張 妍 邵正波
遺傳、年齡、糖尿病、缺氧、高血壓等多種因素可造成視網(wǎng)膜損害,引起患者嚴(yán)重的視力下降甚至失明[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),外泌體可通過多種途徑調(diào)控視網(wǎng)膜損傷及修復(fù),外泌體是一種大小為40~160 nm的細(xì)胞外囊泡,可由間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、癌細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌形成,廣泛分布于羊水、膽汁、母乳、唾液、尿液、淚液等體液中[3-4]。作為一種脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的囊泡,主要由細(xì)胞內(nèi)多泡體與細(xì)胞膜融合后以囊性小泡的形式被釋放到細(xì)胞外形成[3]。外泌體是細(xì)胞間信息交流的重要載體,其中包含的DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂類等多種生物活性物質(zhì)均可被其遞送到靶組織,參與細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等生命活動[3,5-12]。作為納米級的生物膜結(jié)構(gòu),外泌體能較好地保護(hù)微小RNA(miRNA)、環(huán)狀RNA(circRNA)等轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的完整性和生物活性,該特征極大地提升了外泌體RNA作為疾病相關(guān)生物標(biāo)志物的可行性[6]。隨著對外泌體研究的深入,外泌體中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,如miRNA、circRNA等在視網(wǎng)膜損傷相關(guān)疾病中具有生物學(xué)特性和靶向特異性,與疾病發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸機(jī)制密切相關(guān)[6]。
轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析是一種應(yīng)用廣泛的研究方法,通過分析特定生理和病理狀態(tài)下細(xì)胞或組織中所有RNA的表達(dá)情況,包括可翻譯成蛋白質(zhì)的編碼RNA和參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的非編碼RNA,以篩選可能導(dǎo)致生理變化和疾病進(jìn)展的關(guān)鍵分子[13]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究常用的方法包括差異表達(dá)分析、聚類分析等,可用于評估不同條件下基因轉(zhuǎn)錄豐度的變化、識別共調(diào)控基因,從而了解疾病相關(guān)的生物機(jī)制或途徑[13]。因此,利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析來研究外泌體中差異表達(dá)的RNA,對識別糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、青光眼等疾病的分子生物標(biāo)志物及治療靶點至關(guān)重要[3,9-10,14-16]。
1.1 外泌體轉(zhuǎn)錄組學(xué)與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞外泌體miRNA可以參與增生型視網(wǎng)膜病變、糖尿病性黃斑水腫(DME)等疾病的進(jìn)展過程。Zhang等[17]利用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)從人視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞系(ARPE-19)細(xì)胞以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)狀態(tài)ARPE-19(EMTed ARPE-19)細(xì)胞的外泌體中鑒定出了34種有顯著表達(dá)改變的miRNA,這些miRNA可以調(diào)控細(xì)胞或組織的EMT,其中miR-543在EMTed ARPE-19細(xì)胞源性外泌體中的表達(dá)量顯著增加,通過介導(dǎo)EMT級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致RPE細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞,參與增生型玻璃體視網(wǎng)膜病變增殖膜形成,最終導(dǎo)致疾病快速進(jìn)展。Dong等[18]基于該研究發(fā)現(xiàn),miR-4488和miR-1273g-5p過表達(dá)的外泌體可以通過靶向調(diào)節(jié)三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A4(ABCA4)的表達(dá),抑制轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞EMT。上述研究表明,外泌體miRNA對EMT的調(diào)控機(jī)制尚不明確,仍需進(jìn)一步研究。隨后,Li等[19]對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),有8種miRNA與細(xì)胞纖維化密切相關(guān),表達(dá)量最高的miR-27b可以通過抑制同源盒蛋白Hox-C6(HOXC6)基因的表達(dá),減少TGF-β2對RPE細(xì)胞EMT的誘導(dǎo)。Gu等[20]研究發(fā)現(xiàn),ARPE-19細(xì)胞含有3種表達(dá)受高糖刺激影響的miRNA,由外泌體轉(zhuǎn)運的miR-202-5p通過調(diào)控TGF/Smad通路,抑制高糖誘導(dǎo)的EMT。在DME的研究中,Jiang等[21]提出,患者血清外泌體miRNA表達(dá)具有特異性,而且,外泌體攜帶的miR-377-3p可以直接下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá),抑制RPE增殖,有效延緩疾病進(jìn)展,且該基因的受試者工作特征曲線(ROC)分析顯示,其能夠?qū)ME進(jìn)行更加精確的診斷,該研究提示,miR-377-3p為該疾病提供了一個潛在的診斷標(biāo)志物。由此可見,外泌體miRNA對疾病進(jìn)展具有兩面性,其攜帶的特定miRNA不僅可以加重視網(wǎng)膜損傷,還可以通過抑制VEGF表達(dá)來延緩疾病進(jìn)展。此外,RPE細(xì)胞外泌體miRNA還是視神經(jīng)衰老過程中小膠質(zhì)細(xì)胞激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Morris等[22]對RPE細(xì)胞外泌體進(jìn)行了miRNA組學(xué)分析,共檢測到66個表達(dá)具有年齡依賴性的miRNA,其中高表達(dá)的miR-21可以上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞中p53信號通路下游基因的表達(dá),從而調(diào)控衰老視網(wǎng)膜的慢性炎癥反應(yīng),這表明,外泌體miRNA具有免疫調(diào)節(jié)作用。
以上研究表明,外泌體miRNA可通過調(diào)控EMT、VEGF表達(dá)、炎癥反應(yīng)等多種途徑參與RPE損傷相關(guān)疾病的進(jìn)程,具有成為病程預(yù)測標(biāo)志物的潛力,甚至可能用于基因治療。
1.2 外泌體轉(zhuǎn)錄組學(xué)與視網(wǎng)膜新生血管形成視網(wǎng)膜新生血管形成是DR、AMD等疾病的病理特征。Liu等[23]應(yīng)用微陣列分析增生型DR(PDR)患者及黃斑裂孔患者的玻璃體源性外泌體,鑒定出82個在PDR樣本中特異性高表達(dá)的miRNA;對表達(dá)上調(diào)排名前5的miRNA進(jìn)行驗證顯示,miR-9-3p通過靶向鞘氨醇-1-磷酸受體1(S1P1)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)/VEGF受體2通路調(diào)控視網(wǎng)膜新生血管形成,有潛力成為PDR的治療靶點。與玻璃體源性外泌體相比,循環(huán)外泌體易于獲取,為外泌體miRNA的研究提供了新思路。在新生血管性AMD的研究中,Grassmann等[24]對患者血漿外泌體miRNA的分析結(jié)果顯示,hsa-miR-301a-3p,hsa-miR-361-5p和hsa-miR-424-5p可能通過TGF-β、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)等信號通路參與疾病的發(fā)生和發(fā)展;后續(xù)實驗表明,hsa-mir-361-5p表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)新生血管形成,這為理解疾病機(jī)制和設(shè)計靶向治療方案提供了新的思路。隨后,Elbay等[25]在AMD患者血清外泌體中發(fā)現(xiàn),miR-486-5p、miR-626和miR-885-5p也具有特異性,主要與細(xì)胞凋亡和血管生成有關(guān),該研究補充了對AMD發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識,提示這些miRNA可以作為疾病診斷的分子標(biāo)志物。
此外,外泌體還可以通過轉(zhuǎn)運特定circRNA促進(jìn)血管生成。Zhang等[26]在DR患者視網(wǎng)膜樣本中鑒定出529種異常表達(dá)circRNA,其中Circ_0005015在患者的玻璃體、血漿、視網(wǎng)膜前纖維血管膜中均高表達(dá),且可通過外泌體轉(zhuǎn)運來調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管形成,因此該circRNA具有作為DR診斷、治療及預(yù)后標(biāo)志物的潛力。
除了視網(wǎng)膜新生血管形成,外泌體circRNA介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞-周細(xì)胞串?dāng)_異常也是DR發(fā)病機(jī)制之一[27]。Liu等[28]檢測并對比了具有瘦素受體缺陷的db/db小鼠與對照組小鼠視網(wǎng)膜circRNA的組成,鑒定出844個差異表達(dá)的circRNA;對隨機(jī)選擇的20種circRNA進(jìn)行聚類分析及驗證顯示,這些非編碼RNA具有糖尿病樣本特異性,其中cPWWP2A通過外泌體轉(zhuǎn)運可以引起周細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞串?dāng)_異常,導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管功能障礙,是DR的潛在調(diào)節(jié)因子。Ye等[29]研究發(fā)現(xiàn),低氧環(huán)境可以顯著影響周細(xì)胞外泌體circRNA的表達(dá),其中circEhmt1表達(dá)上調(diào)最顯著,且該基因可使核因子I/A(NFIA)表達(dá)量增多,抑制NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體形成,導(dǎo)致周細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞串?dāng)_異常。這些研究從細(xì)胞層面闡明DR的發(fā)病機(jī)制,為疾病干預(yù)提供了新視角。
不同細(xì)胞來源的外泌體所含有的miRNA分子具有異質(zhì)性,因此一部分外泌體特定miRNA可以促進(jìn)新生血管形成,另一部分則對視網(wǎng)膜微血管生成具有抑制作用[3]。Gu等[30]研究發(fā)現(xiàn),間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體攜帶的miR-192可以負(fù)向調(diào)控整合素亞基α1(ITGA1),抑制高糖環(huán)境中的視網(wǎng)膜新生血管形成,延緩DR進(jìn)展。外泌體特異性miRNA的抗血管生成作用為DR的靶向治療提供了新思路,但目前對抑制視網(wǎng)膜血管生成的外泌體RNA認(rèn)識尚不全面,有待利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)一步探究。
作為疾病調(diào)控的新機(jī)制,外泌體功能性RNA的發(fā)現(xiàn)為DR、AMD等視網(wǎng)膜新生血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程提出了新的見解,為疾病的早期診斷和治療提供了指導(dǎo)。
1.3 外泌體轉(zhuǎn)錄組學(xué)與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷(RIR)是青光眼的重要病理生理基礎(chǔ),最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)凋亡。RGCs損傷后不可再生,但越來越多的研究表明,外泌體可以通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[31-32]。Yu等[33]在腫瘤壞死因子-α(TNF-α)刺激的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體中鑒定了28種炎癥相關(guān)miRNA,其中miR-21-5p可以通過母源性印記基因3(MEG3)/miR-21-5p/程序性死亡因子4(PDCD4)信號軸減輕RIR引起的炎癥反應(yīng),抑制RGCs凋亡,為青光眼提供了無細(xì)胞治療策略。還有研究證實,外泌體中特定miRNA可以減少RGCs軸突缺失,使細(xì)胞功能障礙得到緩解,但外泌體在視神經(jīng)保護(hù)過程中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征尚不明確[34-35]。
1.4 外泌體轉(zhuǎn)錄組學(xué)與光感受器細(xì)胞光感受器細(xì)胞凋亡是視網(wǎng)膜退行性病變的重要病理特征,抑制該細(xì)胞凋亡是治療的關(guān)鍵[36]。Bian等[37]通過分析外泌體miRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn),miR-181、miR-26、miR-9和let-7家族豐度較高,其中有17個miRNA通過下調(diào)炎癥因子TNF-α、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和環(huán)氧合酶-2(COX-2),抑制炎癥信號通路,進(jìn)而減少光感受器細(xì)胞凋亡。此外,Xu等[38]篩選出7個外泌體特異性miRNA;后續(xù)驗證結(jié)果顯示,表達(dá)量最高的miR-24-3P可通過調(diào)節(jié)肌醇依賴性激酶1α(IRE1α)-X-盒結(jié)合蛋白1(XBP1)信號通路,抑制缺氧誘導(dǎo)的光感受器細(xì)胞凋亡,這為早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的治療研究提供了新思路。上述結(jié)果均揭示了外泌體miRNA對光感受器細(xì)胞的保護(hù)性作用,但具體機(jī)制仍需后續(xù)研究驗證。
將轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析應(yīng)用于視網(wǎng)膜損傷的相關(guān)研究,深入了解外泌體在各種視網(wǎng)膜損傷疾病中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征,不僅能篩選出DR、AMD、青光眼、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等視網(wǎng)膜疾病診斷的新指標(biāo),還能找到潛在治療靶點。值得注意的是,通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析篩選出的生物標(biāo)志物還需通過實驗進(jìn)一步驗證。目前,外泌體轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析在視網(wǎng)膜相關(guān)疾病研究中的應(yīng)用處于起步階段,主要用于差異表達(dá)基因的篩選。由于外泌體RNA與多種視網(wǎng)膜損傷相關(guān)疾病有著密切的關(guān)系,今后可以從鑒定靶基因功能、分析下游通路、構(gòu)建基因互作網(wǎng)絡(luò)等方面進(jìn)行研究,從分子層面揭示視網(wǎng)膜損傷的病理機(jī)制,為疾病治療找到新的靶點。