史東沙 綜述,胡志東 審校

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，天津 300052

準(zhǔn)確的血小板計(jì)數(shù)對(duì)于出血和血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、輸血決策和惡性血液病的診斷至關(guān)重要[1]。目前，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀用于血小板計(jì)數(shù)檢測(cè)的準(zhǔn)確性仍然飽受爭(zhēng)議[2]。在非常低值血小板計(jì)數(shù)中、存在類似血小板大小粒子干擾的標(biāo)本及存在異常血小板聚集的標(biāo)本中，血小板計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性受到挑戰(zhàn)。為解決這些問題，血小板特異性單抗(抗CD61、抗CD41)標(biāo)記技術(shù)及多參數(shù)的流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展起來(lái)，然而由于價(jià)格昂貴，操作繁瑣并沒有應(yīng)用到臨床，而是發(fā)展為了國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)推薦的國(guó)際參考方法(IRM)[3]。第二代的光學(xué)法血小板計(jì)數(shù)(PLT-O)可以準(zhǔn)確檢測(cè)大部分的血標(biāo)本，然而一些低值血小板標(biāo)本及含有巨大血小板標(biāo)本中，該系統(tǒng)對(duì)于血小板計(jì)數(shù)檢測(cè)依然不準(zhǔn)確[4]?；谝陨显?，熒光血小板(PLT-F)通道應(yīng)運(yùn)而生。通過PLT-F通道計(jì)數(shù)血小板時(shí)，血小板用熒光惡嗪染料染色，這種染料與富含核酸的血小板細(xì)胞器(如核糖體和線粒體)特異性結(jié)合，然后用半導(dǎo)體激光束照射血小板，將血小板的前向散射光和側(cè)向熒光強(qiáng)度繪制在二維散射圖上，進(jìn)行血小板的鑒別和計(jì)數(shù)[5]。有關(guān)影響血小板計(jì)數(shù)檢測(cè)準(zhǔn)確性的因素主要包括以下兩個(gè)方面。(1)血小板數(shù)量的異常，極低值血小板計(jì)數(shù)及異常高值血小板計(jì)數(shù)均會(huì)對(duì)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性提出挑戰(zhàn)；(2)各種干擾因素的存在，其中包括血小板計(jì)數(shù)假性增加的幾種情況：紅細(xì)胞碎片、白細(xì)胞胞質(zhì)碎片、冷球蛋白、脂質(zhì)及細(xì)菌/真菌干擾；血小板計(jì)數(shù)假性減少的情況：大血小板、血小板聚集和血小板衛(wèi)星現(xiàn)象。本文將對(duì)PLT-F通道在異常血小板計(jì)數(shù)檢測(cè)中的應(yīng)用做一綜述，以指導(dǎo)臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)得更為準(zhǔn)確的血小板計(jì)數(shù)。

1 血小板數(shù)量異常

1.1PLT-F通道用于低值血小板計(jì)數(shù)的檢測(cè) PLT-F通道對(duì)于低值血小板計(jì)數(shù)的檢測(cè)是非常出色的，同時(shí)測(cè)量熒光和散射光使PLT-F通道能更精準(zhǔn)的識(shí)別血小板，從而得到更準(zhǔn)確的血小板計(jì)數(shù)[6]。激光共聚焦顯微鏡下，PLT-F通道結(jié)果與參考單抗抗CD61和抗CD41的著色特異性高度吻合，而該試劑對(duì)血小板膜和紅細(xì)胞碎片的薄膜均為弱著色，這一點(diǎn)明顯優(yōu)于PLT-O通道[4]。PLT-F通道的分析標(biāo)本量約為常規(guī)方法的5倍，即使血小板計(jì)數(shù)較低的標(biāo)本，也可獲得高精度的數(shù)據(jù)[5]。PLT-F通道計(jì)數(shù)血小板的基本性能在批內(nèi)重復(fù)性、線性和相關(guān)性方面均令人滿意，與IRM的相關(guān)性也非常高(r>0.99)。且PLT-F通道在確定患者是否需要輸注血小板方面效果是出色的，PLT-F通道在檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)為10×109/L和20×109/L的靈敏度分別為95.8%和98.2%，遠(yuǎn)高于PLT-I通道[7-8]。TANTANATE等[9]報(bào)道在急性白血病患者中相對(duì)于PLT-I通道及貝克曼庫(kù)爾特LH780血細(xì)胞分析儀，PLT-F通道在低值血小板計(jì)數(shù)檢測(cè)中的平均偏差最小，為 2×109/L。一些研究證實(shí)相對(duì)PLT-I通道，PLT-F通道的精密度和準(zhǔn)確度均有提高[10-11]；也有研究報(bào)道，PLT-F通道表現(xiàn)出可接受的不精密度(<4%),尤其是在低值標(biāo)本中，但是相比于PLT-I通道并沒有顯著降低[7]。多項(xiàng)研究評(píng)估了PLT-F通道在準(zhǔn)確檢測(cè)低值血小板方面的性能[3,11- 12]，這些研究報(bào)道，PLT-F通道是一種可靠的低值血小板計(jì)數(shù)方法，是血小板減少患者合理選擇血小板輸注的首選方法。因此，對(duì)于血小板減少患者，尤其是血小板計(jì)數(shù)在血小板輸注閾值附近的患者，推薦采用PLT-F通道來(lái)檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)。

1.2PLT-F通道用于異常高值血小板計(jì)數(shù)的檢測(cè) 血小板計(jì)數(shù)連續(xù)兩次大于450×109/L時(shí)通常被認(rèn)為是血小板增多，血小板增多是醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常見的現(xiàn)象[13]。準(zhǔn)確檢測(cè)血小板增多對(duì)惡性血液病(如原發(fā)性血小板增多癥)的診斷和出血及血栓風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估也很重要[14]。而PLT-F通道在血小板增多中的性能仍存在爭(zhēng)議。SUN等[15]研究顯示在血小板增多方面，PLT-F通道(r=0.831)與IRM的相關(guān)性低于PLT-I通道(r=0.960)，PLT-F和PLT-I通道數(shù)值均呈現(xiàn)低于IRM數(shù)值的趨勢(shì)，而TANTANATE等[16]發(fā)現(xiàn)，對(duì)于有血小板增多的標(biāo)本，PLT-F與IRM的符合率為98%，高于PLT-I與IRM的符合率(89%) 。但二者的研究均顯示在檢測(cè)高值血小板計(jì)數(shù)方面，PLT-F通道的特異度高于PLT-I通道，而靈敏度低于PLT-I通道。而文獻(xiàn)[11]評(píng)估顯示，PLT-F通道在檢測(cè)高值血小板計(jì)數(shù)方面，靈敏度和特異度均高于PLT-I通道，且二者檢測(cè)的血小板計(jì)數(shù)均高于IRM檢測(cè)的血小板計(jì)數(shù)。故PLT-F通道在血小板增多標(biāo)本中的作用并沒有在血小板減少中那么優(yōu)越，目前研究比較一致的是其檢測(cè)出血小板增多的特異度優(yōu)于PLT-I通道，而靈敏度是否優(yōu)于PLT-I通道仍有待更多的臨床研究證實(shí)，PLT-F通道檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)高于還是低于IRM檢測(cè)結(jié)果的說(shuō)法也不一致，故臨床實(shí)踐中，對(duì)于血小板增多標(biāo)本，是否采用PLT-F通道復(fù)查有待商榷，而更應(yīng)該做的是血涂片染色鏡檢，排除干擾因素導(dǎo)致假性血小板增多的可能。

2 各種干擾因素

2.1血小板計(jì)數(shù)假性增加

2.1.1紅細(xì)胞碎片和小紅細(xì)胞干擾 PLT-F通道采用熒光惡嗪染料對(duì)RNA染色結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行分析，血小板的熒光強(qiáng)度較高，可與小紅細(xì)胞和紅細(xì)胞碎片區(qū)分開來(lái)。在平均紅細(xì)胞體積小于65 fL的小紅細(xì)胞標(biāo)本中，PLT-F通道仍能得出準(zhǔn)確的血小板計(jì)數(shù)[17]。人工制備破碎的紅細(xì)胞，按比例加入純富血小板血漿上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果顯示在混有紅細(xì)胞碎片的標(biāo)本中，PLT-F通道仍可以得到較為準(zhǔn)確的血小板計(jì)數(shù)，明顯優(yōu)于PLT-I和PLT-O 通道[4]。對(duì)于燒傷患者血小板計(jì)數(shù)變化的監(jiān)測(cè)顯示，在燒傷發(fā)生的前3天，由于紅細(xì)胞碎片的存在，PLT-I和PLT-O通道檢測(cè)的血小板計(jì)數(shù)與IRM檢測(cè)的結(jié)果有很大差別，而PLT-F通道檢測(cè)到的血小板計(jì)數(shù)與IRM檢測(cè)的結(jié)果始終一致[2]。在富含小紅細(xì)胞和紅細(xì)胞碎片的珠蛋白生成障礙性貧血患者中，PLT-F通道也與IRM有良好的相關(guān)性[16]。另外有多篇病例報(bào)告顯示，在臨床實(shí)踐中，PLT-F通道可有效糾正紅細(xì)胞碎片和小紅細(xì)胞的干擾，在正常紅細(xì)胞散點(diǎn)的下方出現(xiàn)弱側(cè)向散射光和較強(qiáng)前向散射光的碎片紅細(xì)胞散點(diǎn)區(qū)域，其中包括珠蛋白生成障礙性貧血患者極小紅細(xì)胞干擾,以及彌散性血管內(nèi)凝血患者、骨髓纖維化患者紅細(xì)胞碎片干擾[18-20]。故對(duì)于存在小紅細(xì)胞和紅細(xì)胞碎片的標(biāo)本，PLT-F可以作為反射試驗(yàn)，以獲得相對(duì)準(zhǔn)確的血小板計(jì)數(shù)。

2.1.2有核細(xì)胞胞質(zhì)碎片 除了紅細(xì)胞外，有研究報(bào)道一些異常細(xì)胞的胞質(zhì)碎片也會(huì)導(dǎo)致血小板計(jì)數(shù)假性增加，這些幾乎都是由原始細(xì)胞或淋巴瘤細(xì)胞產(chǎn)生的小碎片[21]。類似于紅細(xì)胞碎片，當(dāng)大量出現(xiàn)時(shí)，它們有時(shí)可以使血小板計(jì)數(shù)假性增加。單核細(xì)胞白血病和彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤是這種罕見干擾最常見的原因[22]。急性白血病時(shí)，原始細(xì)胞的存在是干擾阻抗法血小板計(jì)數(shù)的獨(dú)立因素，這種干擾可能與原始細(xì)胞產(chǎn)生的胞質(zhì)碎片有關(guān)，而PLT-F通道檢測(cè)的血小板計(jì)數(shù)更接近IRM的結(jié)果[9]。然而值得注意的是在白血病患者標(biāo)本中，原始細(xì)胞胞質(zhì)碎片的干擾導(dǎo)致的結(jié)果很少是血小板計(jì)數(shù)增多，更常見的情況是，它們掩蓋或部分糾正了血小板計(jì)數(shù)減少，從而延遲了血小板輸注。當(dāng)有出血，但血小板計(jì)數(shù)沒有下降時(shí)，臨床和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)生均應(yīng)警惕這種假設(shè)的存在。TANAKA等[5]對(duì)兩例存在白細(xì)胞碎片的白血病病例分析顯示：在PLT-F通道散點(diǎn)圖中，白細(xì)胞碎片在高熒光強(qiáng)度的未成熟血小板 (IPF)區(qū)域上方被視為一個(gè)異常的簇，該簇被識(shí)別為白細(xì)胞，IPF區(qū)未被侵入。PLT-F通道檢測(cè)的血小板計(jì)數(shù)略低于IRM的結(jié)果，并沒有發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞碎片的對(duì)血小板計(jì)數(shù)的影響。XN分析儀的結(jié)果通常產(chǎn)生其他報(bào)警信息(如懷疑大血小板或血小板團(tuán))或有關(guān)設(shè)備無(wú)法產(chǎn)生擬合曲線。在阻抗和光學(xué)衍射技術(shù)中，血小板計(jì)數(shù)都是扭曲的，PLT-F通道測(cè)量更準(zhǔn)確[23]。故對(duì)于懷疑存在有核細(xì)胞胞質(zhì)碎片干擾標(biāo)本，PLT-F通道是合適檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)的方法。

2.1.3其他 冷球蛋白會(huì)干擾血細(xì)胞計(jì)數(shù)，并且它們的干擾是大小相關(guān)的，小的沉淀物會(huì)誘發(fā)假性血小板增多或掩蓋血小板減少[24-25]。PLT-F通道采用了對(duì)血小板RNA染色更精準(zhǔn)的熒光染料，可以有效對(duì)抗冷球蛋白的干擾，得出正確的血小板計(jì)數(shù)[23]。PLT-F通道用于測(cè)定脂血標(biāo)本中的血小板計(jì)數(shù)是可靠的。在含不同水平血小板的非脂血全血標(biāo)本中各加入400 μL脂肪乳置換等量血漿上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果顯示僅PLT-F通道在高、中、低組中均符合預(yù)設(shè)的均值偏倚、比例偏倚和截距的95%CI標(biāo)準(zhǔn)。與PLT-I或PLT-O通道相比，PLT-F通道能更準(zhǔn)確地反映脂血標(biāo)本的真實(shí)血小板計(jì)數(shù)[26]。故對(duì)于脂血標(biāo)本及懷疑冷球蛋白干擾標(biāo)本推薦采用PLT-F通道計(jì)數(shù)血小板。由于本身比較罕見，有關(guān)細(xì)菌、真菌干擾對(duì)PLT-F通道的影響的鮮有報(bào)道。

2.2血小板計(jì)數(shù)假性減少

2.2.1大血小板 無(wú)論是否存在血小板減少癥(骨髓增生性腫瘤、骨髓增生異常綜合征、遺傳性血小板疾病和/或血小板減少癥、免疫性血小板減少癥等)，在各種情況下均可發(fā)現(xiàn)大血小板甚至巨血小板，并常常導(dǎo)致血小板計(jì)數(shù)被低估，甚至干擾白細(xì)胞計(jì)數(shù)[23,27]。它們的檢測(cè)對(duì)于糾正血小板計(jì)數(shù)和指導(dǎo)原發(fā)性血小板減少癥的診斷具有重要意義。相比于PLT-I和PLT-O通道，PLT-F通道可以通過特異性染色血小板內(nèi)RNA更精準(zhǔn)的識(shí)別大血小板，從而得出更準(zhǔn)確的血小板計(jì)數(shù)[23]。在PLT-F通道的血小板散點(diǎn)圖上，大血小板常常出現(xiàn)在正常血小板的右上方的綠色區(qū)域，被識(shí)別為IPF，可以和紅細(xì)胞和白細(xì)胞明顯的區(qū)分開來(lái)[3]。在存在大血小板的標(biāo)本中，PLT-F通道與手工法有較好的一致性[28]。大血小板存在時(shí)，XN分析儀通常會(huì)有“大血小板”的報(bào)警提示，同時(shí)血小板直方圖會(huì)出現(xiàn)翹尾現(xiàn)象，應(yīng)提高警惕，并及時(shí)采用PLT-F通道進(jìn)行復(fù)測(cè)。

2.2.2乙二胺四乙酸(EDTA)誘導(dǎo)的血小板聚集及血小板衛(wèi)星現(xiàn)象 EDTA誘導(dǎo)的血小板聚集在臨床并不少見，然而直至2020年仍有病例報(bào)道由于EDTA誘導(dǎo)的假性血小板減少導(dǎo)致的不良臨床后果[29-30]，其中包括新型冠狀病毒感染患者EDTA誘導(dǎo)血小板假性減少導(dǎo)致的不必要的血小板輸注[31]。PLT-F通道在血小板聚集的識(shí)別和處理方面的價(jià)值均有報(bào)道。LUNDE等[32]報(bào)道，PLT-F通道用于鑒定EDTA誘導(dǎo)的假性血小板減少的診斷準(zhǔn)確性非常好，可有效識(shí)別血小板聚集，明顯優(yōu)于WDF和WNR通道。 LARDINOIS等[33]最近有關(guān)1例多種抗凝劑聚集的病例報(bào)道認(rèn)為，PLT-F、PLT-O通道和IRM可使聚集物部分分離，因而檢測(cè)得到的血小板計(jì)數(shù)的最高，而阻抗法是最容易導(dǎo)致血小板聚集的方法?？紤]到IRM的技術(shù)和時(shí)間成本較高，PLT-O通道的變異性較大，熒光血小板計(jì)數(shù)是最有用的二線技術(shù)。光學(xué)血小板計(jì)數(shù)可以使EDTA誘導(dǎo)血小板聚集現(xiàn)象部分解離這一現(xiàn)象也在有些研究中報(bào)道，例如Mindray SF-cube平臺(tái)上加入渦旋技術(shù)后采用PLT-O通道可以有效地糾正EDTA誘導(dǎo)的血小板聚集，甚至提出EDTA誘導(dǎo)的血小板聚集可能不再需要另一種抗凝劑[34-35]。盡管如此，更換抗凝劑如檸檬酸鈉或肝素采血管仍是目前臨床解決這種現(xiàn)象最常用的方法[36]，其他報(bào)道的方法包括渦旋混勻[37]，機(jī)器旁采血立即上機(jī)檢測(cè)[38]，37 ℃保溫上機(jī)檢測(cè)或者是標(biāo)本中加入阿米卡星、氯化鈣、抗血小板藥物、疊氮化鉀、卡那霉素或其他氨基糖苷[23,39-41]。血小板衛(wèi)星現(xiàn)象由于臨床比較罕見，有關(guān)其對(duì)PLT-F通道的影響的鮮有報(bào)道。

綜上所述，在低值血小板計(jì)數(shù)檢測(cè)和血小板輸注指導(dǎo)方面，PLT-F通道表現(xiàn)出了出色的性能，且可有效糾正紅細(xì)胞碎片、有核細(xì)胞胞質(zhì)碎片、冷球蛋白、脂質(zhì)和大血小板對(duì)血小板計(jì)數(shù)的干擾。因此，PLT-F法血小板計(jì)數(shù)有助于形成更合理的臨床決策，并有助于血液學(xué)或臨床實(shí)驗(yàn)室的高效運(yùn)作[5]。但與常規(guī)阻抗法相比，PLT-F通道需要更大的標(biāo)本體積和更長(zhǎng)的計(jì)數(shù)時(shí)間，以及更高的熒光細(xì)胞染料成本。因此，不能將PLT-F通道作為每種情況的初始試驗(yàn)。它更適用于作為一個(gè)反射試驗(yàn)用于懷疑阻抗法計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確的標(biāo)本。另外由于RNA在室溫放置下會(huì)降解，因此 PLT-F 通道更適合于新鮮全血的應(yīng)用[11]。對(duì)于血小板增多標(biāo)本，PLT-F通道并沒有表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。而EDTA誘導(dǎo)的血小板聚集現(xiàn)象仍是目前影響血細(xì)胞分析儀血小板計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性的一大挑戰(zhàn)，渦旋混勻結(jié)合熒光流式血小板計(jì)數(shù)或許是未來(lái)血細(xì)胞分析儀的破局方向。