李 潔,李美芳,駱 莉,張麗霞,朱曉林

河北省邯鄲市第一醫(yī)院：1.腫瘤內(nèi)科；2.康復(fù)醫(yī)學(xué)科，河北邯鄲 056000

食管鱗狀細胞癌(ESCC)是發(fā)生于食道且病理類型為鱗狀細胞癌的惡性腫瘤，約占臨床中所有食道癌類型的90%，ESCC患者常表現(xiàn)為吞咽困難，且隨著病情加重還有可能出現(xiàn)病灶轉(zhuǎn)移[1]。有研究顯示在腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移過程中，由于血管生成過程作為能夠為腫瘤生長提供所需要的營養(yǎng)，因此也是造成腫瘤不斷復(fù)發(fā)及病灶持續(xù)轉(zhuǎn)移的重要因素[2]。而血管生成擬態(tài)(VM)作為不同于傳統(tǒng)的腫瘤新生血管，目前臨床證實其與多種因子如血管內(nèi)皮生長因子、遷移誘導(dǎo)蛋白7等具有密切聯(lián)系[3-4]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)作為人體腫瘤組織及體液中存在的一種長度大于200 bp的核苷酸分子，眾多研究表明其與多數(shù)惡性腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移具有密切聯(lián)系[5-6]。其中腫瘤抑制候選基因7(TUSC7)在ESCC患者中呈現(xiàn)低表達從而促進細胞凋亡，而尿路上皮癌相關(guān)基因1(UCA1)在ESCC患者中的特異性表達也同樣提示其與腫瘤的發(fā)展存在密切聯(lián)系[7-8]。但兩者與ESCC患者發(fā)生VM之間的關(guān)系暫未有研究闡明，因此本研究通過選取133例ESCC患者，并采用實時熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(qPCR)檢測其血清lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1，進一步分析兩者與VM之間的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2020年3月至2021年12月經(jīng)本院確診為ESCC的133例患者，按照是否形成VM將其分為VM組76例及無VM組57例，其中VM組男37例，女39例，年齡32～64歲，平均(51.12±7.74)歲；無VM組中男25例，女32例，年齡33～65歲，平均(51.63±7.52)歲，兩組基線資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有納入研究的患者對本研究所采取的檢測方式及研究目的均獲得知情權(quán)，并簽署知情同意書，本研究所獲取的臨床資料及一般信息均采取保密措施，不做其他用途。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所選取的ESCC患者符合文獻[9]的ESCC診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)臨床資料及一般信息完整；(3)簽署知情同意書；(4)依從性較高，能夠配合研究進行。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有精神類疾??；(2)研究過程中私自服用藥物導(dǎo)致研究結(jié)果產(chǎn)生偏差；(3)伴有肝、腎、心功能嚴(yán)重障礙；(4)伴有先天性免疫功能缺陷。

1.2方法

1.2.1qPCR檢測血清lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1表達 lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1表達均采用qPCR進行檢測，具體操作如下，兩組患者均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)采取外周血5 mL，放入離心機(美國Themor公司)中，以3 500 r/min(離心半徑：13.5 cm)離心10 min，離心完畢后分離上層血清并放置于-70 ℃的冰箱中保存以待檢測。取待測血清并采用Trizol法提取血清總RNA，在每1 mL的Trizol試劑裂解樣中加入0.2 mL氯仿(成都市科龍化工試劑廠)，并劇烈振蕩15 s后在15～30 ℃的條件下孵育3 min，4 ℃下12 000 r/min離心15 min；離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層及無色水相上層； 將水相上層轉(zhuǎn)移到干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15～30 ℃孵育10 min后，于4 ℃下12 000 r/min 離心10 min；移去上清液，每1 mLTrizol試劑裂解的樣品中加入至少1 mL的75%乙醇(成都市科龍化工試劑廠)混勻后，4 ℃下7 000 r/min離心5 min；小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5～10 min；溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40 μL用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80 ℃待用；在4 ℃對其完整度及純度進行檢驗，RNA溶液的A260/A280即為RNA純度，比值1.8～2.1；在條件為42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min下進行逆轉(zhuǎn)錄并在4 ℃下進行保存；采用3 g/dL瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物，并用花青素溴化乙錠染色，采用凝膠成像儀獲取Ct值，其變化以ΔCt表示；以18 s作為內(nèi)參，序列為上游5′-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3′，下游5′-TAG TAG CGACGGGCGGTGTG-3′；lncRNA-UCA1序列為上游5′-CTCTCCATTGGGTTCACCATTC-3′，下游5′-GCGGCAGGTCTTAAGAGATGAG-3′；lncRNA-TUSC7序列為上游5′-CATACAGAAGGCACCTCAA-3′，下游5′-GTCAGAGCA GTCACACTT-3′，采用2-ΔΔCt法計算lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1的相對表達水平。

1.2.2CD34聯(lián)合PAS染色判定VM 取所有ESCC患者腫瘤標(biāo)本并按照流程制成石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化后采用CD34染色，在高壓鍋中放入檸檬酸鹽抗原修復(fù)液中進行5 min修復(fù)過程，待冷卻后采用PBS洗滌3次，放入3%H2O2中孵育30 min后PBS洗滌3次，再次重復(fù)以上操作；VE-cadherin抗體孵育過夜后PBS洗滌3次；加入DAB顯色后蒸餾水終止染色，并在PASI液下氧化10 min，蒸餾水沖洗后PASⅡ避光染色10 min，蘇木素復(fù)染后中性樹膠封片；以管腔壁CD34染色陰性，內(nèi)見紅細胞，并在外層可觀察到PAS陽性物質(zhì)圍繞則可判定為VM陽性。

1.3觀察指標(biāo) (1)對比兩組患者血清合lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1表達差異；(2)分別分析lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1與ESCC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系；(3)Spearman相關(guān)系數(shù)分析lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1表達與VM生成之間的相關(guān)性；(4)受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析聯(lián)合lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1檢測對ESCC患者形成VM的預(yù)測效能。

2 結(jié) 果

2.1對比兩組患者血清lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1表達差異 相比于無VM組，VM組患者lncRNA-TUSC7表達顯著降低，而lncRNA-UCA1表達顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者血清lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1表達比較

2.2分析lncRNA-TUSC7與ESCC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 lncRNA-TUSC7與ESCC患者腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及是否發(fā)生VM具有密切聯(lián)系(均P<0.05)，見表2、圖1。

表2 lncRNA-TUSC7與ESCC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

圖1 lncRNA-TUSC7與ESCC患者臨床病理參數(shù)回歸森林圖

2.3分析lncRNA-UCA1與ESCC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 lncRNA-UCA1與ESCC患者腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、浸潤程度及是否發(fā)生VM具有密切聯(lián)系(均P<0.05)。見表3、圖2。

圖2 lncRNA-UCA1與ESCC患者臨床病理參數(shù)回歸森林圖

表3 lncRNA-UCA1與ESCC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

2.4分析lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1表達與VM生成之間的關(guān)系 Spearmam相關(guān)系數(shù)顯示，lncRNA-TUSC7與VM生成之間呈負相關(guān)(r=-0.782，P<0.001)，而lncRNA-UCA1與VM生成之間呈正相關(guān)(r=0.766,P<0.001)。

2.5分析lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1聯(lián)合檢測對VM生成的診斷價值 ROC曲線顯示lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1聯(lián)合檢測的曲線下面積(AUC)顯著高于單一檢測(Z=2.428，P<0.05)，且具有較高的靈敏度與特異度，見表4、圖3。

圖3 ROC曲線分析lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1聯(lián)合檢測對VM生成的診斷價值

表4 各指標(biāo)診斷效能

3 討 論

ESCC作為一種惡性且伴有侵襲性的腫瘤疾病，臨床上可通過化療、放療、手術(shù)等多種方式進行治療，但由于腫瘤細胞繁殖速度較快，因此極易發(fā)生腫瘤遠處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者的生存預(yù)后情況較差[10]。越來越多的研究表明，腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移與血管生成之間具有密切聯(lián)系，而VM作為一種血液供應(yīng)模式，其不依賴于內(nèi)皮細胞且與腫瘤細胞惡性程度之間具有重要關(guān)系，提示VM可能參與ESCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，因此通過對有效指標(biāo)進行檢測并預(yù)防VM對改善ESCC患者的預(yù)后生存具有重要意義[11]。由于VM形成過程有多種因子參與，但目前臨床上對VM的發(fā)病機制尚未形成統(tǒng)一定論，且單一因子也不能完全解釋VM發(fā)病機制，因此探討相關(guān)因子參與VM形成過程，能夠為臨床診療、改善ESCC患者預(yù)后提供新的理論依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，lncRNA-TUSC7在VM患者體內(nèi)呈現(xiàn)低表達，且lncRNA-TUSC7與VM生成之間呈負相關(guān)(r=-0.782，P<0.001)?，F(xiàn)如今越來越多的研究表明，lncRNAs能夠調(diào)控上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化從而參與腫瘤的發(fā)展過程，并促進腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，lncRNA-TUSC7作為近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的抑癌基因，在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)低表達[12]。對其促進ESCC發(fā)展及VM形成的機制進行猜測后筆者認(rèn)為，lncRNA-TUSC7能夠通過與miR-211、miR-10a等發(fā)生相互作用，從而調(diào)控上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進程，使上皮細胞失去與基底膜的連接，從而獲得更高的遷移、侵襲率，促使VM的形成及惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[13]。趙珂等[14]報道基礎(chǔ)研究中也同樣表明，敲低lncRNA-TUSC7后可導(dǎo)致E-cadherin蛋白表達降低，Vimention蛋白表達升高，進一步提高細胞遷移及侵襲率，指出過表達lncRNA-TUSC7對ESCC具有逆轉(zhuǎn)作用。而本研究還顯示lncRNA-UCA1在VM患者血清呈高表達，且lncRNA-UCA1與VM生成之間呈正相關(guān)(r=0.766,P<0.001)。lncRNA-UCA1作為由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成的長度為2 314 bp染色體，隨著眾多學(xué)者研究的不斷深入，指出其與乳腺癌、膀胱癌、胃癌等多種惡性腫瘤的發(fā)展具有密切關(guān)系[15]。lncRNA-UCA1作為一種致癌基因，可通過調(diào)控Wnt、AKT等多種通路促進腫瘤細胞的增殖，侵襲，并在此過程中逐漸生成VM，另有學(xué)者在研究肝癌中的lncRNA-UCA1表達時也同樣表明，lncRNA-UCA1可產(chǎn)生“海綿樣”作用，從而抑制miR-214的表達，升高Snail2蛋白活性，促進肝癌中的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用，與lncRNA-TUSC7功能類似[16]。通過分別分析lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1與ESCC不同病理參數(shù)特征也同樣可以表明，以上兩種血清指標(biāo)均與臨床分期、分化程度、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有密切聯(lián)系，其中臨床分期越高越有可能發(fā)生遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，疾病嚴(yán)重程度也越高，而分化程度越低提示細胞惡性程度越高，因此lncRNA-TUSC7可通過降低表達上調(diào)E-cadherin蛋白表達，并通過僅競爭性調(diào)控EPHA4進一步促進ESCC細胞增殖、侵襲，而lncRNA-UCA1通過上調(diào)表達調(diào)控Wnt等通路促進腫瘤增殖，兩者共同發(fā)揮調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，進一步促進疾病發(fā)展，引起ESCC臨床病理參數(shù)發(fā)生變化[17-18]。

此外隨著lncRNA作為腫瘤標(biāo)志物的出現(xiàn)，其在機體的表達變化早于其他受體、蛋白，因此對多種腫瘤的早期診斷具有重要意義，本研究ROC曲線顯示，lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1聯(lián)合檢測的AUC顯著高于單一檢測(Z=2.428，P<0.05)，且具有較高的靈敏度與特異度，說明ESCC患者lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1的表達對判斷VM生成及疾病發(fā)展具有顯著優(yōu)勢。但因本研究為小樣本，因此缺乏一定的臨床指導(dǎo)意義，因此可在下一步研究中進一步擴大樣本量，為lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1指導(dǎo)ESCC診療提供更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)睦碚撘罁?jù)。

綜上所述lncRNA-TUSC7與ESCC發(fā)生VM呈負相關(guān)，且lncRNA-UCA1與ESCC發(fā)生VM呈正相關(guān)，聯(lián)合監(jiān)測能夠有效提高ESCC患者合并VM的檢出率，對早診斷、早預(yù)防奠定了有效的生物標(biāo)志物基礎(chǔ)，同時lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1在ESCC合并VM患者中的特異性表達也為日后研發(fā)新的治療方式提供了潛在的靶點方向，在預(yù)防及治療方面均具有較為深遠的影響。