoxic lesions. J Infect Dis， 2012， 205（4）： 595-602.

Subbian S， Tsenova L， Yang G， et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits： A failed host immune response[J]. Open Biol， 2011， 1（4）： 110016.

Urbanowski M E， Ihms E A， Bigelow K， et al. Repetitive aerosol exposure promotes cavitary tuberculosis and enables screening for targeted inhibitors of extensive lung destruction[J]. J Infect Dis， 2018， 218（1）： 53-63.

Pena J C， Ho W Z. Non-human primate models of tuberculosis[J]. Microbiol Spectr， 2016， 4（4）. doi： 10.1128/microbiolspec.TBTB2-0007-2016.

Capuano S V， 3rd， Croix D A， Pawar S， et al. Experimental Mycobacterium tuberculosis infection of cynomolgus macaques closely resembles the various manifestations of human M. tuberculosis infection[J]. Infect Immun， 2003， 71（10）： 5831-5844.

Lin P L， Rodgers M， Smith L， et al. Quantitative comparison of active and latent tuberculosis in the cynomolgus macaque model[J]. Infect Immun， 2009， 77（10）： 4631-4642.

Lin P L， Coleman T， Carney J P， et al. Radiologic responses in cynomolgus macaques for assessing tuberculosis chemotherapy regimens[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2013， 57（9）： 4237-4244.

Via L E， Weiner D M， Schimel D， et al. Differential virulence and disease progression following Mycobacterium tuberculosis complex infection of the common marmoset （Callithrix jacchus）[J]. Infect Immun， 2013， 81（8）： 2909-2919.

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（No. 82173862）；北京市醫(yī)院管理中心臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展專項(xiàng)（No. ZYLX202123）

作者簡(jiǎn)介：朱慧，女，生于1977年，博士，副研究員，研究方向?yàn)榭菇Y(jié)核藥物藥理學(xué)，E-mail： zhuhui06@tsinghua.org.cn