孟 歡 鄧婷婷 羅 丹 金 明

年齡相關性黃斑變性(AMD)作為一種發(fā)生于黃斑部的眼底退行性病變，是造成全世界中老年人不可逆失明的主要原因。1990年至2019年間，我國AMD患病率顯著上升，由于疾病導致的視力障礙、抑郁等所造成的健康生命年的消失也與日俱增，預計2050年我國僅新增患病人數(shù)將達4500萬，成為一個嚴重的公共衛(wèi)生問題[1-2]。AMD患者視力喪失的主要原因為黃斑部視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞死亡與光感受器細胞的丟失，根據(jù)眼底特征性改變，AMD在臨床上可進一步分為萎縮型(干性)AMD與滲出型(濕性)AMD兩種類型，前者以玻璃膜疣、地圖樣萎縮(GA)為典型表現(xiàn)，后者則以脈絡膜新生血管(CNV)為主要特征，干性AMD患病人數(shù)龐大，約占AMD患者的80%以上，但濕性AMD患者病情更為急劇，是造成90%的AMD患者失明的主要原因[3-4]。

小膠質細胞(MG)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)重要的免疫效應細胞，主要分布于大腦與脊髓，占體內神經(jīng)膠質細胞總數(shù)的10%～15%[5]，于1919年被首次定義，MG與帕金森病、阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化癥等多種CNS退行性病變的關聯(lián)得到揭示，并成為治療多種精神神經(jīng)疾病的新靶點[6-9]。視網(wǎng)膜作為CNS的延續(xù)，MG在視網(wǎng)膜的不同生命階段發(fā)揮重要生理功能，通過分泌促炎性神經(jīng)毒性細胞因子和吞噬活性神經(jīng)元等多種途徑，參與了AMD、青光眼、視網(wǎng)膜色素變性等多種眼底病的神經(jīng)退行性變[10]。本文將對近年來關于MG在AMD發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機制的相關報道進行綜述，以期探索AMD治療的新方向。

1 關于MG的概述

1.1 MG的來源與發(fā)育MG屬于單核吞噬細胞系統(tǒng)，是神經(jīng)實質中唯一的髓細胞，起源于卵黃囊的紅髓祖細胞，MG的前體細胞具有非常強的細胞增殖、免疫反應和神經(jīng)分化潛能，在血-腦屏障形成之前，即小鼠胚胎約第8.5天(E8.5)、人類胚胎約第12～13周(GW12-13)時遷移到腦實質,在大腦中遷移、定居、分化、成熟，成為大腦中的免疫細胞，并顯示出一定的跨區(qū)域形態(tài)異質性，最終達到維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)環(huán)境免疫平衡的穩(wěn)定狀態(tài)，擁有數(shù)月至數(shù)年的長壽命[11-12]。MG的發(fā)育和維持依賴于集落刺激因子1受體(CSF-1R)等傳遞的信號，CSF-1R抑制劑PLX3397連續(xù)7 d給藥可消除成年小鼠90%以上的MG[13]，CSF-1和白細胞介素 34(IL-34)均是CSF-1R的配體，二者來源于不同的細胞，在腦內分布廣泛但并不重疊，通過互補的表達與CSF-1R共同實現(xiàn)對MG數(shù)目及分布的調控[14]。正常狀態(tài)下，MG是長期存活的，并通過緩慢的局部增殖維持數(shù)量與密度的穩(wěn)定，不需要外源性的補充，但在疾病條件下，MG可快速克隆性增殖并迅速對損傷做出反應，發(fā)揮生理功能[15]。MG在物種進化上相對保守，其基本轉錄圖譜在不同哺乳動物中高度相似，并且分布密度相當，這表明，MG在整個哺乳動物進化過程中發(fā)揮著總體相似的功能[16-17]。

1.2 MG的生理功能MG是具有吞噬功能的神經(jīng)膠質細胞，是大腦擾動和神經(jīng)退化過程中抵御病原體的第一道防線，對維持腦內穩(wěn)態(tài)至關重要。生理條件下MG呈現(xiàn)靜息狀態(tài)，形態(tài)為胞體較小、突觸細長的分支狀，具有宿主監(jiān)測、組織修復、維持神經(jīng)元功能等作用，對其他神經(jīng)膠質細胞穩(wěn)態(tài)的維持也有一定作用[18]。MG通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，參與并促進神經(jīng)環(huán)路的成熟及吞噬凋亡的神經(jīng)元來維持神經(jīng)元的生理功能[19]，還對神經(jīng)元的過度激活有抑制作用。Badimon等[20]通過促進CSF-1R消亡制作小鼠MG耗竭模型發(fā)現(xiàn)，模型小鼠對神經(jīng)刺激產(chǎn)生了明顯的高反應性，腹腔注射低于閾值的紅藻氨酸可導致超過90%的小鼠癲癇發(fā)作(對照組僅為11%)。

在CNS受到炎癥損傷等刺激時，MG被迅速激活，表現(xiàn)出胞體增大、胞漿空泡化、突起縮短的“阿米巴樣”改變等活化狀態(tài)，并迅速遷移至損傷部位并發(fā)生細胞增殖?；罨蟮腗G有兩種形態(tài)，包括M1型與M2型，受損部位的MG以不同的激活狀態(tài)存在，并保持在炎癥反應期間改變其功能表型的能力[21]。M1型活化也稱為MG的經(jīng)典活化，是固有免疫的第一道防線，通常發(fā)生于損傷產(chǎn)生最初的幾個小時或幾天內，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-12、一氧化氮合成酶(iNOS)等具有促炎效應的細胞因子被大量分泌，表現(xiàn)為明顯的細胞毒性作用，或許與NLRP3等炎癥小體的激活促進活性Caspase-1產(chǎn)生的機制有關；M2型活化也被稱為MG的替代活化，有M2a、M2b、M2c 3個亞型，分別具有不同的表面標志物及生物功能，釋放的IL-4、IL-10、IL-13和轉化生長因子-β(TGF-β)以及精氨酸酶-1(Arg1)、幾丁質酶3樣蛋白3(YM1/Chi3l3)等在抑制炎癥、組織重塑、血管生成、神經(jīng)保護等方面有積極作用[22]。正常狀態(tài)下，M1/M2型極化水平維持動態(tài)的平衡，而在病理狀態(tài)下，這種平衡將被打破造成組織損傷。但也有研究表明，在受到損傷后，腦內MG并非簡單地極化到M1型或M2型，而是由于周圍復雜的信號級聯(lián)而顯示出混合型[23]。Kim等[24]通過對MG的高通量轉錄組測序(RNA-SEQ)研究也證實混合表型在單細胞水平上的存在，提示MG的極化或許存在更復雜的激活，而其調控機制需要進一步研究。

2 MG在AMD中的作用

2.1 健康眼底的MG視網(wǎng)膜內含有3種類型的膠質細胞，即MG、星形膠質細胞和Müller細胞，在防御病原微生物、啟動炎癥過程和組織修復中共同發(fā)揮作用。視網(wǎng)膜MG(RMG)與MG一樣來源于胚胎時期的卵黃囊，是存在于視網(wǎng)膜內的主要吞噬細胞，數(shù)量占視網(wǎng)膜細胞的0.3%～1.0%，主要存在于內、外叢狀層中，執(zhí)行免疫監(jiān)視、突觸提煉、神經(jīng)營養(yǎng)支持和清除碎片等多種功能，對維持視網(wǎng)膜突觸結構和正常視覺功能有重要作用[25-26]。因損傷而消耗的RMG有兩個外源性補充，包括約85%來自視神經(jīng)中殘留MG由視盤向視網(wǎng)膜的遷移和約15%來自睫狀體/虹膜中的巨噬細胞自周邊視網(wǎng)膜向后極部的填充，重新募集的吞噬細胞在視網(wǎng)膜內環(huán)境的影響下，可繼續(xù)發(fā)揮RMG的功能[27-28]。RMG通過清除代謝產(chǎn)物、病原體、滲出的血清蛋白和細胞碎片，以及產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子和抗炎細胞因子等功能維持視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)，但長期暴露于RMG激活狀態(tài)所分泌的活性氧、促炎細胞因子等物質下的視網(wǎng)膜具有較高的神經(jīng)變性風險[29]。

2.2 AMD病理狀態(tài)下的MG衰老是AMD最重要的危險因素，有研究發(fā)現(xiàn)，衰老狀態(tài)下，RMG表現(xiàn)出明顯的CXCL13、CXCL14等具有促進細胞增殖和趨化功能的因子水平上調，導致RMG密度隨著年齡的增長而增加，對神經(jīng)退行性疾病的易感性增加[30]。由于RMG是卵黃囊來源的長壽細胞，再生能力有限，因此，衰老對RMG本身也可造成功能性的改變，老化的RMG表現(xiàn)出持續(xù)的炎癥反應和吞噬缺陷，對炎癥刺激的反應增強且持續(xù)時間長，對β-淀粉樣蛋白(Aβ)的吞噬能力減弱[31]，成為AMD發(fā)生的重要危險因素；同時，在人類及小鼠中均觀察到隨著年齡增長，激活狀態(tài)的RMG比例逐漸增大，激活的RMG表達更具促炎效應的CD68，導致IL-1β、TNF-α、血管內皮生長因子(VEGF)等分泌增加，進一步造成細胞結構紊亂和CNV的發(fā)生[32-33]。一項對AMD患者與健康人群的血清分析表明，巨噬細胞凋亡抑制因子(AIM)可能參與了AMD的發(fā)病過程，AMD患者血清內的AIM抗原與自身抗體水平較對照組高近2倍，并且當抗AIM ELISA反應性≥0.4時，患AMD的概率增加了18倍，免疫組化結果則顯示，AIM在視網(wǎng)膜中主要表達于RMG[34]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，干性AMD患者眼底表現(xiàn)為drusen、視網(wǎng)膜變性與GA的發(fā)生，均與RMG的激活相關，drusen是位于RPE上或RPE與玻璃膜間的局灶性黃白色細胞外碎片沉積物，是干性AMD患者的典型病理改變[35]，RMG在視網(wǎng)膜下間隙(SRS)的積聚則是drusen的特征性表現(xiàn)，反映了單核細胞向視網(wǎng)膜遷移的增加，或免疫細胞從視網(wǎng)膜清除的失敗，RMG吞噬能力的變化直接導致了drusen在球后部的沉積[36]。Aβ是drusen的主要成分之一，研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠視網(wǎng)膜下注射Aβ-42可通過激活p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路誘導RMG活化和炎癥細胞因子的分泌，導致光感受器細胞凋亡[37]。髓樣細胞觸發(fā)受體2(TREM-2)是清除Aβ-42的關鍵成分，Bhattacharjee等[38]研究發(fā)現(xiàn)，AMD患者RMG中存在明顯的TREM-2缺陷，使其吞噬能力降低，這可能與miRNA-34a表達上調及NF-κB信號通路的激活有關。O’Koren等[39]分別對急性光損傷及RhoP23H/wt基因敲除造成的急性視網(wǎng)膜變性和慢性視網(wǎng)膜變性小鼠模型進行觀察，結果發(fā)現(xiàn)，RMG在SRS迅速募集并附著于RPE頂端，而當使用白喉毒素特征性消耗RMG后，RPE黏附的吞噬細胞數(shù)量顯著減少，這提示，在小鼠視網(wǎng)膜變性模型中SRS是以RMG為主的免疫環(huán)境，也是RMG發(fā)揮免疫效應的主要場所。

濕性AMD也稱為新生血管性AMD，其典型表現(xiàn)為脈絡膜血管侵入視網(wǎng)膜下形成CNV，導致眼底黃斑區(qū)反復的水腫、出血、滲出，RMG在此過程中有重要作用。Wieghofer等[40]使用激光制造實驗性CNV模型，結果顯示，在激光損傷部位出現(xiàn)了明顯的RMG聚集，聚集的RMG表現(xiàn)為細胞體增大、分支減少等活化形態(tài)，同時，在周邊可觀察到單核細胞來源的巨噬細胞的募集。嘌呤代謝異常也被認為是造成眼底病理性血管產(chǎn)生的潛在因素，激光誘導CNV產(chǎn)生后，活化的MG表面嘌呤能受體2(P2)mRNA表達水平顯著升高，而眼內注射其抑制劑PPADS則能顯著影響MG的功能，同時抑制CNV的滲漏[41]。Losenkova等[42]研究發(fā)現(xiàn)，RMG表達P2Y12R、P2Y13R等關鍵性嘌呤受體，通過對自身極端分支和特異性突起的伸縮，與神經(jīng)元胞體、血管形成局部的“嘌呤能連接”，進而協(xié)調控制局部三磷酸腺苷(ATP)和腺苷的水平，在調節(jié)眼內病理性血管生成中發(fā)揮關鍵作用。

2.3 MG極化對AMD的影響RMG的激活幾乎貫穿AMD的病理全程，近年來研究發(fā)現(xiàn)，RMG的不同極化狀態(tài)可能對AMD具有差異性影響。RMG的M1型極化所分泌的TNF-α、IL-1β、IL-18等促炎因子是AMD的重要危險因素，也是早期在Aβ等病理因素刺激下drusen形成的主要原因[43]。視網(wǎng)膜變性小鼠模型中，在視桿細胞快速退行性變的第14～28天內，活化的RMG細胞數(shù)量明顯增多，且以M1型為主，TNF-α、IL-6、CD86、CCL2等因子均顯著上調[44]。

RMG的M1型極化被認為是推動CNV形成的關鍵信號。RMG的M1型/M2型極化狀態(tài)在氧誘導視網(wǎng)膜病變(OIR)的CNV模型中呈明顯的時相性改變，小鼠M1型RMG的激活始于回到常氧環(huán)境的P12，并在P17達到高峰，此間NF-κb-STAT3信號通路被激活，TNF-α、IL-6、IL-1β表達增強，從P17開始M2型極化逐漸占據(jù)優(yōu)勢，IL-4-STAT6-PPAR-γ信號活性開始上調，促炎因子的釋放被抑制，在P20時達到頂峰，與新生血管生長及自發(fā)消退的時相完全一致[45]。RMG對定位于視網(wǎng)膜外層的膽固醇氧化產(chǎn)物7-酮基膽固醇(7KCH)有明顯趨化作用，亞致死濃度的7KCH通過激活NLRP3導致MG迅速極化為促炎的M1狀態(tài)，血管生成因子表達量增加，直接促進了CNV形成[46]。Cao等[47]通過對AMD患者與健康人群尸檢眼檢測發(fā)現(xiàn)，AMD患者M1型巨噬細胞水平明顯高于對照組，M1型/M2型的比值也顯著升高。

2.4 MG在AMD治療中的作用RMG參與AMD的病理機制被揭示后，有研究認為，RMG適度活化具有的視網(wǎng)膜的神經(jīng)保護作用對早期AMD是有益的，但RMG持續(xù)激活釋放的炎癥因子將進一步加重疾病的損傷，RMG的激活既是疾病造成的結果，也是病情進展的推動因素。興奮性毒素誘導的視網(wǎng)膜損傷伴隨著神經(jīng)細胞大量死亡及RMG的聚集和明顯活化，而提前使用PLX5622(CSF-1R抑制劑)消融RMG后的視網(wǎng)膜損傷造成了更多的細胞死亡并且神經(jīng)元存活減少，這提示，反應性RMG對視網(wǎng)膜神經(jīng)元的保護作用[48]；TGF-β在體外有促進MG增殖的作用，被認為是RMG發(fā)育和維持的重要細胞因子之一[49]，Wang等[50]在體內觀察到腺病毒載體(AAV)介導的TGF-β1療法對視網(wǎng)膜變性模型的視錐細胞有明顯保護作用，但在RMG耗竭小鼠上未觀察到相關作用，這提示，RMG可能是TGF-β對視網(wǎng)膜變性發(fā)揮療效的關鍵途徑。阿魏酸是中藥當歸、川芎等的有效成分，對眼底退行性病變、缺血性病變等有良好療效。Sun等[51]研究發(fā)現(xiàn)，RD10視網(wǎng)膜變性模型小鼠的RMG在P25呈明顯的激活狀態(tài)，阿魏酸的應用顯著改善了這種表現(xiàn)，并抑制了TNF-α、IL-1β、CCL2等促炎因子的表達，還通過抑制STAT1的激活和干擾素調節(jié)因子8(IRF-8)的表達改善視網(wǎng)膜變性小鼠的眼底退行性病變程度。Roche等[52]在RD10視網(wǎng)膜變性的小鼠中發(fā)現(xiàn)了甲炔諾酮通過調節(jié)RMG對光感受器有神經(jīng)保護作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)，甲炔諾酮的應用使CX3CL1-CX3CR1的信號在RNA水平上調了1000倍，與其對視網(wǎng)膜外核層的保護作用相一致，而經(jīng)CX3CL1處理后，顯著抑制了RMG促炎性細胞因子的釋放，這提示，CX3CL1-CX3CR1信號通路或許是調節(jié)RMG激活水平與方向并抑制視網(wǎng)膜損傷的關鍵。

近年來，RMG在濕性AMD治療過程中也具有潛在功能，抑制RMG的激活或調節(jié)其極化方向對CNV的治療有積極作用。RMG的M1型極化通常伴隨IL-1β、TNF-α等促炎因子的大量釋放，是眼底病理性血管新生的危險因素?？筕EGF藥物是濕性AMD的一線治療用藥，對挽救患者視力、保護視網(wǎng)膜解剖結構有明顯療效。有研究表明，阿柏西普在小鼠OIR模型中可通過增加RMG分支數(shù)量、減少其在內叢狀層及外核層的聚集等來調節(jié)缺氧過程中的炎癥反應[53]。Jiang等[54]也觀察到小窩蛋白-1(Cav-1)的通透性多肽Cavtratin通過減少MG和巨噬細胞的存活和遷移來抑制CNV。綠茶所含的多酚類物質表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)被報道具有抗氧化、抗血管生成等特性，Xu等[55]研究證實，EGCG前體藥物在小鼠CNV模型中也可通過下調HIF-1α/VEGFR2通路及RMG的M1型極化水平發(fā)揮效應。與前述報道不同，有研究發(fā)現(xiàn)，RMG的M2型極化所表現(xiàn)的抗炎、促進再生作用在一定程度上也促進了CNV的形成。Xu等[56]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素在激光誘導的CNV模型中具有抑制血管增生的能力，可能是通過激活RhoA/ RhoA相關蛋白激酶(ROCK)信號通路，進而調節(jié)巨噬細胞/MG由具有促血管新生功能的M2型向M1型轉化實現(xiàn)的。Cao等[47]對AMD患者的尸檢眼檢測發(fā)現(xiàn)，干性AMD患者玻璃膜M1型炎癥因子明顯升高，而濕性AMD患者的CNV膜則表現(xiàn)為M2型炎癥因子高表達，而其中老年患者M2型表達量高于年輕患者，提示RMG的極化水平受老齡、病程等多種因素影響，其在AMD病理進程中的作用并非單一體現(xiàn)，而平衡RMG M1型/M2型之間的極化水平或許是研究AMD治療方法的新思路。

3 小結

RMG是存在于視網(wǎng)膜內的主要吞噬細胞，執(zhí)行免疫監(jiān)視、清除代謝產(chǎn)物等多種生物學功能，是維持視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)及視功能的關鍵成分。RMG在AMD的發(fā)生發(fā)展過程中也扮演重要角色，早期病理狀態(tài)下RMG迅速反應，其遷移、增殖、激活、極化等均表現(xiàn)出了明顯的特征性改變，對視網(wǎng)膜有一定保護作用，但過度激活造成的炎癥環(huán)境又可成為AMD進展的推動因素。因此，通過RMG途徑治療AMD的具體機制可能與對多種免疫分子及信號通路的調節(jié)有關。RMG的活化與作用在AMD的疾病全程均有明確體現(xiàn)，其M1型/M2型極化間的平衡隨病程反復重建，這提示了未來研究及治療AMD的新方向。